Alginat içinde üretimi ile ilişkili yeni genlerin tanımlanması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emKullanma&gt; Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon dolayımlı mutagenez

Özet

Burada, ekrana yüksek yoğunluklu ekleme mutant kütüphanesi oluşturmak için mini-transpozon himar1 mariner dolayımlı mutagenez kullanılarak bir protokol açıklar izole edilmesi ve prototipik Pseudomonas aeruginosa'nın PAO1 in yeni alginat regülatörleri belirlemek.

Özet

Pseudomonas aeruginosa yönlü metabolik yetenekleri olan bir Gram-negatif, çevresel bir bakteridir. P. aeruginosa kistik fibrozis (KF) hastalarda, kronik akciğer enfeksiyonları kuran bir fırsatçı bakteriyel patojendir. Ayrıca Mukus olarak bilinen alginat adlandırılan bir kapsüler polisakarit, bir aşırı antibiyotik kemoterapi ve bir ev sahibi savunma için planktonik hücrelerden daha fazla dirençli olan mukoid biyofilm oluşumunu teşvik eder. Buna ek olarak, sümüksü fenotipine nonmucoid gelen dönüşüm CF kronik enfeksiyonun başlaması için klinik bir belirteçtir. P. Alginate aşırı aeruginosa ağır hücresel enerji vergileri bir endergonic süreçtir. Bu nedenle, aljinat üretimi son derece P. düzenlenir aeruginosa. Alginat düzenleme daha iyi anlamak için, yeni bir aljinat regülatörü tanımlanması için mini-himar1 transposon mutagenez kullanılarak bir protokol açıklarbir prototipi gerginlik PAO1 s. Prosedürü iki temel aşamadan oluşmaktadır. İlk olarak, konakçı E. mini himar1 transpozonunda (pFAC) transfer alıcı P. içine coli SM10/λpir gentamisin ile takviye edilmiş Pseudomonas izolasyon agar levhaları üzerinde seçilmiştir, yüksek yoğunluklu bir ekleme mutant kütüphanesi oluşturmak için biparental konjügasyon yoluyla aeruginosa PAO1. İkincisi, biz ekranlı ve gentamisin kaset ve DNA dizilimi dışa dönük DNA primerleri kullanılarak ters PCR yoluyla ekleme sitesi haritasına mukoid koloniler izole. Bu protokolü kullanarak, ⁽²² σ AlgT,) bir vahşi tip muca ana aljinat regülatör Algü için anti-sigma faktörü muca kodlayan ile gerginlik PAO1 iki roman aljinat regülatörleri, muce (PA4033) ve kinB (PA5484) belirledik . Bu, yüksek verimli mutajenez protokolü Colo değişime neden olan diğer hastalık oluşturma ilişkili genlerin tanımlanması için değiştirilebilirny morfolojisi.

Giriş

Alginat fazla üretmek için fırsatçı, Gram-negatif patojen Pseudomonas aeruginosa yeteneği bir biyofilm kurma yeteneğinde önemli bir faktördür. Alginatm aşırı üretimi genellikle Mukus adlandırılan bir fenotip. Kistik fibroz (CF) ile tutulmuş bireylerin balgam numune sümüksü koloni izolasyonu kronik enfeksiyonun göstergesidir ve doğrudan hastanın sağlığına ^{1 'de} genel bir azalma ile ilişkilidir. Şu anda, bu anlaşılmaktadır P. aljinat düzenleme ve üretimi aeruginosa öncelikle iki operonlar oluşur. Arasında aljinat polimerin sentezi ve ihracat sorumludur (Alga - alg8 - alg44 - algK - alge - algG - algX - algL - Algı - algJ - - algF algD) ilk 12 genleri içeren aljinat bio-sentetik operonu, bir hücre dışı environme için periplazmant ^2-5. İkinci operonu alternatif sigma faktörü Algü / T ile başlayan ve Muca, mucB ve mucD devam genlerin bir kümesidir. MucAB-D aljinat üretimi ^6-8 negatif düzenleyicileri olarak sınıflandırılır ise Algü / T, pozitif bir düzenleyicisidir. Buna ek olarak, bu tür transkripsiyonel AlgB, AlgQ, Algr ve rpoN olarak düzenleyiciler, yanı sıra, transkripsiyon sonrası katabolik baskı ve kontrol, kinaz aktivitesi (KinB) ve zar içi proteoliz ile post-translasyonel değişikliği, aynı zamanda alginat dahil olmak gösterilmiştir düzenleme ^9-14.

PFAC olarak bilinen mini himar1 transpozonunun vektör aslında Harvard Tıp Fakültesi'nde ¹⁵ Dr Mekalanos 'laboratuarda yaratılmış. PFAC plasmidi, iki 27 baz arasında ters çevrilmiş tekrarlar ve ortasında bir gentamisin direnç kaseti (aacC1: 534 bp) ile çevrili bir transpoze edilebilir elemanın oluşur hyperact kodlayan bir genmariner transposaz ¹⁶ ve bir gen kodlayan β-laktamaz (bla) (Şekil 1) ive. DQ366300 ^13: pFAC ve transpoze edilebilir eleman için sekans bilgileri, GenBank erişim numarası mevcuttur. PFAC olarak, ters PCR kullanılarak kromozomal sokma yerinin tanımlanması için kullanılan aacC1 geni arkasındaki bir çoklu klonlama bölgesinin (MCS) bulunmaktadır. Mini himar1 transpozonunda kullanarak önemli bir avantajı belirli bir konak faktörleri aktarılması (mutagenez) için gerekli olmasıdır. Ayrıca, P. genom genelinde bulunan TA dinükleotid ekleme siteleri yüksek bolluk var aeruginosa. Sırasıyla, genomları, örneğin, TA dinükleotid ekleme siteleri PAO1 yılında 94.404 ve 100.229 kez oluşur (6264404 bps, GenBank erişim numarası NC_002516.2) ve PA14 (GenBank erişim numarası NC_008463 6537648 bps). Çünkü genom, mini himar1 TA dinükleotidin bolluğu Transpozon hastalık oluşturma genlerin analizi ve son derece düzenlenir genleri için özellikle uygun olan yüksek yoğunluklu ve rasgele mutagenezi, neden olabilir. Teorik olarak, mini-transpozon himar1 P. genomu içinde herhangi bir gerekli olmayan gen içine entegre olabilir aeruginosa. Bu, PAO1 genomuna açık okuma çerçevesinin başına yaklaşık 18 TA ekleme bölgelerini içerir.

Burada, P. Mukus sahip yeni regülatörleri belirlemek için bir mini transpozon himar1 dolayımlı mutagenez kullanılarak bir protokol açıklar aeruginosa. Daha özel olarak, E. biparentally bir mini transpozon içeren himar1 pFAC vektör konjüge nonmucoid prototrofik suşu PAO1 içine coli SM10/λpir. Transpozon genomuna entegre sonra, alıcı suşu Pseudomonas izolasyon agar E büyümesini inhibe eder (PIA) triklosan ihtiva eden kültürlenir coli. Dolayısı ile de, mutantlarının bir kütüphane P. aeruginosa gentamisin ve mukoid fenotip varlığı ile takviye PIA plakası üzerindeki büyüme ile seçilebilir. Gerçek bir transpozon aracılı entegrasyon mutantın genel bir gentamisin dirençli ve karbenisilin duyarlı fenotipe sahip olacaktır, dikkat edin. Bu çalışmada, PAO1 yaklaşık 80,000 sokma mutantlan dört ayrı çekimleri ile izole edilmiştir. Daha sonra sümüksü izolatları için tarandı ve kısıtlayıcı enzim sindirimi, ligasyon ve ters PCR ile ek bölgesine tespit edilmiştir. Bu genom başına ekleme sayısının görmek için bir prob olarak gentamisin direnç kasedi kullanılarak Southern blot analizi yapıldı. Bu protokol kullanılarak konjugasyon başına elde mutantlarının fazla% 90 genomunda himar1 sadece tek bir kopyasına sahip ve gentamisin dirençli ve karbenisilin duyarlı fenotip gösterdiği tespit edilmiştir. 32 sümüksü izolat toplam tespit edilmiştir, bunlardan 22 P. farklı loci eşleştirilmiş aeruginosa PAO1kromozom. Yerleştirme Bu oran aljinat aşırı birkaç yeni regülatörleri tanımlamak için yeterli kapsama alanı sağlar.

Protokol

1.. Bakteriyel Suşlarında hazırlanması ve Biparental Konjugasyon

1. E. aşılamak 37 ° C'de gece boyunca bir çalkalama inkübatöründe gentamisin ve yerine 15 ug / ml 'si ile desteklenen Luria Broth'ta (LB), 5 ml coli SM10/λpir/pFAC
2. P ismi aşılamak aeruginosa ırk LB 5 ml PAO1 ve bir çalkalama inkübatör içinde bir gece boyunca bir yer 42 ° C
3. OD gecede kültürlerin ₆₀₀ ölçmek ve PAO1 ve E. eşit miktarda karıştırın coli pFAC son hacim 1-1.4 ml arasında olduğu şekilde.
4. 5 dakika boyunca 6000 x g'de santrifüjleyin karışımı ile gerçekleştirilmektedir.
5. Bu arada, konjugasyon için LB plakaları kuru: 10-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübatör içinde açık plakaları bırakın.
6. Hücre karışımından süpernatan 50 ul ama çıkarın.
7. Tek bir küçük damlacık kuru LB plakası üzerine yüzer ve pipet kalan 50 ul hücre pelletini.
8. Dikkatle (impo kuruması için bir davlumbaz plaka koyunRTANT Not:) plaka yayılmış hücreler, bu anlamlı konjugasyon etkinliğini azaltacaktır izin vermeyin.
9. Damlacık kuruduktan sonra, LB plaka ters çevirin ve 4-6 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
10. Hücre karışımı inkübe edilirken, gentamisin, 300 ug / ml 'si ile büyük (150 OD x 15 mm) PIA plakaları hazırlar. Kullanmadan önce, 15-20 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatör içinde yerleştirilerek kalan nemi çıkarmak.
11. Hücre karışımının kuluçka tamamlandıktan sonra steril bir aşılama döngü kullanarak hücreleri toplamak ve 1 ml LB ve girdap veya pipet ihtiva eden bir mikrosantrifüj tüpü içinde, iyice karıştırın.
12. Büyük PIA levhalar 300 ug / ml gentamisin içeren hücreleri üzerine düzgün biçimde yayılmış. (ÖNEMLİ: vb), 500 ul: 10 ul, Levha 2: 50 ul, Levha 3: 100 ul, Plate 4 Bu adım için, bu örneğin Plate 1 (plakalarını ayırmak için hücre karışımı hacimleri artmaktadır eklemek için en iyi .
13. 37 ° C'de gece boyunca inkübe° C.

2. Algılama ve Mucoid Kolonileri İzolasyonu

1. Inkübatör plakaları kaldırmak ve mukoid koloniler için inceleyin.
2. Küçük tabaklar PIA ve gentamisin'den 300 ug / ml (OD 100 x 10 mm) üzerine, izolasyonu için tek bir koloni sümüksü ve çizgi izole edin.
3. 37 ° C de bir gece inkübe
4. Önceki gecede kültüre adımı 2.2 tekrarlayın.
5. Tekrar mukoid izolatın stabilitesini belirlemek için 2.2-2.4 adımları iki kere daha.
6. Nihai izole aşamasından sonra, tek bir koloni ile sümüksü LB 4,5 ml aşılamak ve 37 ° C'de gece boyunca çalkalayıcıda inkübe
7. Ertesi gün, her mükoid mutant için etiket 3. mikrosantrifüj tüpleri.
8. Genomik DNA ekstre etme ve transpozon ekleme sitesinin tanımlanması için 2 boruların (Protokol: 3) içine bir gece boyunca kültür iki 1.25 ml'lik numuneler hazırlayın.
9. Ayrıca, bir appropriat içine 1 ml gecede kültür pipetleyerek her mukoid mutant arşivi% 10 kaymağı alınmış süt ihtiva eden eşit hacimde ely etiketli cryovial. -86 ° C'de saklayın

3. gDNA sınırlama sindirimi ve ligasyon

1. Istediğiniz yöntemi (örn.. Fenol-kloroform, spin kolon, vb) kullanılarak sümüksü mutanta gDNA ayıklayın.
2. GDNA konsantrasyonunu belirlemek, sınırlama endonükleaz SalI 2 ug ile 1 ul bir toplam sindirmek, büyükbaş hayvan serum albümini, Sall enzim tamponu (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI, 10 mM _MgCI2, 5 ul 0.5 ul , 1 mM Dithiothrietol (DTT), oda sıcaklığında pH 7.9), 50 ul toplam hacim elde etmek dH ₂ O uygun hacmi.
3. 37 ° C de bir gece DNA Digest (Dikkat:. Kısıtlama enzimi verimliliğine bağlı olarak, bir gece boyunca sindirmek için ek bir 1 ul ekleyin ve 1-2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe etmek gerekli olabilir Bu, bir gece boyunca özetle ek olarak).
4. Dige arındırınHer tercih edilen bir yöntem (örneğin, agaroz jel saflaştırma spin kolonları) ve tamponun 25 ul ile elüte kullanılarak sted DNA.
5. ~ 10-20 ng / ul tercih edilen bir konsantrasyon, ligasyon tamponu, 1.5 ul (330 mM Tris-asetat pH 7.5, 660 mM potasyum asetat, 100 mM magnezyum asetat, 5 mM ile saflaştırılmış DNA 11 ul karıştırılması ile sindirilmiş DNA ligate DTT), 100 mM ATP, 1.5 ul, 1 ul DNA ligaz.
6. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe karışımı, ve daha sonra 70 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edilerek enzimi inaktive (Not: daha uzun süre oda sıcaklığında karışımın, ligasyon başarısını arttırabilir.)

4. Ters PCR (RAPD'yi) ve Dizi Analizi

1. Ileri ve geri primerler aşağıdaki ve koşulları termodöngüleme kullanarak ligasyonu ürün üzerinde IPCR gerçekleştirin:
   -İleri Primer (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
   -Ters Primer (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
   Termosikler Condiular:
   1.. 1 dakika boyunca 94 ° C.
   2. 1 dakika boyunca 94 ° C.
   3. 2 dakika süreyle 58 ° C.
   4. 2 dakika boyunca 72 ° C.
   5. 8 dakika boyunca 72 ° C.
   6. 10 ° C tutun.
   Tekrar 34 döngüleri için 2-4.
   (NOT: AMPLİFİYE RAPD'yi ürünler 4 ° C'de saklanabilir)
2. Başarılı RAPD'yi amplifikasyon onaylamak için agaroz jel elektroforezi gerçekleştirin.
3. Gm3OUT ve Gm5OUT primerleri kullanılarak RAPD'yi ürün üzerinde sıralama yapmak. Ekleme site ve himar1 yönünü dışarı eşleştirilir.

Sonuçlar

Şekil 1 'de gösterildiği gibi, mini-transpozon himar1 mariner vektörü, pFAC, TA yerleştirme siteleri ile σ ⁷⁰ bağımlı promoteri ve bir çok klonlama bölgesinin (MCS) ile aacC1 gentamisin direnç kasedi komşu olan iki 27 bp ters çevrilmiş tekrar içerir. Buna ek olarak, vektör pFAC yüksek ölçüde aktif himar1 transposaz, β-laktamaz (bla) ve tra aktarma operon'u şifreleyen genleri içerir. TA yerleştirme siteleri P.

Tartışmalar

Bu yöntem, bu değişiklikler ile başka Pseudomonas türleri de kullanılabileceğini belirtmek önemlidir: K. inkübe fluorescens ve P. 30 ° C'de putida ve P. 42 ° C 'de stutzeri, P. stutzeri gentamisin 150 ug / mL 'si ile takviye edilmiş LB levhaları üzerinde kültür olmalıdır; adım 1.11, P. stutzeri hücreler LB 500 ul yerine 1 ml transfer edilmelidir. Ayrıca, bu protokol için iki kritik adımlar vardır. İlk olarak, al?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luria Broth	Difco	240230	via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation agar	Difco	292710	via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-13
Large Plates (150 O.D. x 15 mm)	Fisher Scientific	08-757-14
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-4
Benchtop Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	Innova 4080	shake at 200 rpm
Cabinet Incubator	VWR	1540
Benchtop Microcentrifuge	Sorvall	75-003-287	via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	or preferred method/vendor
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
1.5 ml Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
2.0 ml Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific
15 ml Tubes	Fisher Scientific	05-539-12
Skim Milk	Difco	DF0032-17-3	via Fisher Scientific
DNeasy Blood and Tissue (250)	Qiagen	69506	or preferred method/vendor
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	or preferred method/vendor
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	or preferred method/vendor
FastLink II DNA Ligation Kit	Epicentre Technologies	LK6201H	via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Sal1, restriction endonuclease	New England BioLabs	R0138L
EasyStart Micro 50	Molecular BioProducts	6020	via Fisher Scientific
Taq DNA Polymerase	New England BioLabs	M0267L
iCycler, Thermocycler	Bio-Rad	170-8740
LE agarose	Genemate	3120-500	via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP918-1
2.0 ml Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific