Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Tek aşamalı Strep-taktin Reçine Bis (sülfosuksinimidil) ile çapraz bağlanmış suberat (BS3) hakkında Çift Strep-etiketli proteinler ve komplekslerinin saflaştırılması
Bu Makalede
Özet
Bir yöntem olup (Strep-taktin) reçinesi kovalent Bis (sülfosuksinimidil) suberat (BS3) ile çapraz bağlanmış, modifiye edilmiş streptavidin ile ilgili çift-Strep-etiketli füzyon proteinleri ve bunların özel komplekslerinin etkin arıtma için açıklanmıştır. Bir yöntem hızlı hızlı, iyi bir hedef protein geri kazanımı ve yüksek saflıkta avantajları vardır ve kütle spektrometresi ile bir sonraki analiz ile uyumludur.
Özet
Işlenmiş bir streptavidin (Strep-taktin) taşıyan reçineleri Strep-etiketli füzyon proteinlerinin afinite saflaştırılması, fizyolojik koşullar altında, protein kompleksleri izolasyonu için yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline gelmiştir. Çift-Strep-etiket ya da SIII-etiketi belirlenmiş Strep-etiketi II iki kopyasını ihtiva eden füzyon proteinleri, böylece daha etkili bir protein arıtma sağlayan, tek bir Strep-etiketi ihtiva eden kıyasla Strep-taktin için daha yüksek afinite avantajına sahiptir. Ancak bu avantaj biyotin ile çift-Strep ile işaretlenmiş olan proteinlerin elüsyon düşük protein geri kazanımı yol açan, eksik olabilir gerçeği ile dengelenir. Kurtarma önemli ölçüde sodyum dodesil sülfat (SDS) ile denatüre elüsyonu kullanılarak geliştirilebilir, ancak bu alt-proteomik analizi ile tahlil uyumsuz hale reçineden serbest Strep-taktin bulaşmasını örnek yol açar. Bu sınırlamayı aşmak için, bir yöntem Strep-taktin bu sayede, reçine-birleştiğinde tetramerdir geliştirdikilk kovalent Bis (sülfosuksinimidil) suberat (BS3) ile çapraz bağlama ile elde edilen çapraz bağlanmış Reçine daha sonra, bir tek partili saflaştırma adımında, hedef protein komplekslerinin saflaştırılması için kullanılan ile stabilize edilir. Strep-taktin kontamine olmaması kütle spektrometresi ile aşağı protein analizine olanak verirken SDS verimli yıkama, iyi bir protein iyileşme sağlar. Kavramının bir kanıtı olarak, virüs bulaşmış N. çekirdeklerden VPg-Pro SIII-etiketli viral proteinin saflaştırılması için burada bir protokol açıklar BS3 ile çapraz bağlanmış Strep-taktin polimetakrilat reçine kullanılarak benthamiana bitkileri. Aynı protokol, ilgi duyulan herhangi bir çift-Strep-etiketli proteinin saflaştırılması ve bunun fizyolojik bağlanma ortakları karakterize etmek için kullanılabilir.
Giriş
Son yıllarda, Strep-etiket teknolojisi proteomik ve yapısal biyoloji dahil olmak üzere biyomedikal araştırmanın birçok alanda yaygın olarak kullanılır hale gelmiştir. Kısa bir Strep-eklentisi peptide rekombinant proteinlerin füzyon dayanır Bu protein saflaştırma tekniği, Strep-taktin, geliştirilmiş peptid-bağlama kapasiteli streptavidin bir varyantını taşıyan genetik olarak benzer matrislere gelişine olgunlaşmıştır. 1, 2 çift-Strep-eklentisi veya SIII-eklentisi, sergi rekombinant proteinlerin daha etkili bir temizlik sağlanması, sadece tek bir Strep-etiketi ihtiva eden daha Strep-taktin matrisler için daha yüksek bir afinite ve belirlenmiş Strep-etiketi II iki kopyasını ihtiva eden füzyon proteinleri ilişkili bağlama ortakları. Bununla birlikte, Strep-taktin için çift-Strep-etiketli proteinlerinin daha yüksek afinite da yanları vardır. Fazla biotin ile bu tür proteinlerin Rekabetçi elüsyon hedef protein verimi azalmasına yol, eksik olabilir. A mcevher Diğer alternatif SDS ile yıkama, ancak proteomik analizi ile tahlil uyumsuz hale reçineden serbest Strep-taktin ile istenmeyen örnek kirlenmesine yol açar. Bu çalışma, birinci kimyasal çapraz bağlama ile Strep-taktin reçine çiftli tetramer stabilize etme ve daha sonra elde edilen çapraz bağlanmış reçinenin ikinci çift-Strep-etiketli proteinleri ve ilgili kompleksleri elüt edilmesi için SDS kullanarak bu sınırlamanın üstesinden gelmek için bir yöntem sunar. Bu nedenle, yeterli bir protein verimi ve böylece kütle spektrometresi ile daha fazla analiz sağlayan, Strep-taktin numune kirlenme olmadan elde edilebilir.
Yöntem, bir yüzey-açık-etiket SIII 3 ya da çift-Strep-etiketi (amino asit sekansı WSHPQFEK (GGGS) sırasıyla 3 ve WSHPQFEK SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK) ile herhangi bir rekombinant füzyon proteininin saflaştırılması için uygundur. Protein, hayvan, bitki veya bakteri kaynaklı olabilir ve toplam hücre ya da izole edilebilirlizatı veya organel zenginleştirilmiş fraksiyon. Bir örnek olarak, burada PVA ile enfekte edilmiş Nicotiana benthamiana bitkilerinin nükleer fraksiyondan Potato Virüs A (PVA) 4 bir SIII etiketli protein VPg-Pro saflaştırılmasını anlatmaktadır. Daha önce, aşağıdaki modifikasyonlar ile, tarif edildiği gibi, 5 nükleer fraksiyon izole edilmiştir: hücre formaldehit ile tedavi edildi, sodyum bütirat 5 mM sodyum fluorür Tüm tamponlar içinde ikame edilmiş, tam proteaz inhibitör PMSF ile ikame edilmiş, ekstre içinde Triton X-100 konsantrasyonu tampon # 2% 0.3 'e düşürülmüştür (v / v) ve (ekstraksiyon tampon # 3) sakroz yastığı içinden santrifüjleme ile elde edilen nükleer pelet önceden soğutulmuş bağlanma tamponu içinde 1.45 ml içinde yeniden süspansiye edildi ve 4 ° C' de 1.5 saat boyunca döndürülür SIII-etiketli yem protein ve ilişkili kompleksler (yem protein örneği) ihtiva eden ortaya çıkan çekirdek ekstraktı, (bakınız bölüm 2), aşağıda tarif edilen protokole göre işlenmiştir.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Protokol
1.. Bis ile Strep-taktin polimetakrilat reçine (sülfosuksinimidil) çapraz bağlanması, suberat (BS3)
- Oda sıcaklığına BS3 çapraz bağlayıcı içeren 2 mg bir sızdırmaz mikrotüp dengelenmesi. DİKKAT: BS3 tehlikeli bir maddedir. Koruyucu eldiven ve gözlük takın.
- Strep-taktin süspanse polimetakrilat reçine (100 mM Tris-HCI, pH 8.0 içinde% 50 süspansiyon, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) ile çalkalanarak kısa ve hemen bir pipet kullanarak bir döndürme kolonuna süspansiyonu 600 ul transfer uç kesti.
- Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 1500 x g'de santrifüjleyin. Akış yoluyla atın ve sütun fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 450 ul ekleyin.
- Tamamen PBS ile Tris tamponu değiştirmek ve son santrifüj sonra pH 8.0 'e ayarlandı 430 ul PBS içindeki reçineyi bırakmak için önceki aşamada, 2 kez daha tekrarlayın.
- 100 ihtiva eden bir pipet ucu ile BS3 ile mikrotüp folyo delinme1, ultra saf su l. Hafifçe aşağı ve yukarı pipetlenerek su içinde çözülür ve toz BS3 hemen döndürme kolonuna çözeltisinin 20 ul ekle. Çapraz bağlama reaksiyonunda BS3 nihai konsantrasyon ~ 1.2 mM'dir.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sütunu döndürün. Reçine BS3 çözeltisi ile düzgün karışık olduğunu kontrol edin.
- Reaksiyonu söndürmek için, 3M Tris-HCI, pH 7.5, 6 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika daha sütunu döndürün.
- Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 1500 x g'de santrifüjleyin. Akış yoluyla uzaklaştırılır ve Tris içinde 450 ul çapraz bağlı reçine tekrar süspansiyon Tween 20 (TBST) ile tamponlu tuz. Tekrar santrifüj ve adımları iki kez yıkayın. Son adımda, TBS içinde 450 ul reçine tekrar süspansiyon.
- Sonu ile bir pipet kullanarak yeni bir tüp reçine süspansiyonu aktarın kesti. TBS başka bir 450 ul sütunda kalan reçine yeniden süspanse edin ve aynı tüpe aktarın. Tekrar incibir kez daha tüp sütundan reçinenin en transferini sağlamak için son adım e.
- Tüp oda sıcaklığında 10 dakika boyunca durmak ve aşırı TBS kaldırarak 600 ul seviyesini ayarlamak olsun. Reçine (önerilen) hemen kullanıma hazır ya da dondurma olmadan 4 ° C'de saklanabilir.
2.. Çapraz bağlı Strep-taktin polimetakrilat reçine için Çift-Strep-etiketli Protein yem ve İlişkili Kompleksleri bağlanması
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 17,000 x g ve bağlama tamponu, yeni bir tüpe transfer süpernatantı yem protein örneğinin Santrifüj 1 mi.
- , Strep-taktin reçineye biyotinile endojen proteinlerin bağlanma en aza indirmek 100 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar avidin ekleyin ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca döndürmek için
- Adım 1.10 arasındaki çapraz bağlı reçinesi, 4 ° C de, uzun bir süre boyunca depolanmış olması durumunda, 400 x g'da santrifüjleme ile fo reçine toplamak4 ° C'de 1 dakika r, süpernatantı atmak ve TBST içinde 1 ml reçine yıkayın. Tekrar santrifüj ve yıkama birinci TBST ile ve daha sonra TBS ile iki kez daha, adım. 4 ° C'de 1 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj tüpü ve fazla TBS kaldırarak, orijinal hacme ayarlayın.
- Vorteks ile çapraz bağlanmış Strep-taktin reçine yeniden süspanse edin. Derhal bir kesim pipet kullanarak yem protein örneği içeren tüpe reçine süspansiyonu 50 ul ekleyin ve 4 ° C'de başka bir 30 dakika boyunca döndürmek
- Beklerken, 55 ° C'ye ayarlanmış Thermomixer ve aşama 3.1 'de kullanım için elüsyon tamponunun 500 ul ön ısıtma.
- 4 ° C'de 1 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje Süpernatant atılır ve önceden soğutulmuş yıkama tamponu # 1 ve 1 ml 4 ° C'de 5 dakika boyunca bir karıştırıcı üzerine reçine yıkayın. Santrifüj adımları tekrarlayın ve üç kez yıkayın. Son adımda, yıkama tamponu # 2 250 ul içindeki reçineyi tekrar süspansiyon.
- Tr taze bir spin kolon için reçine süspansiyon ansfer. Yıkama tampon # 2'nin bir 250 ul tüp içinde kalan reçine yeniden süspanse edin ve aynı sütuna transfer.
- 4 ° C'de 3 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin, akış-through atın ve yeni bir yunus burun-2 ml tüp sütunu aktarın. Aşağıdaki yıkama aşamasından hemen geçin.
Özgül Protein Komplekslerinin 3. Elüsyonu
- Döndürme kolonuna aşama 2.4 'ten önceden ısıtılmış elüsyon tamponu 150 ul ekle.
- 1400 rpm'de çalkalanarak, 55 ° C'de 5 dakika boyunca Thermomixer inkübe edin.
- Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüjleyin.
- Sütunu atın ve ≤ -20 ° C'de saflaştırılmış hedef proteinlerin depolamak
| Fosfat tamponlu tuz (PBS) | |
| Na 2 HPO 4 | 10 mM |
| KH 2 PO 4 | 2mm |
| NaCl | 137 mM |
| KCl | 2.7 mM |
| (bölüm 1.4 pH 8,0), aksi belirtilmedikçe, pH değeri 7.4 'e ayarlanmıştır | |
| Tris (TBS) tamponlu tuzlu | |
| Tris-HCl, pH 7.4 | 50 mM |
| GHT = "20" style = "height: 20px; width: 299px;"> NaCl | 150 mM |
| Tris Tween 20 (TBST) ile tamponlu tuzlu | |
| Tris-HCl, pH 7.4 | 50 mM |
| NaCl | 150 mM |
| Tween 20 | % 0.1 (v / v) |
| Bağlama tamponu | |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 25 mM |
| NaCl | |
| NaF | 5 mM |
| EDTA | 0.5 mM |
| Gliserin | % 10 (v / v) |
| PMSF | 0.1 mM |
| Tampon # 1 yıkayın | |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 25 mM |
| NaCl | 500 mM |
| NaF td> | 5 mM |
| EDTA | 0.4 mM |
| Igepal CA-630 | % 0.2 (v / v) |
| Gliserin | % 5 (v / v) |
| PMSF | 0.1 mM |
| Tampon # 2 yıkayın | |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 25 mM |
| NaCl | 150 mM |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 25 mM |
| SDS | % 1 (ağ / hac) |
Tablo 1.. Mevcut çalışmada kullanılan tamponlar.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Sonuçlar
Saflaştırma prosedürü, şematik olarak bir arada var olan diğer saflaştırma yöntemleri ile bağlantılı sorunların bir temsili, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
Şekil 1. Saflaştırma prosedürü şematik temsili. Akışı kovalent çapraz bağlı reçine için çift-Strep-etiketli yem protein ...
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Tartışmalar
Yukarıdaki protokol biotin ya da güçlü denşirme içermeyen, herhangi bir uygun tampon maddesi içinde ilgi ve ilgili kompleksleri herhangi bir çift-Strep-etiketli yem proteini saflaştırmak için kullanılabilir. Protokol geçerli sürümünde, bağlanma ve yıkama, yüksek tuz ve iyonik olmayan deterjanın varlığında, nispeten sert koşullar altında gerçekleştirilir. Bu, daha az arka sonuçlanır, ancak kırılgan protein kompleksleri, bu koşullar altında ayırmak olabilir. Örneğin düşük afinite kom...
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Biz minnetle Sini Miettinen, Minna Pöllänen ve Taru Rautavesi teknik destek için minnettarım. Biz HEK ses kayıt ekipmanları sağlanması için ikiz-Strep-etiketli GFP ve Pekka Evijarvi ifade 293 hücreler sağlamak için Helka Nurkkala teşekkür ederim. Bu çalışma Finlandiya Akademisi tarafından finanse edildi, sayıları 138329, 134684 ve 258978 hibe.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Malzemeler
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
| Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
Referanslar
- Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).
- Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).
- Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).
- Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).
- Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).
- Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).
- Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).
- Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).
- Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).
- Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5 (9), (2010).
- Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63(2011).
- Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
- Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45(2011).
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Yeniden Basımlar ve İzinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır