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要約

ここでは、画面に高密度の挿入変異体ライブラリーを生成するためのミニhimar1マリナートランスポゾンによる突然変異誘発を使用して、プロトコルを記述し隔離し、原型緑膿菌 PAO1株における新規アルギン酸レギュレータを識別します。

要約

緑膿菌は、汎用性の高い代謝機能を持つグラム陰性、環境細菌である。P.緑膿菌は、嚢胞性線維症（CF）患者における慢性肺感染症を確立日和見病原菌である。またmucoidyとして知られているアルギン酸と呼ばれる莢膜多糖の過剰産生は、抗生物質、化学療法および宿主防御に浮遊細胞よりも抵抗性がある粘液状のバイオフィルムの形成を促進する。また、粘液性の表現型への非ムコイドからの変換は、CFにおける慢性感染の発症のための臨床マーカーである。 P.によるアルギン酸塩過剰生産緑膿菌は重く細胞エネルギーを課税吸エルゴン過程である。したがって、アルギン酸塩生産はPに高度に規制されている緑膿菌 。より良いアルギン酸調節を理解するために、我々は、新規なアルギン酸塩レギュレータの同定のためのミニhimar1トランスポゾン突然変異誘発を使用して、プロトコルを記述原型PAO1株におけるS。手順は、2つの基本ステップで構成されています。まず、ホストEからミニhimar1トランスポゾン（PFAC）に転送受信者P.に大腸菌 SM10/λpirゲンタマイシンを補充したシュードモナス分離寒天プレート上で選択した高密度の挿入変異体ライブラリーを作成するための共役二親を介して緑膿菌 PAO1。第二に、我々は、スクリーニングおよびゲンタマイシンカセットおよびDNA配列決定から外向きDNAプライマーを用いた逆PCRを介して挿入部位をマッピングするムコイドのコロニーを単離した。 （AlgTは、22を σ）は、野生型ムカマスターアルギン酸レギュレータAlgU抗シグマ因子ムカをコードするPAO1株で、このプロトコルを使用して、我々は2つの新規アルギン酸レギュレータを特定し、mucE（PA4033）とkinB（PA5484） 。このハイスループット突然変異誘発プロトコルは、結腸の変化を引き起こす他の病原性関連遺伝子の同定のために修飾することができるNY形態。

概要

アルギン酸塩を過剰にする日和見、グラム陰性病原体緑膿菌の能力は、バイオフィルムを確立する能力において主要な因子である。アルギン酸塩の過剰産生は、多くの場合、mucoidyと呼ばれる表現型である。嚢胞性線維症（CF）に罹患した個体の痰からムコイドのコロニーの単離は、慢性感染の指標であり、直接的に患者の健康1における全体的な減少と関連している。現在、それは理解されるP.におけるアルギン酸塩の調節および生産緑膿菌は、主に2つのオペロンで行われます。全体のアルギン酸塩ポリマーの合成と輸出を担当している（ 藻類 - ALG8 - alg44 - algK - 代数 - algG - algX - algL - algI - algJ - - algF algD）最初は、12の遺伝子が含まれているアルギン酸生合成オペロン、である外environmeにペリプラズムNT 2-5。二オペロンは遺伝子のクラスター代替シグマ因子algU / Tで始まり、 ムカ、mucB、およびMUCDと続いている。 mucAB-Dはアルギン酸塩の生産6-8の負の調節因子として分類されている間AlgU / Tは、正の調節因子である。さらに、異化代謝産物抑制制御、キナーゼ活性（KinB）と内タンパク質分解によってそのようなAlgB、AlgQ、AlgR、およびRpoNだけでなく、転写後および翻訳後修飾のような転写調節因子も、アルギン酸塩に関与することが示されているレギュレーション9月14日 。

PFACとして知られているミニhimar1トランスポゾンベクターは、もともとハーバード大学医学部15博士Mekalanos '研究室で作成されました。 PFACプラスミドは2 27 BPSの逆方向反復と中央のゲンタマイシン耐性カセット（aacC1：534 BP）に挟まれた転移因子で構成され、hyperactをコードする遺伝子IVEはマリナートランスポザーゼ 16、および遺伝子をコードするβ-ラクタマーゼ（BLA）（ 図1）。 DQ366300 13：PFACの転移因子についての配列情報は、GenBankアクセッション番号で入手できます。 PFACにおいて、インバースPCRを用いて染色体挿入部位の同定のために使用されるaacC1遺伝子の背後にある複数のクローニング部位（MCS）が存在する。ミニhimar1トランスポゾンを使用する場合の1つの主要な利点は、特定の宿主因子を移調（誘発）のために必要ありませんです。また、Pのゲノムで発見TAジヌクレオチド挿入部位の高い存在があります緑膿菌 。それぞれのゲノムを、例えば、TAジヌクレオチド挿入部位はPAO1に94404と100229回発生（6264404 BPS、GenBankアクセッション番号NC_002516.2）とPA14（ジェンバンクアクセス番号NC_008463 6537648 BPS）。なぜなら、ゲノム中のTAジヌクレオチドの豊富さ、ミニhimar1 トランスポゾンは、毒性遺伝子の分析および高度に調節される遺伝子に特に適している高密度のランダム突然変異誘発を引き起こすことができる。理論的には、ミニhimar1トランスポゾンは、Pのゲノム内の任意の非必須遺伝子に挿入することができます緑膿菌 。これはPAO1ゲノムにおけるオープンリーディングフレームあたり約18のTA挿入部位を提供しています。

ここでは、P.中mucoidyの新規制御因子を特定するために、ミニhimar1トランスポゾンによる突然変異誘発を使用して、プロトコルを記述緑膿菌 。具体的には、我々はbiparentally Eからミニhimar1トランスポゾンを含むPFACベクトル共役非ムコイド栄養PAO1株に大腸菌 SM10/λpir。トランスポゾンは、ゲノムに組み込まれた後、レシピエント株は、 大腸菌の増殖を阻害するトリクロサンを含有する、シュードモナス分離寒天（PIA）上で培養する大腸菌 。このように、の変異体のライブラリー P.緑膿菌は、ゲンタマイシンおよびムコイド表現型の存在を補充したPIAプレート上の増殖により選択することができる。真のトランスポゾン媒介統合変異対ゲンタマイシン耐性およびカルベニシリン感受性表現型を持つことになります、注意してください。本研究では、PAO1の約8万挿入変異体は、4つの別々の動詞によって単離した。次に、ムコイド分離株についてスクリーニングし、制限酵素消化、ライゲーション、逆PCRにより挿入部位を決定した。私たちは、ゲノム当たりの挿入の数を確認するためのプローブとしてゲンタマイシン耐性カセットを用いてサザンブロット解析を行った。我々は、このプロトコルを使用してコンジュゲート当たりの得た変異体の90％以上がゲノム中にhimar1の単一コピーを持っていたし、ゲンタマイシン耐性およびカルベニシリンに敏感な表現型を示していると判断。 32粘液性分離株の合計が同定された、そのうちの22は、Pの異なる遺伝子座にマップされた緑膿菌 PAO1染色体。挿入このレートは、アルギン酸塩過剰生産のいくつかの新規制御因子を特定するために十分なカバレッジを提供します。

プロトコル

1。細菌株の準備と二親共役

  1. E.接種 37℃で一晩振盪インキュベーター中ゲンタマイシンと場所の15μg/ mlのを補ったルリアブロス（LB）5ml中大腸菌 SM10/λpir/pFAC
  2. Pを接種緑膿菌の菌株のLB 5ml中PAO1、そして42℃で一晩振とう培養器内の場所
  3. OD一晩培養の600を測定し、PAO1とEの等量を混ぜる最終容量は1〜1.4ミリリットルの間であることを大腸菌 PFACは、。
  4. 5分間6000×gで遠心分離混合物。
  5. 一方、結合のためにLBプレートを乾燥さ：10〜15分間、37℃のインキュベーター内で開いたプレートを残す。
  6. 細胞混合物からの上清50μlが、すべてを削除します。
  7. 1コンパクト滴の乾燥をLBプレートに上清とピペットの残り50μlの細胞ペレットを再懸濁します。
  8. 慎重に（IMPOを乾燥させるためにドラフト内でプレートを置きRTANT注：プレート上に広げ、細胞が、これは大幅に）結合の効率が低下しないようにしてください。
  9. 液滴が乾燥した後、LBプレートを反転し、4〜6時間37℃でインキュベートする。
  10. 細胞混合物をインキュベートしている間、ゲンタマイシン300μgの/ mlの大（150外径×15ミリメートル）PIAプレートを準備します。使用前に、15〜20分間、37℃のインキュベーター内に置くことにより、任意の残留水分を除去。
  11. 細胞混合物のインキュベーションが完了した後、無菌の接種ループを用いて細胞を採取し、1mlのLB、ボルテックス、又はピペットを含有する微小遠心管中で、十分に混合する。
  12. 300μg/ mlのゲンタマイシンを含む大きなPIAプレートに細胞を均一に広げる。 （重要：この手順では、それは別々のプレートに細胞混合物の増加ボリュームを追加することをお勧めし（ 例えばプレート1：10μL、プレート2：50μL、プレート3：100μL、プレート4：500μL、 など ） 。
  13. 37℃で一晩インキュベートする。℃、

2。ムコイドコロニーの検出と分離

  1. インキュベーターからプレートを取り外し、粘液状のコロニーについて検討する。
  2. 小皿PIAとゲンタマイシン300μgの/ mlの（100外径×10ミリメートル）での分離のために、単一の粘液状コロニーと連勝を隔離する。
  3. 37℃で一晩インキュベートする。
  4. 前の晩培養物にステップ2.2を繰り返します。
  5. 繰り返します粘液性分離株の安定性を決定するために、2.2から2.4までさらに2回繰り返します。
  6. 最終的な分離株の工程の後に、単一の粘液状コロニーをLBの4.5ミリリットルを接種し、37℃で一晩シェーカーでインキュベート
  7. 次の日、それぞれの粘液性変異体のラベル3マイクロチューブ。
  8. ゲノムDNA抽出およびトランスポゾン挿入部位を同定するための2管（プロトコル3を参照）に一晩培養の2 1.25ミリリットルずつを準備します。
  9. さらに、appropriatに1ミリリットル一晩培養をピペッティングすることにより、各粘液性変異体をアーカイブ10パーセントスキムミルクを等量含むイーリーで標識されたクライオバイアル。 -86℃での​​ストア

3。 gDNAを制限消化および連結

  1. 任意の好適な方法（ 例えば 、フェノール-クロロホルム、スピンカラムなど ） を使用して、粘液性変異株からのgDNAを抽出します。
  2. gDNAの濃度を決定するため、制限エンドヌクレアーゼSalIで2μgの1μlの総ダイジェスト、ウシ血清アルブミンをSalI酵素緩衝液（100mMのNaCl、50mMのトリス-HCl、10mMのMgCl 25μlの0.5μlの、1mMのジチオスレイトール（DTT）、室温でのpH 7.9）および50μlの全容量を達成するためのdH 2 Oの適切な体積。
  3. 37℃で一晩DNAを消化（重要：制限酵素の効率に応じて、一晩ダイジェストに追加1μLを加え、1〜2時間、37℃でインキュベートする必要があるかもしれないこれは一晩消化するために追加されます。）
  4. DIGEを浄化任意の好適な方法（ 例えば 、アガロースゲル精製、スピンカラム）とバッファの25μlの溶出を使用してSTEDのDNA。
  5. 、〜10月20日NG /μLの好ましい濃度で精製したDNAの11μLを混合して消化されたDNAを連結ライゲーションバッファー（330 mMトリス - 酢酸pH7.5の、660 mMの酢酸カリウム、100 mM酢酸マグネシウム、5 mMと1.5μL DTT）、100 mMのATPと1μlのDNAリガーゼ1.5μL。
  6. 室温で15分間混合物をインキュベートし、次いで70℃で15分間インキュベートすることによって酵素を不活性化（注：長いを室温で混合物をインキュベートすると、ライゲーションの成功を増加させることができる）。

4。逆PCR（のiPCR）と配列解析

  1. 以下のフォワードおよびリバースプライマーおよび熱サイクル条件を使用してライゲーション産物でのiPCRを実行します。
    フォワードプライマー（Gm3OUT）：GGGCATACGGGAAGAAGTGA
    - リバースプライマー（Gm5OUT）：GACTGCCCTGCTGCGTAACA
    サーモサイコンディtions：
    1。 1分間94℃に。
    2。 1分間94℃に。
    3。 2分間58℃に。
    4。 2分間72℃に。
    5。 8分間72℃に。
    6。 10℃のホールド。
    繰り返します34サイクルの2-4を繰り返します。
    （注：増幅iPCRの製品は4℃で保存することができます）
  2. 成功のiPCR増幅を確認するために、アガロースゲル電気泳動を行う。
  3. Gm3OUTとGm5OUTプライマーを用いてのiPCR製品にシーケンシングを実行します。挿入部位とhimar1の向きが外にマッピングされます。

結果

図1に示すように、ミニhimar1マリナートランスポゾンベクターは、PFACは、TAの挿入部位は、そのσ70依存性プロモーターとマルチクローニングサイト（MCS）と、aacC1ゲンタマイシン耐性カセットに隣接した2 27 bpの逆方向反復が含まれています。さらに、PFACベクトルは、高活性himar1トランスポザーゼ 、β-ラクタマーゼ（BLA）、およびTRA転送?...

ディスカッション

この方法は、これらの変化と他のシュードモナス種に使用することができることに留意することが重要である：P.インキュベートフルオレッセンスおよびP. 30℃でプチダ 、およびP. 42℃でのストチェリ ; P. stuzeriはゲンタマイシンの150μg/ mLのを追加したLBプレート上で培養しなければならない。ステップ1.11、Pにスタッツェリ細胞をLB5...

開示事項

著者Hongwei D. YuはProgenesisテクノロジーズ、LLCの最高科学責任者および共同設立者です。

謝辞

この作品は、生物医学研究の卓越性のためのウェストバージニア州のアイデアネットワークにアメリカ航空宇宙局ウェストバージニアスペースグラントコンソーシアム（NASA WVSGC）、嚢胞性線維症財団（CFF-YU11G0）およびNIH P20RR016477とP20GM103434によってサポートされていました。我々は、この作品について技術的な支援のためにVonya M·アイジンガーに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Luria BrothDifco240230via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation agarDifco292710via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm)Fisher Scientific08-757-13
Large Plates (150 O.D. x 15 mm)Fisher Scientific08-757-14
GlycerolFisher ScientificBP229-4
Benchtop Shaking IncubatorNew Brunswick ScientificInnova 4080shake at 200 rpm
Cabinet IncubatorVWR1540
Benchtop MicrocentrifugeSorvall75-003-287via Fisher Scientific
SmartSpec Plus SpectrophotometerBio-Rad170-2525or preferred method/vendor
Diposable Inoculation LoopsFisher Scientific22-363-597
1.5 ml Microcentrifuge TubesFisher Scientific05-408-129
2.0 ml Cryogenic VialsCorning430659via Fisher Scientific
15 ml TubesFisher Scientific05-539-12
Skim MilkDifcoDF0032-17-3via Fisher Scientific
DNeasy Blood and Tissue (250) Qiagen69506or preferred method/vendor
QIAquick PCR Purification Kit (250)Qiagen28106or preferred method/vendor
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen27106or preferred method/vendor
FastLink II DNA Ligation KitEpicentre TechnologiesLK6201Hvia Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath LabnetNC0205808via Fisher Scientific
Sal1, restriction endonucleaseNew England BioLabsR0138L
EasyStart Micro 50Molecular BioProducts6020via Fisher Scientific
Taq DNA PolymeraseNew England BioLabsM0267L
iCycler, ThermocyclerBio-Rad170-8740
LE agaroseGenemate3120-500via Fisher Scientific
Gentamycin SulfateFisher ScientificBP918-1
2.0 ml Cryogenic VialsCorning430659via Fisher Scientific

参考文献

  1. Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
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85 mucoidy himar1 PFAC

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