Identifizierung neuer Gene, die mit Alginat-Produktion verbunden in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Mit Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon-vermittelte Mutagenese

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll, mit dem Mini-himar1 mariner Transposon-vermittelte Mutagenese zur Erzeugung einer hohen Dichte Insertionsmutante Bibliothek-Bildschirm, zu isolieren und zu identifizieren Roman Alginat-Regulatoren in der prototypischen Pseudomonas aeruginosa Stamm PAO1.

Zusammenfassung

Pseudomonas aeruginosa ist ein Gram-negatives, Umwelt Bakterium mit vielfältigen Stoffwechselfunktionen. P. aeruginosa ist ein opportunistischer bakteriellen Krankheitserreger, der chronische Lungeninfektionen bei Patienten mit zystischer Fibrose (CF) herstellt. Die Überproduktion von Kapsel-Polysaccharid Alginat genannt, die auch als mucoidy bekannt, fördert die Bildung von schleimigen Biofilms, die resistenter als Planktonzellen antibiotische Chemotherapie und Wirtsabwehr sind. Außerdem ist die Umwandlung von der nonmucoid zu schleimige Phänotyp ein klinischer Marker für die Entstehung von chronischen Infektionen bei Mukoviszidose. Alginat Überproduktion von P. aeruginosa ist ein Prozess, der endergonische Zellenergie stark besteuert. Deshalb wird Alginat Produktion hoch in P. geregelt aeruginosa. Alginat Regulation besser verstehen, ein Protokoll unter Verwendung des Mini-himar1 Transposon-Mutagenese für die Identifizierung von neuen Alginat Regler beschreiben wirs in einer prototypischen Stamm PAO1. Das Verfahren besteht aus zwei Schritten. Zuerst vom Host E. übertragen wir die Mini-Transposon himar1 (PFAC) coli SM10/λpir in Empfänger P. aeruginosa PAO1 über biparental Konjugation an ein High-Density-Insertionsmutante-Bibliothek, die auf Pseudomonas Isolation Agar-Platten mit Gentamycin ergänzt ausgewählt wurden, erstellen. Zweitens, gesiebt und isoliert die schleimige Kolonien, um die Einstichstelle durch inverse PCR Karte mit DNA-Primer zeigt vom Gentamycinkassette und DNA-Sequenzierung nach außen wir. Über dieses Protokoll haben wir zwei neue Alginat-Regulatoren, mucE (PA4033) und Kinb (PA5484), in Stamm PAO1 mit einem Wildtyp-Muça Codieren der Anti-Sigma-Faktor Muça für die Master-Alginat Regler Algu (ALGT, σ ²²⁾ identifiziert . Dieses High-Throughput-Mutagenese-Protokoll kann für die Identifizierung von anderen Virulenz-Genen verursacht Änderung Colo modifiziert werdenny Morphologie.

Einleitung

Die Fähigkeit des opportunistischen, Gram-negative Erreger Pseudomonas aeruginosa zu Alginat überproduzieren ist ein wichtiger Faktor in der Fähigkeit, einen Biofilm zu schaffen. Die Überproduktion von Alginat ein Phänotyp oft als mucoidy bezeichnet. Die Isolierung der schleimigen Kolonien von der Sputum von Patienten mit zystischer Fibrose (CF) betroffen ist, der eine chronische Infektion, und ist direkt mit einem generellen Rückgang in der Gesundheits ¹ des Patienten verbunden. Gegenwärtig ist zu verstehen, daß die Regelung und die Produktion von Alginat in P. aeruginosa tritt vor allem bei zwei Operonen. Die erste ist die Alginat-Biosynthese-Operon, die 12 Gene enthält (ALGD - alg8 - alg44 - algK - ALGE - algG - algX - algL - ALGI - algJ - algF - Alge), die für die Synthese und den Export des Alginatpolymer über verantwortlich sind das Periplasma der extrazellulären environment ^5.2. Die zweite Operon ist ein Cluster von Genen, beginnend mit dem alternativen Sigmafaktor Algu / T und Weiterbildung mit Muça, mucB und mucD. Algu / T ist ein positiver Regulator, während mucAB-D werden als negative Regulatoren der Alginat-Produktion ^8.6 eingestuft. Zusätzlich Transkriptionsregulatoren, wie ALGB, AlgQ, ALGR und RpoN sowie post-Transkriptions-und post-translationale Modifikation von Katabolitrepression Kontrolle, Kinase-Aktivität (Kinb) und Intramembranproteolyse haben auch gezeigt, dass in Alginat einbezogen werden Regulierung ^14.09.

Die Mini-himar1 Transposon-Vektor als PFAC bekannt wurde ursprünglich in Dr. Mekalanos 'Labor an der Harvard Medical School ¹⁵ erstellt. Die PFAC Plasmid besteht aus einem transponierbaren Element von zwei invertierten Wiederholungen von 27 bps und einem Gentamycin-Resistenzkassette in der Mitte (aacC1: 534 bp) flankiert, die ein Gen kodiert, hyperactive mariner Transposase ^16, und ein Gen β-Lactamase (bla) (Abbildung 1). Sequenzinformationen für das Element des Transposons PFAC ist an der GenBank-Zugangsnummer zur Verfügung: DQ366300 ^13. In PFAC gibt es eine multiple Klonierungsstelle (MCS) hinter dem aacC1-Gen, das für die Identifizierung des chromosomalen Insertionsstelle mit inversen PCR verwendet. Ein großer Vorteil bei der Verwendung des Mini-himar1 Transposon keine spezifischen Wirtsfaktoren sind für die Umsetzung (Mutagenese) erforderlich. Darüber hinaus besteht eine hohe Häufigkeit der TA-Dinukleotid Insertionsstellen im gesamten Genom von P. gefunden aeruginosa. Zum Beispiel, TA-Dinukleotid Insertionsstellen auftritt 94.404 und 100.229 mal in der PAO1 (6.264.404 bps, GenBank-Zugangsnummer NC_002516.2) und PA14 (6.537.648 bps; GenBank Zugangsnummer NC_008463) Genome sind. Aufgrund der Fülle von TA-Dinukleotid im Genom, Mini himar1 Transposon kann die hohe Dichte und zufällige Mutagenese, die besonders geeignet für die Analyse der Virulenz-Gene und die Gene, die stark reguliert ist, verursachen. Theoretisch kann die Mini-himar1 Transposons in jeder nicht-essentiellen Gens im Genom von P. einfügen aeruginosa. Dies bietet etwa 18 TA Insertionsstellen pro offene Leserahmen in der PAO1 Genom.

Hier ein Protokoll mit Mini-himar1 Transposon-vermittelte Mutagenese neue Regulatoren der mucoidy in P. identifizieren beschreiben wir aeruginosa. Genauer gesagt, wir biparentally konjugiert PFAC den Vektor, der ein Mini-Transposon aus E. himar1 coli SM10/λpir in die nonmucoid prototrophen Stamm PAO1. Nachdem das Transposon in das Genom integriert ist, ist die Empfängerstamm kultiviert auf Pseudomonas Isolation Agar (PIA), die Triclosan, die das Wachstum von E. hemmt coli. Somit wird eine Bibliothek von Mutanten P. aeruginosa durch das Wachstum auf PIA Platte mit Gentamycin und die Anwesenheit des schleimigen ergänzt Phänotyp ausgewählt werden. Beachten Sie, dass eine wahre Transposon-vermittelte gegen eine Integration Mutante eine Gentamicin resistent und Carbenicillin-sensitiven Phänotyp haben. In dieser Studie wurden rund 80.000 Insertionsmutanten von PAO1 durch vier separaten Konjugationen isoliert. Wir dann gesiebt für schleimige Isolate und bestimmt die Stelle der Insertion mittels Restriktionsenzym-Verdau, Ligation und inverse PCR. Wir führten Southern-Blot-Analyse unter Verwendung des Gentamycin-Resistenz-Kassette als eine Sonde, die Anzahl der Einführungs pro Genom zu sehen. Wir haben festgestellt, dass mehr als 90% der Mutanten pro Konjugation mit diesem Protokoll erhalten hatte nur eine einzige Kopie des himar1 im Genom und angezeigt die Gentamicin resistent und Carbenicillin-sensitiven Phänotyp. Insgesamt 32 schleimige Isolate wurden identifiziert, von denen 22 wurden zu verschiedenen Loci des P. zugeordnet aeruginosa PAO1Chromosom. Diese Rate der Einführung bietet eine ausreichende Abdeckung zu mehreren neuartigen Regulatoren der Alginat-Überproduktion zu identifizieren.

Protokoll

1. Vorbereitung der Bakterienstämme und biparental Konjugation

1. Impfen E. coli SM10/λpir/pFAC in 5 ml Luria Broth (LB) mit 15 ug / ml Gentamicin und in einem Schüttelinkubator über Nacht bei 37 ° C ergänzt
2. Impfen P. aeruginosa Stamm PAO1 in 5 ml LB, und in einem Schüttelinkubator über Nacht bei 42 ° C
3. Messen OD ₆₀₀ von Nacht-Kulturen und mischen gleiche Mengen von PAO1 und E. coli PFAC so daß das Endvolumen zwischen 1-1,4 ml.
4. Zentrifuge Mischung bei 6.000 × g für 5 min.
5. Inzwischen trocknen LB-Platten für die Konjugation: Lassen Platten in Inkubator offen bei 37 ° C für 10-15 min.
6. Entfernen Sie alle 50 ul Überstand von Zellgemisch.
7. Zellpellet in den verbleibenden 50 ul Überstand und Pipette auf eine trockene LB-Platte in einem kompakten Tröpfchen.
8. Die Platte vorsichtig in einem Abzug zu (IMPO trocknenRTANT Hinweis: Lassen Sie sich nicht Zellen über die Platte verteilt, wird dies deutlich die Effizienz der Konjugation verringern).
9. Sobald der Tropfen trocken ist, kehren die LB-Platte und bei 37 ° C für 4-6 Stunden.
10. Während die Zellgemisch inkubiert, bereiten große (150 mm x 15 mm) PIA-Platten mit 300 ug / ml Gentamycin. Vor der Verwendung die Restfeuchte zu entfernen, indem sie in einem Inkubator bei 37 ° C für 15-20 min.
11. Nach der Inkubation der Zellmischung vollständig ist, sammelt die Zellen mit einer sterilen Impföse und in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml LB-und Wirbel oder Pipette, um gründlich zu mischen.
12. Verbreiten Sie die Zellen gleichmäßig auf die großen Platten enthalten PIA 300 ug / ml Gentamicin. (WICHTIG: Bei diesem Schritt ist es am besten, steigenden Volumina der Zellgemisch in den Platten zu trennen (zB Plate 1: 10 ul, Platte 2: 50 ul, Teller 3: 100 ul, Teller 4: 500 ul, etc.) .
13. Inkubieren über Nacht bei 37° C.

2. Erkennung und Isolierung von Kolonien Schleimige

1. Platten entfernen und untersuchen Inkubator für schleimige Kolonien.
2. Isolieren einer schleimigen Kolonie und Streifen für die Isolierung auf kleinen Tellern (100 mm x 10 mm) mit PIA und 300 ug / ml Gentamycin.
3. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C.
4. Wiederholen Sie Schritt 2.2 auf der vorherigen Nacht-Kultur.
5. Wiederholen Sie die Schritte 2.2-2.4 zwei weitere Male um die Stabilität des schleimigen Isolats zu bestimmen.
6. Nach dem letzten Schritt Isolat, impfen 4,5 ml LB mit einer einzigen schleimige Kolonie und Inkubation über Nacht im Schüttler bei 37 ° C
7. Am nächsten Tag, Label 3 Mikrozentrifugenröhrchen für jede schleimige Mutante.
8. Bereiten Sie zwei 1,25 ml Aliquots von Übernachtkultur in 2 Röhren für genomische DNA-Extraktion und Identifizierung der Transposon-Insertion-Website (siehe Protokoll Nr. 3).
9. Darüber hinaus archiviert jede schleimige Mutante durch Pipettieren von 1 ml Übernachtkultur in ein ANGEMESSENEly-markierten Kryoröhrchen, das ein gleiches Volumen von 10% Magermilch. Lagerung bei -86 ° C.

3. gDNA Restriktionsverdau und Ligation

1. Extrahieren aus der gDNA schleimige Mutante mit einer beliebigen Methode (zB. Phenol-Chloroform-Spin-Säule, etc.).
2. Bestimmung der Konzentration der gDNA, Digest insgesamt 2 ug mit 1 &mgr; l der Restriktionsendonuklease SalI, 0,5 &mgr; l Rinderserumalbumin, 5 ul Enzym SalI-Puffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl ₂ , 1 mM Dithiothreitol (DTT), pH 7,9 bei Raumtemperatur), und das entsprechende Volumen von dH ₂ O auf ein Gesamtvolumen von 50 &mgr; l zu erreichen.
3. Digest-DNA über Nacht bei 37 ° C (HINWEIS:. Abhängig von der Effizienz des Restriktionsenzyms kann es notwendig sein, eine zusätzliche 1 &mgr; l der über Nacht zu verdauen und inkubieren bei 37 ° C für 1-2 h Dies ist zusätzlich zu dem Verdau über Nacht.)
4. Reinige den digeSTED-DNA unter Verwendung einer beliebigen Methode (z. B. Agarosegel-Reinigung, Spin-Säulen) und Eluieren mit 25 ul Puffer.
5. Ligation der verdauten DNA durch Mischen von 11 ul der gereinigten DNA mit einer bevorzugten Konzentration von ~ 10-20 ng / ul, 1,5 ul Ligationspuffer (330 mM Tris-Acetat pH 7,5, 660 mM Kaliumacetat, 100 mM Magnesiumacetat, 5 mM DTT), 1,5 ul 100 mM ATP und 1 ul DNA-Ligase.
6. Inkubieren der Mischung für 15 min bei Raumtemperatur und dann inaktiviert das Enzym durch Inkubieren für 15 min bei 70 ° C. (Anmerkung: Die Inkubation der Mischung bei Raumtemperatur für längere kann den Erfolg der Ligation zu erhöhen).

4. Inverse PCR (iPCR) und Sequenzanalyse

1. Führen iPCR auf Ligationsprodukt mit dem folgenden Vor-und Rückwärts-Primer und Thermocycling Bedingungen:
   -Forward Primer (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
   -Reverse Primer (Gm5OUT) GACTGCCCTGCTGCGTAACA
   Thermocycler Condigen:
   1. 94 ° C für 1 min.
   2. 94 ° C für 1 min.
   3. 58 ° C für 2 min.
   4. 72 ° C für 2 min.
   5. 72 ° C für 8 min.
   6. 10 ° C halten.
   Wiederholen Sie die Schritte 2-4 für 34 Zyklen.
   (HINWEIS: Amplified iPCR Produkte können bei 4 ° C aufbewahrt werden)
2. Führen Agarose-Gelelektrophorese zur erfolgreichen iPCR Verstärkung bestätigen.
3. Führen Sie auf der Sequenzierung iPCR Produkt unter Verwendung der Gm3OUT Gm5OUT und Grundierungen. Die Insertionsstelle und die Orientierung himar1 werden zeichnet.

Ergebnisse

Wie in Fig. 1 dargestellt, der Mini-Transposon-Vektor himar1 mariner, PFAC enthält zwei 27 bp invertierten Wiederholungen mit TA Insertion flankieren das aacC1 Gentamycin-Resistenz-Kassette, mit σ ^{70-abhängigen} Promotor und eine multiple Klonierungsstelle (MCS). Zusätzlich enthält der Vektor Gene PFAC die hochaktiven himar1 Transposase, β-Lactamase (bla) und das Übertragungs tra-Operon codiert. Die TA Einführungsstellen ermöglichen eine ef...

Diskussion

Es ist wichtig zu beachten, dass diese Methode auch in anderen Pseudomonas-Arten mit diesen Änderungen verwendet werden: P. inkubieren fluorescens und P. putida bei 30 ° C und P. stutzeri bei 42 ° C; P. stuzeri sollte auf LB-Platten mit 150 ug / ml Gentamycin ergänzt kultiviert werden; Schritt auf 1.11 P. stutzeri Zellen sollten in 500 ul LB statt 1 ml übertragen. Zusätzlich gibt es zwei kritische Schritte für dieses Protokoll. Erstens sollte der Empf...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luria Broth	Difco	240230	via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation agar	Difco	292710	via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-13
Large Plates (150 O.D. x 15 mm)	Fisher Scientific	08-757-14
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-4
Benchtop Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	Innova 4080	shake at 200 rpm
Cabinet Incubator	VWR	1540
Benchtop Microcentrifuge	Sorvall	75-003-287	via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	or preferred method/vendor
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
1.5 ml Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
2.0 ml Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific
15 ml Tubes	Fisher Scientific	05-539-12
Skim Milk	Difco	DF0032-17-3	via Fisher Scientific
DNeasy Blood and Tissue (250)	Qiagen	69506	or preferred method/vendor
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	or preferred method/vendor
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	or preferred method/vendor
FastLink II DNA Ligation Kit	Epicentre Technologies	LK6201H	via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Sal1, restriction endonuclease	New England BioLabs	R0138L
EasyStart Micro 50	Molecular BioProducts	6020	via Fisher Scientific
Taq DNA Polymerase	New England BioLabs	M0267L
iCycler, Thermocycler	Bio-Rad	170-8740
LE agarose	Genemate	3120-500	via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP918-1
2.0 ml Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific