Identification de nouveaux gènes associés à la production d&#39;alginate dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Utilisation de Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenèse Mariner Transposon médiation

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole en utilisant la mini-himar1 marin mutagenèse de transposon médiation pour générer une bibliothèque de mutants d'insertion à haute densité à l'écran, isoler et d'identifier de nouveaux régulateurs d'alginate dans le prototype Pseudomonas aeruginosa souche PAO1.

Résumé

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie à Gram négatif de l'environnement avec des capacités métaboliques polyvalents. P. aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste qui établit des infections pulmonaires chroniques chez les patients atteints de fibrose kystique (FK). La surproduction d'un polysaccharide capsulaire appelé alginate, également connu sous le nom mucoidy, favorise la formation de biofilms mucoïdes qui sont plus résistants que les cellules planctoniques antibiotique et à la chimiothérapie défenses de l'hôte. En outre, la conversion de la non mucoïde au phénotype mucoïde est un marqueur clinique pour le début de l'infection chronique à CF. Surproduction alginate par P. aeruginosa est un processus endergonic qui impose lourdement énergie cellulaire. Par conséquent, la production d'alginate est très réglementé dans P. aeruginosa. Afin de mieux comprendre la régulation de l'alginate, nous décrivons un protocole à l'aide du mini-transposon himar1 mutagenèse pour l'identification de nouveau régulateur d'alginates dans une souche PAO1 prototype. La procédure se compose de deux étapes de base. Tout d'abord, nous avons transféré la mini-himar1 transposon (PFA) de l'hôte E. coli dans SM10/λpir destinataire P. aeruginosa PAO1 par conjugaison biparentale pour créer une bibliothèque de mutants d'insertion à haute densité, qui ont été sélectionnés sur des plaques de gélose Pseudomonas d'isolation additionné de gentamycine. En second lieu, nous avons criblé et isolé les colonies mucoïdes pour mapper le site d'insertion par PCR inverse en utilisant des amorces d'ADN pointant vers l'extérieur à partir de la cassette de la gentamycine et de séquençage de l'ADN. En utilisant ce protocole, nous avons identifié deux nouveaux régulateurs d'alginate, MUCE (PA4033) et kinB (PA5484), à souche PAO1 avec un type sauvage Muca codant pour le facteur anti-sigma Muca pour le régulateur de l'alginate de maître ALGU (ALGT, σ ²²⁾ . Ce protocole de mutagenèse à haut débit peut être modifié pour l'identification d'autres gènes liés à la virulence causant le changement dans la colomorphologie ny.

Introduction

La capacité de la opportuniste, agent pathogène Gram négatif Pseudomonas aeruginosa à la surproduction de l'alginate est un facteur majeur dans sa capacité à établir un film biologique. La surproduction d'alginate est un phénotype souvent dénommé mucoidy. L'isolement des colonies mucoïdes de crachats de personnes atteintes de fibrose kystique (FK) est indicative d'une infection chronique, et est directement associée à une baisse générale de la santé du patient ^1. Actuellement, il est entendu que la régulation de la production et de l'alginate dans P. aeruginosa se ​​produit principalement à deux opérons. Le premier est l'opéron de biosynthèse de l'alginate, qui contient 12 gènes (ALGD - alg8 - alg44 - algK - Alge - algG - Algx - algL - ALGI - algJ - algF - algA) qui sont responsables de la synthèse et de l'exportation du polymère d'alginate dans le périplasme de la environme extracellulairent ^2-5. La deuxième opéron est un groupe de gènes en commençant par le facteur sigma alternatif ALGU / T et en continuant avec Muca, mucB, et mucD. ALGU / T est un régulateur positif, tandis que mucAB-D sont classés en tant que régulateurs négatifs de la production d'alginate ^6-8. En outre, les régulateurs de la transcription, tels que ALGB, AlgQ, ALGr, et rpoN, ainsi que post-transcriptionnel et la modification post-traductionnelle par le contrôle de la répression catabolique, l'activité kinase (KinB) et la protéolyse intramembranaire, se sont également avérés être impliqués dans l'alginate réglementation ^9-14.

Le vecteur de transposon mini-himar1 appelé PFA a été créé à l'origine dans le laboratoire du Dr Mekalanos à Harvard Medical School ^15. Le plasmide PFA est constitué d'un élément transposable flanqué de deux répétitions inversées de 27 pb et une cassette de résistance à la gentamycine dans le milieu (aacC1: 534 pb), un gène codant pour la hyperactive transposase mariner ^16, et un codage de β-lactamase de gène (bla) (figure 1). L'information de séquence pour les éléments transposables du PFA est disponible au numéro d'accession GenBank: DQ366300 ^13. Dans PFA, il existe un site de clonage multiple (MCS) derrière le gène aacC1 qui est utilisé pour l'identification du site d'insertion chromosomique en utilisant une PCR inverse. Un avantage majeur à l'utilisation du transposon mini-himar1 a pas de facteurs de l'hôte spécifiques sont nécessaires pour la transposition (mutagenèse). En outre, il existe une grande abondance de sites d'insertion de dinucléotides TA trouvés dans le génome de P. aeruginosa. Par exemple, AT sites d'insertion dinucléotide se produit 94 404 et 100 229 fois dans le PAO1 (6264404 bps, numéro d'accession GenBank NC_002516.2) et PA14 (6537648 bps; numéro d'accès GenBank NC_008463) génomes, respectivement. En raison de l'abondance de dinucléotide TA dans le génome, d'un mini-himar1 Transposon peut provoquer la densité élevée et une mutagénèse aléatoire, ce qui est particulièrement appropriée pour l'analyse des gènes de virulence et des gènes qui sont fortement réglementés. Théoriquement, le transposon mini-himar1 peut insérer dans tout gène non essentiel dans le génome de P. aeruginosa. Ceci permet d'obtenir environ 18 sites d'insertion par TA cadre ouvert de lecture dans le génome de PAO1.

Ici, nous décrivons un protocole utilisant des mini-transposon himar1 médiation mutagenèse pour identifier de nouveaux régulateurs de mucoidy dans P. aeruginosa. Plus précisément, nous biparentally conjugué du vecteur PFA contenant un transposon mini-himar1 de E. coli SM10/λpir dans le non mucoïde prototrophique souche PAO1. Après que le transposon est intégré dans le génome, la souche réceptrice est mise en culture sur gélose Pseudomonas isolement (PIA) contenant du triclosan qui inhibe la croissance de E. coli. Ainsi, une banque de mutants d' P. aeruginosa peut être sélectionnée par la croissance de la plaque PIA supplémenté avec de la gentamycine et de la présence du phénotype mucoïde. Remarque, un transposon médiation contre un mutant d'intégration véritable aura un phénotype résistant et carbenicilline sensible gentamicine. Dans cette étude, environ 80 000 mutants d'insertion de PAO1 ont été isolés au moyen de quatre conjugaisons séparées. Nous avons ensuite projeté pour les isolats mucoïdes, et déterminé le site d'insertion par l'enzyme de restriction digestion, ligature et PCR inverse. Nous avons effectué une analyse par transfert de Southern avec la cassette de résistance à la gentamycine comme une sonde pour voir le nombre d'insertion par génome. Nous avons déterminé que plus de 90% des mutants obtenus par conjugaison en utilisant ce protocole n'avait qu'une seule copie du himar1 dans le génome et affiché le phénotype résistant et carbenicilline sensible gentamicine. Un total de 32 isolats muqueuses ont été identifiés, 22 d'entre eux ont été cartographiés à différents loci du P. aeruginosa PAO1chromosome. Ce taux d'insertion prévoit une couverture suffisante pour identifier plusieurs nouveaux régulateurs de surproduction alginate.

Protocole

Une. Préparation des souches bactériennes et biparentale Conjugaison

1. Inoculer E. coli SM10/λpir/pFAC dans 5 ml de bouillon de Luria (LB) additionné de 15 pg / ml de gentamicine et le placer dans un incubateur à agitation pendant une nuit à 37 ° C.
2. Inoculer P. aeruginosa souche PAO1 dans 5 ml de LB, et placer dans un incubateur à agitation pendant une nuit à 42 ° C.
3. Mesurer la DO ₆₀₀ de cultures de la nuit et mélanger des quantités égales de PAO1 et E. coli PFA telle que le volume final est entre 1 à 1,4 ml.
4. mélange Centrifuger à 6000 g pendant 5 min.
5. Pendant ce temps, sécher des plaques LB pour la conjugaison: laisser les plaques ouvertes dans l'incubateur à 37 ° C pendant 10-15 min.
6. Retirez tous mais 50 pi de surnageant de mélange de cellules.
7. Reprendre le culot cellulaire dans les 50 pi restants de surnageant et pipette sur une plaque LB sec dans une gouttelette compact.
8. Placez délicatement la plaque dans une hotte à sécher (IMPORemarque rtant: Ne laissez pas les cellules réparties sur la plaque, ce diminuera de façon significative l'efficacité de la conjugaison).
9. Une fois la goutte est sec, retourner la plaque LB et incuber à 37 ° C pendant 4-6 heures.
10. Bien que le mélange de cellules est en incubation, préparer de grandes (150 mm x 15 mm) des plaques de PIA avec 300 pg / ml de gentamicine. Avant toute utilisation, enlever toute humidité résiduelle en plaçant dans un incubateur à 37 ° C pendant 15-20 min.
11. Après l'incubation du mélange de cellules est terminée, recueillir les cellules à l'aide d'une anse d'inoculation stérile et dans un tube à centrifuger contenant 1 ml de LB et vortex, ou d'une pipette, pour bien mélanger.
12. Répartir les cellules uniformément sur les grandes plaques PIA contiennent 300 pg / ml de gentamicine. (IMPORTANT: Pour cette étape, il est préférable d'ajouter des volumes croissants de mélange de cellules pour séparer les plaques (par exemple Planche 1: 10 pi, Planche 2: 50 pi, Planche 3: 100 pi, Planche 4: 500 pi, etc) .
13. Incuber une nuit à 37° C.

2. La détection et l'isolement des colonies mucoïdes

1. Retirer les plaques de l'incubateur et examiner les colonies mucoïdes.
2. Isoler une seule colonie mucoïde et par épuisement sur les petites plaques (100 mm x 10 mm) avec PIA et 300 pg / ml de gentamicine.
3. Incuber pendant une nuit à 37 ° C.
4. Répétez l'étape 2.2 de la culture de la nuit précédente.
5. Répétez les étapes 02.02 à 02.04 deux fois de plus pour déterminer la stabilité de l'isolat mucoïde.
6. Après l'étape finale de l'isolat, inoculer 4,5 ml de LB avec une seule colonie mucoïde et incuber pendant une nuit dans un agitateur à 37 ° C.
7. Le lendemain, l'étiquette 3 microtubes pour chaque mutant mucoïde.
8. Préparer deux 1,25 ml aliquotes de culture d'une nuit dans 2 tubes pour l'extraction de l'ADN génomique et l'identification du site d'insertion du transposon (voir protocole n ° 3).
9. En outre, archiver chaque mutant mucoïde par pipetage 1 ml de culture durant la nuit dans un CRÉDITScryovial ely-marqué contenant un volume égal de 10% de lait écrémé. Conserver à -86 ° C.

3. ADNg digestion de restriction et ligature

1. Extraire à partir de l'ADNg de la mucoïde mutant en utilisant n'importe quel procédé préféré (par exemple. Phénol-chloroforme, colonne de centrifugation, etc.)
2. Déterminer la concentration de l'ADNg, de digérer un total de 2 pg à 1 microlitre de l'endonucléase de restriction Sal I, 0,5 ul d'albumine de sérum bovin, 5 ul de Sali enzyme tampon (100 mM de NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM de _MgCl2 , 1 mM de dithiothréitol (DTT), pH 7,9 à température ambiante), et le volume approprié de dH ₂ O pour obtenir un volume total de 50 ul.
3. Digérer l'ADN pendant une nuit à 37 ° C. (IMPORTANT:. Selon l'efficacité de l'enzyme de restriction, il peut être nécessaire d'ajouter un 1 pi supplémentaires pour le résumé du jour au lendemain et incuber à 37 ° C pendant 1-2 heures C'est en plus de la digestion pendant la nuit.)
4. Purifier le digeADN STED utilisant n'importe quelle méthode préférée (par exemple agarose de purification de gel, les colonnes de spin) et élue avec 25 pi de tampon.
5. Ligaturer l'ADN digéré par mélange de 11 ul d'ADN purifié avec une concentration préférée de ~ 10 à 20 ng / pl, 1,5 pl de tampon de ligature (330 mM de Tris-acétate pH 7,5, 660 mM d'acétate de potassium, l'acétate de magnésium 100 mM, 5 mM DTT), 1,5 ul de 100 mM d'ATP et 1 ul d'ADN ligase.
6. Faire incuber le mélange pendant 15 min à température ambiante, et ensuite inactiver l'enzyme par incubation pendant 15 min à 70 ° C. (Remarque: l'incubation du mélange à température ambiante pendant plus peut augmenter le succès de la ligation).

4. PCR inverse (iPCR) et Analyse de séquence

1. Effectuer iPCR sur le produit de ligature en utilisant le texte suivant amorces sens et antisens et conditions thermocycler:
   Primer-Forward (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
   Primer inversée (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
   Thermocycleur Conditions:
   Une. 94 ° C pendant 1 min.
   2. 94 ° C pendant 1 min.
   3. 58 ° C pendant 2 min.
   4. 72 ° C pendant 2 min.
   5. 72 ° C pendant 8 min.
   6. 10 ° C en attente.
   Répétez les étapes 2-4 pour 34 cycles.
   (REMARQUE: Les produits amplifiés PCR inverse peuvent être stockés à 4 ° C)
2. Effectuer l'électrophorèse sur gel d'agarose pour confirmer la réussite amplification iPCR.
3. Effectuer le séquençage du produit iPCR utilisant les amorces Gm3OUT et Gm5OUT. Le site d'insertion et l'orientation de himar1 sont tracées.

Résultats

Comme illustré sur la figure 1, le vecteur marin transposon mini-himar1, PFA, contient deux répétitions inversées de 27 pb avec des sites d'insertion TA flanquant la cassette de résistance aacC1 de gentamycine, avec son σ promoteur ^{70-dépendante,} et un site de clonage multiple (MCS). En outre, le vecteur contient des gènes codant pour des PFA la transposase hautement actif de himar1, β-lactamase (bla), et l'opéron de transfert

Discussion

Il est important de noter que ce procédé peut être utilisé dans d'autres espèces de Pseudomonas avec ces altérations: incuber P. fluorescens et P. putida à 30 ° C, et P. stutzeri à 42 ° C; P. stuzeri doit être mis en culture sur des plaques LB supplémenté avec 150 ug / ml de gentamycine, à l'étape 1.11, P. stutzeri cellules doivent être transférés dans 500 pl de LB au lieu de 1 ml. En outre, il ya deux étapes essentielles de ce protocole. T...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luria Broth	Difco	240230	via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation agar	Difco	292710	via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-13
Large Plates (150 O.D. x 15 mm)	Fisher Scientific	08-757-14
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-4
Benchtop Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	Innova 4080	shake at 200 rpm
Cabinet Incubator	VWR	1540
Benchtop Microcentrifuge	Sorvall	75-003-287	via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	or preferred method/vendor
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
1.5 ml Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
2.0 ml Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific
15 ml Tubes	Fisher Scientific	05-539-12
Skim Milk	Difco	DF0032-17-3	via Fisher Scientific
DNeasy Blood and Tissue (250)	Qiagen	69506	or preferred method/vendor
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	or preferred method/vendor
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	or preferred method/vendor
FastLink II DNA Ligation Kit	Epicentre Technologies	LK6201H	via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Sal1, restriction endonuclease	New England BioLabs	R0138L
EasyStart Micro 50	Molecular BioProducts	6020	via Fisher Scientific
Taq DNA Polymerase	New England BioLabs	M0267L
iCycler, Thermocycler	Bio-Rad	170-8740
LE agarose	Genemate	3120-500	via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP918-1
2.0 ml Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific