Идентификация новых генов, ассоциированных с альгината производства в<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; Использование мини-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner транспозонов-опосредованного мутагенеза

Резюме

Здесь мы опишем протокол, используя мини-himar1 моряка транспозонов-опосредованной мутагенеза для генерации вставки высокой плотности мутантный библиотеку для экрана, изолировать и идентифицировать новые регуляторы альгината в прототипического синегнойной палочки штамма PAO1.

Аннотация

Синегнойная палочка является грамотрицательная, окружающей бактерию с универсальными метаболических возможностей. П. палочки является оппортунистической бактериальный патоген, который устанавливает хронические легочные инфекции у пациентов с кистозным фиброзом (CF). Перепроизводство в капсульного полисахарида под названием альгинат, также известный как mucoidy, способствует образованию слизистых биопленок, которые более устойчивы, чем планктонных клеток к химиотерапии антибиотиков и защитных сил организма. Кроме того, переход от nonmucoid к слизистой фенотипа является клиническим маркером наступления хронической инфекции в CF. Альгинат перепроизводство через Р. палочки является эндергонических процесс, который облагает большими налогами клеточной энергии. Таким образом, альгинат производство жестко регламентируется в P. палочки. Чтобы лучше понять, альгинат регулирование, мы опишем протокол с помощью мини-himar1 транспозонов мутагенеза для идентификации нового регулятора альгинатас в прототипического штамма PAO1. Процедура состоит из двух основных этапов. Во-первых, мы передали мини-himar1 транспозон (pFAC) от принимающей Е. палочка SM10/λpir в получателя P. палочки PAO1 через biparental сопряжения для создания вставки высокой плотности мутантный библиотеку, которые были отобраны на Pseudomonas изоляция пластин агара с добавлением гентамицина. Во-вторых, мы провели скрининг и изолировали слизистая колонии для отображения место введения посредством обратного ПЦР с использованием праймеров ДНК, указывающие наружу из кассеты гентамицина и секвенирования ДНК. Используя этот протокол, мы определили два новых регуляторов альгинат, mucE (PA4033) и kinB (PA5484), в штамм PAO1 с дикого типа Muca кодирующий фактор анти-сигма Muca для мастер-регулятора альгината AlgU (ALGT, σ ²²⁾ . Этот протокол мутагенеза высокой пропускной могут быть изменены для идентификации других генов вирулентности связанных вызывает изменения в колоNY морфология.

Введение

Способность оппортунистической, грамотрицательных патогенов синегнойной палочки перепроизводства альгинат является основным фактором в его способности установить биопленку. Перепроизводство альгинат представляет собой фенотип часто называют mucoidy. Изоляция слизистых колоний от мокрота лиц, страдающих муковисцидозом (CF) свидетельствует о хронической инфекции, и непосредственно связана с общим снижением здоровья пациента ^1. В настоящее время, следует понимать, что регулирование и производство альгината в P. палочки в первую очередь происходит в двух оперонов. Первым из них является альгинат биосинтеза оперона, который содержит 12 генов (algD - alg8 - alg44 - algK - ALGE - algG - algX - algL - Algi - algJ - algF - водоросль), которые отвечают за синтез и экспорта альгината полимера через периплазму с внеклеточным Environmeнт ^2-5. Второй оперона является кластер генов начиная с альтернативной фактора сигма algU / T и продолжая Muca, mucB и mucD. AlgU / T является положительным регулятором, в то время как mucAB-D классифицируются как негативных регуляторов альгината производства ^6-8. Кроме того, регуляторы транскрипции, такие как ALGB, AlgQ, AlgR и RpoN, а также пост-транскрипционного и пост-трансляционной модификации по катаболитной контроля репрессий, активности киназы (KinB) и внутримембранного протеолиза, также было показано, участвует в альгината регулирование ^9-14.

Мини-himar1 транспозонов вектор известен как pFAC была создана в лаборатории доктора Mekalanos 'в Гарвардской медицинской школе ^15. PFAC плазмида состоит из мобильных элементов между двух инвертированных повторов из 27 бит и гентамицина кассеты сопротивления в середине (aacC1: 534 п.н.), ген, кодирующий hyperactив моряка транспозазу ¹⁶ и ген, кодирующий β-лактамазы (бла) (рис. 1). Информация о последовательности для мобильных элементов из pFAC доступна на номер доступа GenBank: DQ366300 ^13. В pFAC, существует сайт множественного клонирования (MCS) за гена aacC1, который используется для идентификации месте установки хромосомной с помощью обратной ПЦР. Одно из главных преимуществ с помощью мини-himar1 транспозон никаких конкретных факторы хозяина не требуется для транспозиции (мутагенеза). Кроме того, существует высокая обилие динуклеотид сайтов вставки TA найденных во всем геноме P. палочки. Например, TA сайты встраивания динуклеотида происходит 94404 и 100229 раз в PAO1 (6264404 бит, GenBank номер доступа NC_002516.2) и PA14 (6537648 бит; номер доступа GenBank NC_008463) геномов, соответственно. Из-за обилия динуклеотида TA в геноме, мини-himar1 Транспозона могут привести к высокой плотности и случайного мутагенеза, который является особенно подходящим для анализа генов вирулентности и генов, которые высоко регулируемых. Теоретически, мини-himar1 транспозона можно вставить в любой несущественным гена в геноме P. палочки. Это обеспечивает приблизительно 18 участков вставки TA на открытой рамки считывания в PAO1 генома.

Здесь мы опишем протокол с помощью мини-himar1 транспозонов-опосредованной мутагенеза для идентификации новых регуляторов mucoidy в P. палочки. В частности, мы biparentally конъюгировали вектор pFAC содержащий мини-himar1 транспозон от Е. палочка SM10/λpir в nonmucoid прототрофным штамма PAO1. После транспозона интегрирован в геном штамма получатель культивировали на агаре Pseudomonas изоляции (PIA), содержащих триклозан, который ингибирует рост E. палочка. Таким образом, библиотека мутантов П. палочки могут быть выбраны по росту на PIA пластины с добавлением гентамицина и наличием слизистого фенотипа. Обратите внимание, что истинный транспозонов-опосредованной против интеграционного мутанта будет иметь фенотип, устойчивый и карбенициллина чувствительных гентамицин. В этом исследовании, около 80 тысяч вставки мутанты PAO1 были выделены через четыре отдельных сопряжений. Затем мы скрининг на слизистых изолятов, и определяется место вставки по ферментами рестрикции, лигирования и обратной ПЦР. Мы провели блот анализ с использованием гентамицина кассету сопротивления в качестве зонда, чтобы увидеть количество вставки на геном. Мы решили, что более 90% из полученных мутантов за сопряжения с помощью этого протокола было только одну копию himar1 в геноме и отображается на фенотип, устойчивый и карбенициллина чувствительных гентамицин. В общей сложности 32 мукоидных изолятов были определены, 22 из них были нанесены на карту к разным локусов P. палочки PAO1хромосома. Этот показатель вставки обеспечивает адекватного охвата определить несколько новых регуляторов альгината перепроизводства.

протокол

1. Подготовка бактериальных штаммов и Biparental Сопряжение

1. Привить E. палочка SM10/λpir/pFAC в 5 мл Лурия бульон (LB) с добавлением 15 мкг / мл гентамицина и место дрожащим инкубаторе в течение ночи при 37 ° С
2. Привить P. палочки штамма PAO1 в 5 мл LB, и место в дрожащей инкубаторе в течение ночи при 42 ° С
3. Измерьте OD ₆₀₀ из ночных культур и смешать равные количества PAO1 и Е. палочка pFAC таким образом, что конечный объем составляет от 1-1,4 мл.
4. Центрифуга смесь при 6000 мкг в течение 5 мин.
5. Между тем, сухой LB пластины для конъюгации: оставить открытыми пластин в инкубаторе при 37 ° С в течение 10-15 мин.
6. Удалить все, кроме 50 мкл супернатанта из смеси клеток.
7. Ресуспендируют осадок клеток в остальных 50 мкл супернатанта и пипетки на сухую LB пластины в одном компактном капли.
8. Осторожно поместите пластину в вытяжном шкафу для просушки (IMPORTANT Примечание: Не позволяйте клетки распространяются по пластине, это значительно снижает эффективность сопряжения).
9. После того, как капли сухой, инвертировать LB пластины и инкубировать при 37 ° С в течение 4-6 часов.
10. В то время как смесь клеток инкубации, подготовить большое (150 OD х 15 мм) PIA пластины с 300 мкг / мл гентамицина. Перед использованием удаления остаточной влаги, поместив в термостате при 37 ° С в течение 15-20 мин.
11. После инкубации смеси клеток завершена, сбора клеток с использованием стерильного прививки петли и в микроцентрифужных трубки, содержащей 1 мл LB и вихрь, или пипетку, чтобы тщательно перемешать.
12. Распространение клетки равномерно на большой PIA пластины содержат 300 мкг / мл гентамицина. (ВАЖНО: Для этого шага, то лучше добавить возрастающих объемов смеси клеток, чтобы отделить пластины (например, плиты 1: 10 мкл, плиты 2: 50 мкл, плиты 3: 100 мкл, плиты 4: 500 мкл, и т.д.) .
13. Выдержите в течение ночи при 37° C.

2. Обнаружение и выделение слизистая колоний

1. Удалить пластины из инкубатора и изучить для слизистых колоний.
2. Изолировать один слизистая колонию и полоса для изоляции на небольших пластин (100 OD х 10 мм) с PIA и 300 мкг / мл гентамицина.
3. Выдержите в течение ночи при 37 ° С
4. Повторите шаг 2.2 на предыдущей ночной культуры.
5. Повторите шаги 2.2-2.4 два более раз, чтобы определить устойчивость слизистой изолята.
6. После конечной стадии изолята, инокуляции 4,5 мл LB с одним слизистые колонии и инкубировать в шейкере в течение ночи при 37 ° С.
7. На следующий день, этикетка 3 микроцентрифужные пробирки для каждого мукоидного мутанта.
8. Приготовьте два 1,25 мл аликвоты ночной культуры на 2 трубы для геномной выделения ДНК и идентификации месте введения транспозонов (см. протокол 3).
9. Кроме того, архив каждый слизистая мутанта с помощью пипетки 1 мл ночной культуры в appropriatEly меченных криопробирку содержащий равный объем 10% обезжиренного молока. Хранить при -86 ° С.

3. гДНК Ограничение Пищеварение и перевязка

1. Выписка гДНК от мукоидного мутанта, используя любой предпочтительный способ (например,. Фенол-хлороформ, спин колонки и т.д.).
2. Определить концентрацию гДНК, переварить в общей сложности 2 мкг с 1 мкл рестриктазы SalI, 0,5 мкл бычьего сывороточного альбумина, 5 мкл фермента SalI буфера (100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl ₂ , 1 мМ Dithiothrietol (DTT), рН 7,9 при комнатной температуре), и соответствующий объем дН ₂ O для достижения общего объема 50 мкл.
3. Дайджест ДНК в течение ночи при 37 ° С (ВНИМАНИЕ:. В зависимости от эффективности фермента рестрикции, это может быть необходимо добавить дополнительный 1 мкл в течение ночи дайджеста и инкубируют при 37 ° С в течение 1-2 ч. Это в дополнение к ночной дайджеста).
4. Очищают DigeSTED ДНК с помощью любого предпочтительный способ (например, агарозном очистки гель, спин колонок) и элюирования с 25 мкл буфера.
5. Лигируют с расщепленной ДНК смешиванием 11 мкл очищенной ДНК с предпочтительным концентрации ~ 10-20 нг / мкл, 1,5 мкл буфера дл лигировани (330 мМ Трис-ацетат, рН 7,5, 660 мМ ацетата калия, 100 мМ ацетат магния, 5 мМ ДТТ), 1,5 мкл 100 мМ АТФ и 1 мкл ДНК-лигазы.
6. Выдержите смесь в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем инактивации фермента путем инкубации в течение 15 мин при 70 ° С (Примечание: инкубирования смеси при комнатной температуре в течение дольше может увеличить успех лигирования).

4. Обратная ПЦР (IPCR) и Анализ последовательности

1. Выполните IPCR на перевязки продукта с использованием следующих прямого и обратного праймеров и термоциклировании условия:
   -Прямой праймер (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
   -Обратный праймер (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
   Термоциклеры Кондизаказчиком:
   1. 94 ° С в течение 1 мин.
   2. 94 ° С в течение 1 мин.
   3. 58 ° C в течение 2 мин.
   4. 72 ° С в течение 2 мин.
   5. 72 ° С в течение 8 мин.
   6. 10 ° C удержания.
   Повторите шаги 2-4 для 34 циклов.
   (ПРИМЕЧАНИЕ: продукты Усиленный IPCR можно хранить при 4 ° С)
2. Выполнение электрофореза в агарозном геле, чтобы подтвердить успешной амплификации IPCR.
3. Выполните последовательности от продукта IPCR использованием праймеров Gm3OUT и Gm5OUT. Сайт вставки и ориентация himar1 которые наметили.

Результаты

Как показано на рисунке 1, мини-himar1 моряк транспозонов вектор, pFAC, содержит два 27 б.п. инвертированные повторы с сайты встраивания TA фланговые сопротивления кассету aacC1 гентамицин, с его σ ^{70-зависимого} промотора, и сайтом множественного клонирования (MCS). Кроме тог...

Обсуждение

Важно отметить, что этот метод может быть использован в других видов Pseudomonas с этими изменениями: инкубировать P. флуоресцирующей и П. putida при 30 ° С и P. stutzeri при 42 ° С; П. stuzeri должны быть культивированы на LB пластины с добавлением 150 мкг / мл гентамицина; на шаге 1,11, P. ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luria Broth	Difco	240230	via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation agar	Difco	292710	via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-13
Large Plates (150 O.D. x 15 mm)	Fisher Scientific	08-757-14
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-4
Benchtop Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	Innova 4080	shake at 200 rpm
Cabinet Incubator	VWR	1540
Benchtop Microcentrifuge	Sorvall	75-003-287	via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	or preferred method/vendor
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
1.5 ml Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
2.0 ml Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific
15 ml Tubes	Fisher Scientific	05-539-12
Skim Milk	Difco	DF0032-17-3	via Fisher Scientific
DNeasy Blood and Tissue (250)	Qiagen	69506	or preferred method/vendor
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	or preferred method/vendor
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	or preferred method/vendor
FastLink II DNA Ligation Kit	Epicentre Technologies	LK6201H	via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Sal1, restriction endonuclease	New England BioLabs	R0138L
EasyStart Micro 50	Molecular BioProducts	6020	via Fisher Scientific
Taq DNA Polymerase	New England BioLabs	M0267L
iCycler, Thermocycler	Bio-Rad	170-8740
LE agarose	Genemate	3120-500	via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP918-1
2.0 ml Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific