在伴有海藻酸钠生产新基因的鉴定<em&gt;铜绿假单胞菌</em&gt;使用小型<em&gt; himar1</em&gt;水手转座子介导的诱变

摘要

这里我们描述了使用微型himar1水手转座子介导的诱变以产生高密度的插入突变体文库，以屏幕的协议，分离和鉴定中的原型的铜绿假单胞菌菌株PAO1新颖藻稳压器。

摘要

铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性，环境细菌具有多功能的代谢能力。P.绿脓杆菌是一种条件致病菌细菌确立患者的囊性纤维化（CF）的慢性肺部感染。荚膜多糖称为藻酸盐，也被称为mucoidy的生产过剩，促进粘液的生物膜是比浮游细胞对抗生素的化疗和宿主防御更能抵抗的形成。此外，从nonmucoid到粘液表型的转化是一个临床标记的发作的慢性感染的CF。海藻酸钠生产过剩由P.绿脓杆菌是一种吸能的过程，大量征税细胞能量。因此，海藻酸钠生产是高度管制的P。铜绿假单胞菌 。为了更好地理解海藻酸钠调控，我们描述了一个协议，使用mini-himar1转座子诱变的新型海藻酸调节器的识别S IN一个原型株PAO1。该过程包括两个基本步骤。首先，我们从主机E.转让迷你himar1转座子（PFAC） 大肠杆菌 SM10/λpir到受体P。通过双亲结合来创建一个高密度的插入突变体库，并于辅以庆大霉素假单胞菌分离琼脂平板上选择的铜绿假单胞菌 PAO1。其次，我们筛选和分离出的粘液状菌落，通过反向PCR用DNA引物从盒式庆大霉素和DNA测序指着向外绘制的插入位点。使用此协议，我们已经确定了两个新海藻酸钠监管，MUCE（PA4033）和kinB（PA5484），在PAO1菌株与野生型mucA编码抗σ因子MucA对主海藻酸钠调节^{AlgU（ALGT，σ22）} 。这种高通量诱变协议可以修改为其他毒力相关基因的鉴定引起的变化在结肠NY形态。

引言

机会主义，革兰氏阴性病原体绿脓杆菌的生产过剩海藻酸钠的能力是其建立了生物膜能力的主要因素。藻酸盐的过量产生是一个表型通常被称为mucoidy。粘液状菌落从患有囊性纤维化（CF）个人痰隔离指示一种慢性感染，并直接与病人的健康¹整体下降有关。目前，应当理解的是藻酸盐中P的调节和生产假单胞菌主要发生在两个操纵子。首先是海藻酸钠生物合成操纵子，其中包含12个基因（ALGD - alg8 - alg44 - algK - 代数 - algG - algX - algL - ALGI - algJ - algF - 藻类 ），负责海藻酸盐聚合物的合成及出口对面在周质的细胞外环境为NT ^2-5。第二个操纵子是基因的集群开头的替代σ因子algU /吨 ，与mucA，mucB和MUCD继续。 AlgU / T是正的调节器，而mucAB-D被划分为藻酸盐生产^6-8的负调节因子。此外，转录调节子，如ALGB，AlgQ，ALGR和RpoN，以及转录后和翻译后修饰通过降解物阻遏控制，激酶活性（KinB）和膜内蛋白水解作用，也被证明是参与海藻酸钠调控^9-14。

被称为PFAC迷你himar1转座子载体最初是在Mekalanos博士的实验室在哈佛医学院¹⁵创建的。该PFAC质粒组成由27个基点2反向重复序列和庆大霉素抗性盒在中间（aacC1：534 bp）的两侧转座元件，编码hyperact的基因的ive 水手转座^16，和一个基因编码的β-内酰胺酶（BLA）（ 图1）。可在GenBank登录号为PFAC的转座子序列信息：DQ366300 ^13。在PFAC，有一个多克隆位点（MCS），其用于使用反向PCR的染色体插入位点的鉴定aacC1基因的后面。使用迷你himar1转座子的一个主要优点是所需的换位（诱变）没有具体的宿主因素。此外，还有高丰度的整个P的基因组中发现了TA二核苷酸插入位点铜绿假单胞菌 。例如，TA二核苷酸插入位点发生94404和100229倍，在PAO1（6264404基点，GenBank登录号NC_002516.2）和PA14（6537648基点; GenBank登记接入号码NC_008463）基因组中，分别为。因为TA二核苷酸的基因组中，微型himar1丰度的转座子可导致高密度和随机诱变，这是特别适合的毒力基因的分析，并且是高度调控的基因。理论上，迷你himar1座子可以插入到P的基因组中的任何非必需基因铜绿假单胞菌 。这提供了每在PAO1基因组开放阅读框约18 TA的插入位点。

在这里，我们描述了一个协议，使用mini-himar1转座子介导的诱变识别mucoidy在体育新监管铜绿假单胞菌 。更具体地说，我们biparentally缀含有微型himar1座子来自大肠杆菌的PFAC矢量大肠杆菌 SM10/λpir到nonmucoid原养型菌株PAO1。后转座子整合在基因组中，受体菌株进行培养的假单胞菌分离琼脂（PIA）的含有三氯生，其抑制大肠杆菌的生长大肠杆菌 。因此，突变体的文库 P。假单胞菌可以通过生长在PIA板补充有庆大霉素和粘液表型的存在进行选择。请注意，一个真正的转座子介导与整合的突变会产生耐庆大霉素和羧苄青霉素敏感的表型。在这项研究中，PAO1约80,000插入突变体通过四个独立的变体的分离。然后，我们筛选粘液株，并确定插入的酶切，连接和反向PCR的网站。我们使用庆大霉素抗性盒作为探针看每个基因组插入的数目进行Southern印迹分析。我们确定了90％以上使用该协议每缀合得到的突变体有himar1只有单拷贝基因组中并显示在庆大霉素抗性和羧苄青霉素敏感的表型。共有32粘液株进行了鉴定，其中22映射到不同的位点P的铜绿假单胞菌 PAO1染色体。插入的这个比率提供足够的覆盖范围，以确定海藻酸钠生产过剩几种新型稳压器。

研究方案

1。细菌菌株的制备与双亲共轭

1. E.接种大肠杆菌 SM10/λpir/pFAC在5ml的Luria肉汤（LB）中在37℃下补充有庆大霉素和地方的15微克/毫升在振荡孵化过夜
2. 接种P.假单胞菌菌株PAO1于5ml的LB，并将其放置在摇床过夜，42°C
3. 测量外径₆₀₀过夜培养和混合PAO1和E等量大肠杆菌 PFAC使得最终体积为1-1.4毫升之间。
4. 离心混合物以6,000×g离心5分钟。
5. 与此同时，干燥的LB平板的结合：离开板的孵化器开放在37℃10-15分钟。
6. 删除所有，但50微升上清液从细胞混合物。
7. 悬浮在剩余的50微升上清液和吸管的细胞沉淀到干LB平板在一个紧凑的液滴。
8. 小心地将板在通风橱中晾干（IMPORTANT注意：不要让细胞分布在盘子里，这将显著降低共轭的效率）。
9. 一旦液滴干燥，颠倒LB平板上并在37℃下进行4-6小时。
10. 而细胞混合物孵化，准备大（外径150×15毫米），PIA板与庆大霉素的300微克/毫升。在使用之前，通过放置在培养箱中在37℃下15-20分钟除去残留的水分。
11. 后的细胞混合物的温育结束后，用无菌接种环收集细胞并在含有1ml LB和涡流，或吸管微量离心管中，以彻底混合。
12. 地摊细胞均匀涂于大的PIA板含有300微克/毫升的庆大霉素。 （重要提示：对于此步骤，最好是增加细胞混合物的体积增加来分隔板（ 如板1：10微升，板2：50微升，板3：100微升，标牌4：500微升， 等 ） 。
13. 孵育过夜，在37°C。

2。检测和粘液殖民地的隔离

1. 从孵化器中取出板并检查粘液菌落。
2. 分离出单个菌落粘液和条纹隔离在中小板（100外径×10毫米），PIA和庆大霉素的300微克/毫升。
3. 孵育过夜，在37°C。
4. 上一过夜培养重复步骤2.2。
5. 重复步骤2.2-2.4两次，以确定粘液分离的稳定性。
6. 经过最后的分离步骤，接种4.5毫升LB与单个粘液菌落孵育摇床中过夜，在37°C。
7. 第二天，标签3的离心管中的每个粘液突变体。
8. 准备过夜培养两个1.25毫升分装成2管基因组DNA的提取和鉴定转座子插入位点（见协议3）。
9. 此外，吹打1毫升过夜培养成一个适用情况选择归档的每个粘液突变含10％脱脂牛奶等量伊利标记的离心管。贮存于-86°C。

3。基因组DNA酶切和结扎

1. 使用任何惯用的方法（ 例如 ，酚-氯仿，旋转柱等 ）的粘液突变体中提取基因组DNA。
2. 确定基因组DNA的浓度，消化共2微克与1微升的限制性内切酶SalI位，0.5微升的牛血清白蛋白，5微升SalI位酶缓冲液（100mM的NaCl，50mM的Tris-盐酸，10mM的MgCl ₂的，1mM的二硫苏糖醇（DTT），pH值为7.9，在室温下）和DH _{2 O}的适当体积达到50μl的总体积。
3. 过夜消化的DNA在37°C （要点：根据不同的限制性内切酶的效率，它可能需要额外的1微升加至过夜消化和孵育在37℃下1-2小时，这是除了过夜消化。）
4. 净化DIGESTED的DNA使用任何首选方法（ 如琼脂糖凝胶纯化，离心柱）和洗脱与25微升缓冲。
5. 通过将11微升纯化的DNA用的〜10-20纳克/微升的优选​​浓度，1.5微升连接缓冲液中（330毫摩尔Tris-乙酸盐pH为7.5，660 mM的醋酸钾，100mM的醋酸镁，5mM的结扎消化的DNA DTT），1.5微升100毫摩尔ATP和1μlDNA连接酶。
6. 为15分钟，在室温下温育该混合物，然后通过在70℃下温育15分钟，使酶失活（注：在室温下温育该混合物不再可能增加连接的成功）。

4。反向PCR（反向PCR）及序列分析

1. 使用下列的正向和反向引物和热循环条件对连接产物进行反向PCR：
   - 正向引物（Gm3OUT）：GGGCATACGGGAAGAAGTGA
   - 反向引物（Gm5OUT）：GACTGCCCTGCTGCGTAACA
   热循环康迪系统蒸发散：
   1。 94℃1分钟;
   2。 94℃1分钟;
   3。 58℃持续2分钟。
   4。 72℃2分钟。
   5。 72°C为8分钟。
   6。 10°C保温。
   重复步骤2-4为34个周期。
   （注：扩增反向PCR产品可以保存在4°C）
2. 进行琼脂糖凝胶电泳，以确认成功的反向PCR扩增。
3. 对反向PCR产物使用Gm3OUT和Gm5OUT引物进行测序。插入位点和himar1的取向被映射出来。

结果

如图1所示 ，微型himar1水手转座子载体，PFAC，包含两个27碱基的反向重复序列与TA的插入位点侧翼的aacC1庆大霉素抗性盒，其^σ70依赖型启动子和多克隆位点（MCS）。此外，PFAC载体含有编码基因的高活性himar1转座，β-内酰胺酶（BLA），和TRA传递操纵子。电讯局长插入位点允许一个有效的融入P的基因组铜绿假单胞菌菌株。在识别和?...

讨论

要注意，这种方法可以在其他假单胞菌属与这些改变使用是很重要的：孵化P.荧光假单胞菌和P.恶臭在30°C和P。施氏假单胞菌在42℃; P。 stuzeri应培养于补充有150微克/毫升庆大霉素的LB平板上，在步骤1.11，P。斯氏假单胞菌细胞应被转移到500微升的LB代替1毫升。此外，还有对本协议的两个关键步骤。首先，受体菌株应在适当的温度下进行培养。例如，PAO1，应?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luria Broth	Difco	240230	via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation agar	Difco	292710	via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-13
Large Plates (150 O.D. x 15 mm)	Fisher Scientific	08-757-14
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-4
Benchtop Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	Innova 4080	shake at 200 rpm
Cabinet Incubator	VWR	1540
Benchtop Microcentrifuge	Sorvall	75-003-287	via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	or preferred method/vendor
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
1.5 ml Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
2.0 ml Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific
15 ml Tubes	Fisher Scientific	05-539-12
Skim Milk	Difco	DF0032-17-3	via Fisher Scientific
DNeasy Blood and Tissue (250)	Qiagen	69506	or preferred method/vendor
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	or preferred method/vendor
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	or preferred method/vendor
FastLink II DNA Ligation Kit	Epicentre Technologies	LK6201H	via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Sal1, restriction endonuclease	New England BioLabs	R0138L
EasyStart Micro 50	Molecular BioProducts	6020	via Fisher Scientific
Taq DNA Polymerase	New England BioLabs	M0267L
iCycler, Thermocycler	Bio-Rad	170-8740
LE agarose	Genemate	3120-500	via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP918-1
2.0 ml Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific