JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ووصف طريقة لتنقية فعالة من البروتينات الانصهار المزدوج بكتيريا الموسومة والمجمعات الخاصة على تعديل streptavidin (بكتيريا-Tactin) الراتنج تساهميا عبر ربط مع مكرر (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3). أسلوب لديها مزايا السرعة، وحسن الانتعاش البروتين الهدف ونقاء عالية، ومتوافق مع تحليل لاحقة من قبل مطياف الكتلة.

Abstract

أصبحت تنقية تقارب من البروتينات الانصهار بكتيريا الموسومة على راتنجات يحمل streptavidin هندسيا (بكتيريا-Tactin) طريقة تستخدم على نطاق واسع لعزل المجمعات البروتين في ظل الظروف الفسيولوجية. البروتينات الانصهار تحتوي على نسختين من بكتيريا علامة الثاني، المعين المزدوج بكتيريا علامة أو علامة SIII، لديها ميزة أعلى النسب للبكتيريا-Tactin مقارنة مع تلك التي تحتوي على واحد فقط بكتيريا البطاقات، مما يسمح تنقية البروتين أكثر فعالية. ومع ذلك، ويقابل هذه الميزة من حقيقة أن شطف من البروتينات المزدوج بكتيريا الموسومة مع البيوتين قد تكون غير مكتملة، مما أدى إلى انخفاض الانتعاش البروتين. الانتعاش يمكن تحسنت بشكل كبير باستخدام تغيير طبيعة شطف مع دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)، ولكن هذا يؤدي إلى تلوث عينة مع بكتيريا-Tactin صدر من الراتنج، مما يجعل الفحص يتعارض مع تحليل البروتين المصب. للتغلب على هذا القيد، قمنا بتطوير طريقة tetramer حيث يقترن الراتنج من بكتيريا-Tactinواستقرت أول من التساهمية عبر ربط مع مكرر (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) ثم يستخدم الناتجة الراتنج عبر ربط لتنقية البروتين المجمعات المستهدفة في خطوة تنقية دفعة واحدة. شطف كفاءة مع SDS يضمن الانتعاش البروتين جيدة، في حين أن غياب بكتيريا تلوث-Tactin يسمح تحليل البروتين المصب بواسطة مطياف الكتلة. كدليل على المفهوم، ونحن هنا وصف بروتوكول لتنقية البروتين الفيروسي SIII الموسومة VPG-Pro من نوى N. المصابة بالفيروسات النباتات benthamiana باستخدام الراتنج polymethacrylate بكتيريا-Tactin مرتبطة مع الصليب BS3. البروتوكول نفسه يمكن أن تستخدم لتنقية البروتين أي التوأم بكتيريا الموسومة المصالح وتميز شركائها ملزمة الفسيولوجية.

Introduction

في السنوات الأخيرة، أصبحت التكنولوجيا بكتيريا البطاقات المستخدمة على نطاق واسع في العديد من مجالات البحوث الطبية الحيوية، بما في ذلك البروتينات وعلم الأحياء الهيكلي. هذه التكنولوجيا لتنقية البروتين، والذي يعتمد على مزيج من البروتينات المؤتلف لفترة قصيرة بكتيريا علامة الببتيد، قد نضجت مع ظهور المصفوفات تقارب تحمل بكتيريا-Tactin، وهو البديل المعدلة وراثيا من streptavidin مع تحسين القدرات ملزمة الببتيد. 1، 2 البروتينات الانصهار تحتوي على نسختين من بكتيريا علامة الثاني، المعين المزدوج بكتيريا علامة أو علامة SIII، المعرض تقارب أعلى للمصفوفات بكتيريا-Tactin من تلك التي تحتوي على واحد فقط بكتيريا علامة، وضمان تنقية أكثر كفاءة من البروتينات المؤتلف و شركاء ملزمة المرتبطة بها. ومع ذلك، فإن تقارب أعلى من البروتينات المزدوج بكتيريا الموسومة إلى بكتيريا-Tactin ديها أيضا سلبيات. شطف التنافسية لهذه البروتينات مع البيوتين الزائدة قد تكون غير مكتملة، مما يؤدي إلى انخفاض العائد المستهدف البروتين. A مكفاءة خام البديل هو شطف مع SDS، لكنه يؤدي إلى تلوث العينة غير مرغوب فيها مع بكتيريا-Tactin صدر من الراتنج، مما يجعل الفحص يتعارض مع تحليل البروتين. تعرض هذه الورقة تقنية للتغلب على هذا التحديد عن طريق تثبيت لأول مرة tetramer يقترن الراتنج من بكتيريا-Tactin حسب المادة الكيميائية عبر ربط ثم باستخدام SDS إلى أزل البروتينات المزدوج بكتيريا الموسومة والمجمعات المرتبطة بها من الناتج راتنج عبر ربط. وبالتالي، لا يمكن أن يتحقق العائد كافية من البروتين دون تلوث العينة مع بكتيريا-Tactin، مما يتيح المزيد من التحليل بواسطة مطياف الكتلة.

هذه الطريقة مناسبة لتنقية أي انصهار بروتين المؤتلف مع المعرضة للسطح SIII علامة 3 أو التوأم بكتيريا علامة (WSHPQFEK تسلسل الأحماض الأمينية (GGGS) 3 WSHPQFEK وSAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK، على التوالي). البروتين يمكن أن يكون من الحيوان والنبات أو الأصل البكتيرية ويمكن عزلها من خلية إما مجموعالمحللة أو المخصب عضية الكسر. كمثال على ذلك، ونحن تصف هنا تنقية من البروتين SIII الموسومة VPG برو من الفيروسات البطاطس A (PVA) 4 من الكسر النووية من PVA المصابة النباتات benthamiana نيكوتيانا. تم عزل جزء النووية كما هو موضح سابقا 5، مع إجراء التعديلات التالية: لم يعاملوا الخلايا مع الفورمالديهايد، تم استبداله بوتيرات الصوديوم في جميع مخازن مع 5 ملي فلوريد الصوديوم، تم استبداله كاملة مثبط البروتياز مع PMSF، تريتون X-100 تركيز في استخراج تم تخفيض العازلة # 2 إلى 0.3٪ (ت / ت) وكان بيليه معلق النووي التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي من خلال وسادة السكروز (العازلة استخراج # 3) في 1.45 مل من العازلة ملزمة قبل المبردة وتناوب لمدة 1.5 ساعة في 4 درجات مئوية. تم معالجة واستخراج النووية الناتجة تحتوي على البروتين الطعم SIII الموسومة والمجمعات المرتبطة بها (عينة البروتين الطعم) وفقا لبروتوكول موضح أدناه (انظر القسم 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. عبر ربط بكتيريا-Tactin Polymethacrylate الراتنج مع مكرر (sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

  1. تتوازن واحدة microtube مختومة تحتوي على 2 ملغ من BS3 عبر رابط إلى درجة حرارة الغرفة. تنبيه: BS3 هو عبارة عن مادة خطرة. ارتداء قفازات واقية ونظارات واقية.
  2. في resuspend بكتيريا-Tactin الراتنج polymethacrylate (50٪ معلق في 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA، و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم) من قبل وجيزة قوية تهز ونقل على الفور 600 ميكرولتر من تعليق إلى عمود الدوران باستخدام طرف ماصة مع خفض نهاية قبالة.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تجاهل التدفق من خلال وإضافة 450 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى العمود.
  4. تكرار الخطوة السابقة أكثر من مرة 2 لتحل محل تماما عازلة تريس مع برنامج تلفزيوني وترك الراتنج في 430 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تعديلها لدرجة الحموضة 8.0 بعد الطرد المركزي الماضي.
  5. ثقب احباط من microtube مع BS3 مع طرف ماصة تحتوي على 1001، ل من الماء عالى النقاء. حل مسحوق BS3 في الماء من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا، وعلى الفور إضافة 20 ميكرولتر من الحل إلى عمود الدوران. تركيز النهائي من BS3 في رد الفعل عبر ربط هو ~ 1.2 ملم.
  6. تدوير العمود لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن يتم خلط الراتنج بشكل صحيح مع حل BS3.
  7. لإرواء رد الفعل، إضافة 6 ميكرولتر من 3M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5 وتدوير العمود لمدة 15 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة.
  8. أجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تجاهل التدفق من خلال و resuspend الراتنج عبر ربط في 450 ميكرولتر من تريس مخزنة المالحة مع توين 20 (TBST). تكرار الطرد المركزي وغسل الخطوات مرتين أخريين. في الخطوة الأخيرة، resuspend والراتنج في 450 ميكرولتر من TBS.
  9. نقل تعليق الراتنج لأنبوب جديد باستخدام طرف ماصة مع نهاية تقطع. resuspend والراتنج اليسار في العمود مع 450 ميكرولتر من TBS آخر ونقل إلى نفس الأنبوب. تكرار عشره الخطوة الأخيرة مرة أخرى لضمان نقل أقصى الراتنج من العمود إلى الأنبوب.
  10. السماح للأنبوب الوقوف لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وضبط مستوى الصوت إلى 600 ميكرولتر من خلال إزالة TBS الزائدة. الراتنج جاهز للاستخدام الفوري (مستحسن) أو يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية، من دون تجميد.

2. ملزم من البروتين بيت التوأم بكتيريا الموسومة والأفراد المرتبطين مجمعات للصليب المرتبطة بكتيريا-Tactin Polymethacrylate الراتنج

  1. الطرد المركزي 1 مل من العينة البروتين الطعم في المنطقة العازلة ملزمة في 17،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية ونقل طاف لأنبوب جديد.
  2. للحد من البروتينات ملزمة البيروكسيديز الذاتية إلى الراتنج بكتيريا-Tactin، إضافة أفيدين إلى تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل وتناوب لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    1. إذا تم تخزين الراتنج عبر ربط من الخطوة 1.10 لفترة طويلة من الزمن في 4 درجات مئوية، وجمع الراتنج بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج FOص 1 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف ويغسل الراتنج مع 1 مل من TBST. تكرار الطرد المركزي وغسل الخطوات مرتين أخريين، الأولى مع TBST ثم مع TBS. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 400 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية، وضبط لحجم الأصلي عن طريق إزالة TBS الزائدة.
  3. resuspend وعبر ربط الراتنج بكتيريا-Tactin من قبل vortexing. إضافة على الفور 50 ميكرولتر من تعليق الراتنج إلى الأنبوب الذي يحتوي على عينة بروتين الطعم باستخدام تلميح قطع ماصة وتناوب لمدة 30 دقيقة أخرى في 4 درجات مئوية.
  4. أثناء انتظار، تعيين thermomixer إلى 55 درجة مئوية، وتسخين 500 ميكرولتر من شطف العازلة للاستخدام في الخطوة 3.1.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف ويغسل الراتنج على محور دوار لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية مع 1 مل من قبل المبردة غسل العازلة # 1. تكرار الطرد المركزي وغسل خطوات ثلاث مرات. في الخطوة الأخيرة، resuspend والراتنج في 250 ميكرولتر من غسل العازلة # 2.
  6. آر ansfer تعليق الراتنج إلى عمود الدوران الطازجة. resuspend والراتنج المتبقية في الأنبوب في 250 ميكرولتر آخر من غسل العازلة رقم 2 ونقل إلى نفس العمود.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل من خلال تدفق ونقل العمود إلى الطازجة الدلفين الأنف 2 مل أنبوب. الشروع فورا في الخطوة شطف أدناه.

3. شطف من البروتين المجمعات محددة

  1. إضافة 150 ميكرولتر من شطف العازلة محمى من الخطوة 2.4 إلى عمود الدوران.
  2. احتضان في thermomixer لمدة 5 دقائق عند 55 درجة مئوية، والهز في 1،400 دورة في الدقيقة.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تجاهل العمود وتخزين البروتينات المستهدفة المنقى في ≤ -20 درجة مئوية.
الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)
نا 2 هبو 4 10 ملي
KH 2 PO 4 2mm و
كلوريد الصوديوم 137 ملي
بوكل 2.7 ملي
درجة الحموضة تعديلها إلى 7.4 ما لم ينص على خلاف ذلك (الرقم الهيدروجيني 8.0 في القسم 1.4)
تريس مخزنة المالحة (TBS)
تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4 50 ملي
GHT = "20" على غرار = "الطول: 20px؛ العرض: 299px؛"> كلوريد الصوديوم 150 ملي
تريس مخزنة المالحة مع توين 20 (TBST)
تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4 50 ملي
كلوريد الصوديوم 150 ملي
توين 20 0.1٪ (V / V)
ملزمة العازلة
تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 25 ملي
كلوريد الصوديوم
ناف 5 ملي
EDTA 0.5 ملي
الغليسيرول 10٪ (V / V)
PMSF 0.1 ملي
غسل العازلة # 1
تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 25 ملي
كلوريد الصوديوم 500 ملي
ناف الدفتيريا> 5 ملي
EDTA 0.4 ملي
Igepal CA-630 0.2٪ (V / V)
الغليسيرول 5٪ (V / V)
PMSF 0.1 ملي
غسل العازلة # 2
تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 25 ملي
كلوريد الصوديوم 150 ملي
تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 25 ملي
SDS 1٪ (ث / ت)
0 "> س؛ "> 550 ملي 2 "ذروة =" 20 "على غرار =" الطول: 20px؛ العرض: 597px؛ "> العازلة شطف

الجدول 1. المخازن المؤقتة المستخدمة في هذه الدراسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويتضح الإجراء تنقية تخطيطي في الشكل 1، جنبا إلى جنب مع تمثيل من المشاكل المرتبطة غيرها من وسائل تنقية القائمة.

figure-results-300
الشكل 1. تمثيل تخطي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

بروتوكول أعلاه يمكن استخدامها لتنقية أي بروتين الطعم المزدوج بكتيريا الموسومة المصالح والمجمعات المرتبطة به في أي مناسبة العازلة التي لا تحتوي على البيوتين أو denaturants قوية. في النسخة الحالية من بروتوكول، يتم تنفيذ ملزمة وغسل تحت شروط صارمة نسبيا في وجود الملح العالي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نحن نعترف بامتنان الدعم الفني من سيني Miettinen، مينا Pöllänen وترو Rautavesi. نشكر Helka Nurkkala لتوفير HEK 293 الخلايا معربا عن التوأم بكتيريا الموسومة GFP وبيكا Evijärvi لتوفير معدات تسجيل الصوت. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الأكاديمية من فنلندا، منح أرقام 138329، 134684 258978 و.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mgPierce/Thermo Scientific21585www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)IBA2-1505www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterileCostar (Corning)8163www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubesCostar (Corning)3213www.corning.com/lifesciences/
Avidin IBA2-0204www.iba-lifesciences.com

References

  1. Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).
  2. Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).
  3. Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).
  4. Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).
  5. Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
  6. Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).
  7. Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).
  8. Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).
  9. Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).
  10. Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).
  11. Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).
  12. Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5 (9), (2010).
  13. Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63(2011).
  14. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
  15. Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

86 Tactin sulfosuccinimidyl suberate BS3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved