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요약

여기서 우리는, 화면 고밀도 삽입 돌연변이 체 라이브러리를 생성하기위한 미니 himar1 마리너 트랜스포존-매개 돌연변이 유발을 사용하여 프로토콜을 설명 분리 및 프로토 타입 녹농균 스트레인 PAO1 참신한 알긴산 레귤레이터를 식별한다.

초록

녹농균은 다양한 대사 기능이있는 그람 음성, 환경 세균이다. P. 녹농균은 낭포 성 섬유증 (CF) 환자에서 만성 폐 감염을 확립 기회 세균성 병원체이다. 또한 mucoidy로 알려진 알긴산이라는 캡슐 다당류의 생산 과잉은 항생제 화학 요법과 호스트 방어에 플랑크톤 세포보다 더 많은 저항 점액 바이오 필름의 형성을 촉진한다. 또한, 점액 표현형 nonmucoid의 변환은 CF 만성 감염의 발병에 대한 임상 마커입니다. P.에 의해 알긴산 과잉 생산 녹농균은 크게 세포 에너지를 세금을 에너지 흡수성 과정이다. 따라서, 알긴산 생산은 매우 P.에서 규제 녹농균. 더 알긴산 규제를 이해하기 위해, 우리는 신규 알긴산 레귤레이터의 식별을위한 미니 himar1 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여 프로토콜을 설명프로토 타입의 변형 PAO1에서의. 이 절차는 두 가지 기본 단계로 구성됩니다. 첫째, 우리는 호스트 E.에서 미니 himar1의 트랜스포존 (pFAC)을 전송 받는 사람 P.에 대장균 SM10/λpir 겐타 마이신으로 보충 슈도모나스 분리 아가 플레이트상에서 선택 하였다 고밀도 삽입 돌연변이 체 라이브러리를 생성하기 biparental 공액 통해 녹농균 PAO1. 둘째, 우리는 검사 및 겐타 마이신 카세트 및 DNA 염기 서열에서 바깥쪽으로 가리키는 DNA 프라이머를 사용하여 PCR 역을 통해 삽입 사이트를 매핑하는 점액 식민지입니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 (22 σ AlgT) 야생형 mucA 마스터 알긴산 레귤레이터에게도 누군가의 안티 - 시그마 인자 MucA을 인코딩 변형 PAO1 두 ​​소설 알긴산 조절기, MUCE (PA4033) 및 kinB (PA5484)를 확인했습니다 . 이것은 높은 처리량 돌연변이 유발 프로토콜은 깔깔 변화를 일으키는 다른 병원성 관련 유전자의 식별을 위해 수정 될 수있다뉴욕의 형태.

서문

알긴산 염을 과잉 생산하는 기회, 그람 음성 병원균 녹농균의 능력은 생물막을 확립하는 기능의 주요 요인이다. 알긴산의 과잉 생산은 종종 mucoidy 언급 표현형이다. 낭포 성 섬유증 (CF)로 고통받는 개인의 가래에서 점액 콜로니의 절연은 만성 감염 나타낸다 직접 환자의 건강 하나의 전체적인 감소와 연관된다. 현재는 것이 이해된다 P.있는 알긴산의 규제 및 생산 녹농균은 주로 두 오페론에서 발생한다. 에서 알긴산 고분자의 합성 및 수출에 대한 책임이 있습니다 (조류 - alg8 - alg44 - algK - ALGE - algG - algX - algL - algI - algJ - - algF algD) 첫 번째는 12 유전자를 포함하는 알긴산 생합성 오페론이다 세포 environme에 페리 플라 즘NT 2-5. 두 번째 오페론은 대체 시그마 인자에게도 누군가 / T로 시작 mucA, mucB 및 MUCD 계속 유전자의 클러스터입니다. mucAB-D는 알긴산 생산 6-8의 부정적인 규제로 분류하는 동안 당신에게도 누군가 / T는, 긍정적 인 레귤레이터이다. 또한, 전사 등 ALGB, AlgQ, AlgR 및 RpoN 등의 규제뿐만 아니라, 전사 후 및 이화 억압 제어, 키나제 활성 (KinB) 및 intramembrane 단백질 분해에 의해 번역 후 변형은 또한 알긴산에 관여하는 것으로 밝혀졌다 규제 9-14.

pFAC로 알려진 미니 himar1의 트랜스포존 벡터는 원래 하버드 의과 대학 (15) 박사 Mekalanos '실험실에서 만들어졌습니다. pFAC 플라스미드는 두 개의 27 비트로의 반전 반복 중간에 겐타 마이신 저항 카세트 테이프 (aacC1 : 534 BP)에 의해 형벌 인자 (transposable element)로 구성되어, hyperact를 코딩하는 유전자선원 트랜스 포사 (16) 및 코딩하는 유전자 β-락타 마제 (BLA) (그림 1) 필자. DQ366300 13 : pFAC의 인자 (transposable element)의 시퀀스 정보는 GenBank 액 번호로 사용할 수 있습니다. pFAC에서, 역 PCR을 사용하여 염색체의 삽입 부위의 식별을 위해 사용된다 aacC1 유전자 뒤에 다중 클로닝 부위 (MCS)가있다. 미니 himar1의 트랜스포존을 사용하여 하나의 큰 장점은 특정 호스트 요인 트랜스 (돌연변이) 필요하지 않습니다이다. 또한, P.의 게놈에 걸쳐 발견 TA 디 뉴클레오티드 삽입 사이트의 높은 풍부가있다 녹농균. 각각의 게놈을, 예를 들어, TA 디 ​​뉴클레오티드 삽입 사이트는 PAO1에 94404과 100229 번 발생 (6264404 BPS, GenBank 액 번호 NC_002516.2) 및 PA14 (GenBank 등록 액세스 번호 NC_008463 6537648 BPS). 때문에 게놈, 미니 himar1에서 TA 디 뉴클레오티드의 풍요 트랜스포존 독성 유전자의 분석 및 고도로 조절되는 유전자에 특히 적합하다 고밀도 및 무작위 돌연변이 유발을 일으킬 수있다. 이론적으로, 미니 himar1의 트랜스포존은 P.의 게놈 내에서 중요하지 않은 유전자에 삽입 할 수있는 녹농균. 이 PAO1 게놈의 오픈 리딩 프레임 당 약 18 TA 삽입 사이트를 제공합니다.

여기, 우리는 P.에 mucoidy의 새로운 규제를 식별하는 미니 himar1의 트랜스포존 매개 돌연변이 유발을 사용하여 프로토콜을 설명 녹농균. 보다 구체적으로, 우리 biparentally E.부터 미니 himar1 트랜스포존을 함유 pFAC 벡터를 접합 nonmucoid prototrophic 변형 PAO1에 대장균 SM10/λpir. 트랜스포존은 게놈에 통합 된 후, 수신자 균주는 슈도모나스 분리 한천 E.의 성장을 억제 (PIA) 덴타에 배양 대장균. 따라서,의 돌연변이 체 라이브러리 P. 녹농균은 겐타 마이신 및 유 점액 표현형의 존재로 보충 PIA 접시에 성장에 의해 선택 될 수있다. 진정한 트랜스포존 매개 통합 돌연변이 대 겐타 마이신 내성 및 실린 민감한 표현형을해야합니다 유의하십시오. 본 연구에서는 PAO1 약 80,000 삽입 돌연변이 체는 네 개의 별도의 활용형을 분리 하였다. 우리는 그 점액 분리에 대한 검사를하고, 제한 효소 소화, 결찰 및 역 PCR에 의한 삽입의 위치를​​ 결정. 우리는 게놈 당 삽입의 수를 볼 프로브로 겐타 마이신 저항 카세트를 사용하여 서던 블롯 분석을 수행 하였다. 우리는이 프로토콜을 사용하여 접합 당 얻은 돌연변이의 90 % 이상이 게놈에 himar1의 단 하나의 사본을 가지고 있었고, 겐타 마이신 내성 및 실린 민감한 표현형을 표시 것으로 판단. 32 점액 분리의 총이 확인되었으며, 그 중 22 P.의 다른 궤적에 매핑 된 녹농균 PAO1염색체. 삽입이 비율은 알긴산 과잉 생산의 몇 가지 새로운 규제를 식별하기 위해 적절한 범위를 제공합니다.

프로토콜

1. 균주의 제조 및 Biparental 활용

  1. E.에게 접종 37 ℃에서 하룻밤 진탕 배양기에서 겐타 마이신과 장소의 15 ㎍ / ㎖로 보충 루리아 국물 (LB) 5 ㎖의 대장균 SM10/λpir/pFAC
  2. P.에게 접종 녹농균 변형 LB 5 ㎖의 PAO1, 그리고 흔들리는 인큐베이터에있는 장소 하룻밤 42 ℃에서
  3. OD 하룻밤 문화 (600)를 측정하고 PAO1와 E 같은 양을 혼합 콜라이 pFAC은 최종 부피는 1-1.4 ML 사이 그러한된다.
  4. 5 분 6,000 XG에 원심 분리기의 혼합물.
  5. 한편, 활용을 위해 LB 플레이트를 건조 : 10 ~ 15 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 열려있는 판을 둡니다.
  6. 세포 혼합물로부터 상층 액 50 μL를 제외한 나머지를 모두 제거합니다.
  7. 하나의 컴팩트 한 방울에 건조 LB 판에 뜨는 피펫의 나머지 50 μL의 세포 펠렛을 Resuspend.
  8. 조심스럽게 (IMPO 건조 흄 후드에서 플레이트를 배치RTANT 참고) 접시에 걸쳐 세포가이 크게 활용의 효율성을 감소 할 수 있도록하지 마십시오.
  9. 물방울이 건조되면, LB 플레이트를 거꾸로하고 4-6 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다.
  10. 세포 혼합물을 배양하는 동안, 겐타 마이신 300 μg / ㎖로 큰 (150 OD × 15 ㎜) PIA 판을 준비합니다. 사용하기 전에 15 ~ 20 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 배치하여 잔류 수분을 제거합니다.
  11. 세포 혼합액의 배양이 완료된 후, 멸균 접종 루프를 사용하여 세포를 수집하고 1 ㎖ LB와 소용돌이 또는 피펫을 함유하는 마이크로 원심 분리 튜브에서 충분히 섞고.
  12. 큰 PIA 플레이트가 300 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 포함에 균등하게 세포를 확산. (중요은 : 등), 500 μL 10 μL, 플레이트 2 : 50 μL, 플레이트 3 : 100 μL, 플레이트 4이 단계의 경우, 예를 들어 플레이트 1 (플레이트를 분리하는 세포 혼합물의 증가 볼륨을 추가하는 것이 가장 좋습니다 .
  13. 37에서 하룻밤을 품다° C.

2. 감지 및 점액 식민지의 분리

  1. 인큐베이터에서 접시를 제거하고 점액 식민지에 대한 검사.
  2. 작은 판 PIA 겐타 마이신 300 μg / ㎖로 (100 OD × 10 ㎜)에 격리에 대해 하나의 점액 식민지 행진을 분리합니다.
  3. 37 ℃에서 하룻밤 배양한다
  4. 이전 하룻밤 문화에 2.2 단계를 반복합니다.
  5. 반복 점액 분리의 안정성을 결정하기 위해 2.2-2.4 두 번 더 반복합니다.
  6. 최종 분리 단계 후, 하나의 점액 식민지와 LB의 4.5 ㎖를 접종하고 37 ℃에서 하룻밤 진탕 배양
  7. 다음날, 각 점액 돌연변이 레이블 3 마이크로 원심 튜브.
  8. 게놈 DNA의 추출 및 트랜스포존 삽입 부위의 식별을위한 2 관 (프로토콜 3 참조)에 하룻밤 문화의 두 1.25 ㎖를 분취를 준비합니다.
  9. 또한, appropriat에 1 ㎖ 하룻밤 문화를 피펫으로 각 점액 돌연변이를 보관10 % 탈지 우유를 동일 부피를 함유 엘리-표지 cryovial. -86 ° C.에 저장

3. gDNA를 제한 소화 및 결찰

  1. 어떤 선호하는 방법 (예를 들면. 페놀 - 클로로포름, 스핀 열 등)를 사용하여 점액 돌연변이 체에서 gDNA를 압축을 풉니 다.
  2. gDNA를의 농도를 결정, 제한 효소 SalI으로 2 μg 1 μL의 전체를 소화, 소 혈청 알부민, SalI로 효소 완충액 (100 mM의 염화나트륨, 50 mM 트리스 - 염산, 10 mM의 MgCl2를 5 μL의 0.5 μL , 1 mM의 Dithiothrietol (DTT), 실온에서 pH를 7.9) 및 50 μL의 총 부피를 달성하기 dH보다 2 O의 적절한 볼륨.
  3. 37 ℃에서 하룻밤 DNA 다이제스트 (중요 :. 제한 효소의 효율에 따라서는 하룻밤 다이제스트에 추가 1 μl를 추가하고 1 ~ 2 시간 동안 37 ° C에서 배양 할 필요가있다이 밤새 다이제스트에 추가됩니다.)
  4. DIGE 정화어떤 선호하는 방법 (예를 들어, 아가 로스 젤 정화, 스핀 열) 및 버퍼의 25 μL로 용출을 사용 STED DNA.
  5. ~ 10-20 NG / μL의 바람직한 농도, 라이 게이션 완충액 1.5 μL (330 mM 트리스 - 아세테이트 pH를 7.5, 660 mM의 아세트산 칼륨, 100 mM의 아세트산 마그네슘, 5 mm의 정제 된 DNA의 11 μL를 혼합하여 소화 DNA를 결찰 DTT), 100 mM의 ATP의 1.5 μL, 1 μL의 DNA 리가 아제.
  6. 실온에서 15 분 동안 혼합물을 부화 한 후 70 ℃에서 15 분 동안 배양하여 효소를 실활 (주 : 이상 동안 실온에서 혼합물을 배양하는 결찰의 성공을 증가시킬 수있다).

4. 역 PCR (iPCR을) 및 시퀀스 분석

  1. 앞으로 다음과 역방향 프라이머와 조건을 열 순환을 이용하여 결찰 제품에 iPCR을을 수행합니다 :
    - 포워드 프라이머 (Gm3OUT) : GGGCATACGGGAAGAAGTGA
    - 역방향 프라이머 (Gm5OUT) : GACTGCCCTGCTGCGTAACA
    열 순환기 콘돌리자tions :
    1. 1 분 동안 94 ° C에서.
    2. 1 분 동안 94 ° C에서.
    3. 2 분 동안 58 ° C에서.
    4. 2 분 72 ° C에서.
    5. 8 분 72 ° C에서.
    6. 10 ° C에서 개최.
    반복 34 회 2-4 단계를 반복합니다.
    (참고 : 증폭 된 iPCR 제품은 4 ℃에서 저장 될 수 있습니다)
  2. 성공하는 iPCR 증폭을 확인하는 아가로 오스 겔 전기 영동을 수행합니다.
  3. Gm3OUT 및 Gm5OUT 프라이머를 사용하는 iPCR 제품에 대한 시퀀싱을 수행합니다. 삽입 부위와 himar1의 방향이 밖으로 매핑됩니다.

결과

도 1에 도시 된 바와 같이, 미니 himar1 마리너 트랜스포존 벡터 pFAC는 TA 삽입 위치가 σ 70-의존성 프로모터 및 다중 클로닝 부위 (MCS)와 aacC1의 겐타 마이신 내성 카세트를 플 랭킹 두 27 bp의 반전이 반복을 포함한다. 또한, pFAC 벡터는 높은 활성 himar1의 트랜스 포사, β-락타 마제 (BLA) 및 육 차원 속의 전송 오페론을 코딩하는 유전자를 포함하고 있...

토론

또한이 방법은 이러한 변경과 다른 슈도모나스 종에서 사용할 수 있음을주의하는 것이 중요하다 : P.보기 부화 의 fluorescens와 P. 30 ° C에서 푸티하고, P. 42 ° C에서 stutzeri, P. stuzeri은 겐타 마이신 150 ㎍ / mL의 보충 LB 플레이트에서 배양되어야한다 단계 1.11, P.에 stutzeri 세포는 LB 500 ㎕를 대신 1 ㎖로 전송해야한다. 또한이 프로토콜에 대한 두 가지 중요한 단계?...

공개

저자 훙 웨이 D. 유 최고 과학 책임자 Progenesis 기술의 공동 설립자, LLC입니다.

감사의 말

이 작품은 바이오 메디컬 연구 우수 웨스트 버지니아 아이디어 네트워크에 미국 항공 우주국 웨스트 버지니아 공간 부여 컨소시엄 (NASA WVSGC), 낭포 성 섬유증 재단 (CFF-YU11G0)와 NIH P20RR016477 및 P20GM103434에 의해 지원되었다. 우리는이 작업과 기술 지원을 Vonya M. Eisinger 감사합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Luria BrothDifco240230via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation agarDifco292710via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm)Fisher Scientific08-757-13
Large Plates (150 O.D. x 15 mm)Fisher Scientific08-757-14
GlycerolFisher ScientificBP229-4
Benchtop Shaking IncubatorNew Brunswick ScientificInnova 4080shake at 200 rpm
Cabinet IncubatorVWR1540
Benchtop MicrocentrifugeSorvall75-003-287via Fisher Scientific
SmartSpec Plus SpectrophotometerBio-Rad170-2525or preferred method/vendor
Diposable Inoculation LoopsFisher Scientific22-363-597
1.5 ml Microcentrifuge TubesFisher Scientific05-408-129
2.0 ml Cryogenic VialsCorning430659via Fisher Scientific
15 ml TubesFisher Scientific05-539-12
Skim MilkDifcoDF0032-17-3via Fisher Scientific
DNeasy Blood and Tissue (250) Qiagen69506or preferred method/vendor
QIAquick PCR Purification Kit (250)Qiagen28106or preferred method/vendor
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen27106or preferred method/vendor
FastLink II DNA Ligation KitEpicentre TechnologiesLK6201Hvia Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath LabnetNC0205808via Fisher Scientific
Sal1, restriction endonucleaseNew England BioLabsR0138L
EasyStart Micro 50Molecular BioProducts6020via Fisher Scientific
Taq DNA PolymeraseNew England BioLabsM0267L
iCycler, ThermocyclerBio-Rad170-8740
LE agaroseGenemate3120-500via Fisher Scientific
Gentamycin SulfateFisher ScientificBP918-1
2.0 ml Cryogenic VialsCorning430659via Fisher Scientific

참고문헌

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