Une étape de purification de protéines Twin-Strep-marqués et leurs complexes sur Strep-Tactin résine réticulée Avec Bis (sulfosuccinimidyl) subérate (BS3)

Résumé

Une méthode est décrite pour la purification efficace de protéines de fusion bi-Strep-marqués et leurs complexes spécifiques sur streptavidine modifiée (Strep-Tactin) résine réticulé de manière covalente avec Bis (sulfosuccinimidyl) subérate (BS3). Le procédé présente les avantages d'une vitesse rapide, une bonne récupération de la protéine cible et de haute pureté, et est compatible avec une analyse ultérieure par spectrométrie de masse.

Résumé

La purification par affinité de protéines de fusion Strep-marquées sur résines portant une streptavidine ingénierie (Strep-Tactin) est devenue une méthode largement utilisée pour l'isolement des complexes de protéines dans des conditions physiologiques. Les protéines de fusion contenant deux copies de Strep-tag II, désignés double-Strep-tag ou SIII-tag, ont l'avantage d'une plus grande affinité pour Strep-Tactin par rapport à celles ne contenant qu'un Strep-tag unique, permettant ainsi la purification de protéines plus efficace. Cependant, cet avantage est compensé par le fait que l'élution de protéines double Strep-marqués avec de la biotine peut être incomplète, conduisant à une faible récupération des protéines. La récupération peut être considérablement améliorée en utilisant une élution avec dénaturant le dodécylsulfate de sodium (SDS), mais ceci conduit à une contamination par des Strep-Tactin libéré de la résine de l'échantillon, rendant le test incompatible avec l'analyse protéomique aval. Pour surmonter cette limitation, nous avons mis au point un procédé par lequel des tétramères de résine couplée à de Strep-Tactinest tout d'abord stabilisé par des liaisons covalentes de réticulation avec Bis (sulfosuccinimidyl) subérate (BS3) et de la résine réticulée résultante est ensuite utilisée pour purifier des complexes de protéines cibles en une seule étape de purification par lots. Élution efficace avec SDS assure une bonne récupération des protéines, tandis que l'absence de contamination Strep-Tactin permet en aval l'analyse des protéines par spectrométrie de masse. Comme une preuve de concept, que nous décrivons ici un protocole pour la purification de la protéine virale SIII étiqueté VPg-Pro à partir de noyaux de N. infecté par un virus benthamiana plantes à l'aide de la résine de polyméthacrylate de Strep-Tactin réticulé avec BS3. Le même protocole peut être utilisé pour purifier n'importe quelle protéine bi-Strep-marqué d'intérêt et caractériser ses partenaires de liaison physiologiques.

Introduction

Au cours des dernières années, la technologie Strep-tag a été largement utilisé dans de nombreux domaines de la recherche biomédicale, y compris la protéomique et la biologie structurale. Cette technologie de purification des protéines, qui repose sur la fusion de protéines recombinantes à une courte Strep-tag peptide, a évolué avec l'avènement des matrices d'affinité portant des Strep-Tactin, une variante génétiquement modifiée de la streptavidine avec une meilleure capacité de liaison au peptide ^{1, 2.} Les protéines de fusion contenant deux copies de Strep-tag II, désignés double-Strep-tag ou SIII-tag, présentent une plus grande affinité pour les matrices Strep-Tactin que ceux contenant seulement un Strep-tag unique, assurant la purification plus efficace des protéines recombinantes et leurs partenaires de liaison associés. Cependant, la plus grande affinité de protéines double-Strep-marqués à Strep-Tactin a aussi son revers. Élution compétitive de ces protéines avec un excès de biotine peut être incomplète, conduisant à une diminution du rendement en protéines cible. A mefficace minerai alternative est élution avec du SDS, mais elle conduit à la contamination de l'échantillon non désiré avec Strep-Tactin libéré de la résine, ce qui rend le dosage incompatible avec l'analyse protéomique. Cet article présente une technique pour surmonter cette limitation en première stabiliser le tétramère de résine couplée de Strep-Tactin par réticulation chimique, puis en utilisant SDS pour éluer les protéines bi-Strep-marqués et leurs complexes associés de la résine réticulée résultant. Ainsi, le rendement en protéines suffisante peut être obtenue sans contamination de l'échantillon avec Strep-Tactin, ce qui permet en outre l'analyse par spectrométrie de masse.

La méthode est adaptée pour la purification de toute protéine de fusion recombinante avec un SIII-tag exposée en surface ³ ou bi-Strep-tag (WSHPQFEK de séquence d'acides aminés (GGGS) ₃ WSHPQFEK et SAWSHPQFEK (GGGS) ₂ GGSAWSHPQFEK, respectivement). La protéine peut être d'origine animale, végétale ou bactérienne et peut être soit isolé à partir de cellules totaleslysat ou fraction de organite enrichi. A titre d'exemple, nous décrivons ici la purification d'une protéine à étiquette SIII VPg-Pro Potato Virus de A (PVA) ⁴ à partir de la fraction nucléaire de plants de Nicotiana benthamiana infectés par le PVA. La fraction nucléaire a été isolé comme décrit précédemment ^5, avec les modifications suivantes: les cellules sont traitées avec du formaldéhyde, le butyrate de sodium a été substitué dans tous les tampons avec du fluorure de sodium 5 mM, inhibiteur complet de protease a été substitué par PMSF, Triton X-100 à une concentration dans l'extraction tampon N ° 2 a été abaissée à 0,3% (v / v) et le culot nucléaire obtenu par centrifugation à travers des coussins de saccharose (tampon d'extraction N ° 3) a été remis en suspension dans 1,45 ml de tampon de liaison pré-réfrigérés et mis en rotation pendant 1,5 heures à 4 ° C. L'extrait nucléaire résultant contenant la protéine appât SIII marqués et complexes associés (échantillon de protéine appât) a été traitée selon le protocole décrit ci-dessous (voir la section 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Réticulation de Strep-Tactin polyméthacrylate résine avec Bis (sulfosuccinimidyl) subérate (BS3)

1. Équilibrer un microtube scellé contenant 2 mg de BS3 agent de réticulation à température ambiante. ATTENTION: BS3 est une substance dangereuse. Portez des gants et des lunettes de protection.
2. Résine de polyméthacrylate Remettre en suspension Strep-Tactin (suspension à 50% dans 100 mM Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 1 mM, NaCl 150 mM) par une brève agitation vigoureuse et à transférer immédiatement 600 ul de la suspension à une colonne de centrifugation à l'aide d'un embout de pipette avec la fin coupée.
3. Centrifuger à 1500 g pendant 30 secondes à la température ambiante. Jeter l'effluent et ajouter 450 ul de tampon phosphate salin (PBS) à la colonne.
4. Répétez l'étape précédente 2 fois plus de remplacer complètement le tampon Tris avec du PBS et laisser la résine dans 430 pi de PBS ajusté à pH 8,0 après la dernière centrifugation.
5. Piquer la feuille du microtube avec BS3 avec une pointe de pipette contenant 1001, l d'eau ultra-pure. Dissoudre la poudre dans de l'eau BS3 en pipettant doucement vers le haut et vers le bas et ajouter immédiatement 20 pi de la solution de la colonne de centrifugation. La concentration finale de BS3 dans la réaction de réticulation est d'environ 1,2 mM.
6. Tournez la colonne pendant 30 min à température ambiante. Vérifier que la résine est mélangée convenablement avec la solution de BS3.
7. Pour stopper la réaction, ajouter 6 ul de Tris-HCl 3M, pH 7,5 et de faire tourner la colonne pendant 15 minutes supplémentaires à température ambiante.
8. Centrifuger à 1500 g pendant 30 secondes à la température ambiante. Jeter l'effluent à travers et remettre en suspension la résine réticulée dans 450 pi de Tris solution saline tamponnée avec du Tween 20 (TBST). Répétez la centrifugation et les étapes de lavage deux fois de plus. Lors de la dernière étape, remettre en suspension la résine dans 450 pi de TBS.
9. Transférer la suspension de résine dans un nouveau tube à l'aide d'une pipette avec l'extrémité coupée. Reprendre la résine dans la colonne de gauche avec un autre 450 pi de TBS et transférer dans le même tube. Répétez ee dernière étape une fois de plus pour assurer un transfert maximal de la résine de la colonne sur le tube.
10. Laissez le tube reposer pendant 10 min à température ambiante et ajuster le volume à 600 pi en enlevant l'excès SCT. La résine est prêt pour une utilisation immédiate (recommandé) ou peut être conservé à 4 ° C, sans congélation.

2. Liaison de la protéine appât Twin-Strep-marqués et associés Complexes à la Strep-Tactin polyméthacrylate résine réticulée

1. Centrifugeuse de 1 ml de l'échantillon de protéine d'appât dans le tampon de liaison à 17 000 xg pendant 10 min à 4 ° C et transférer le surnageant dans un tube frais.
2. Pour minimiser la liaison de protéines endogènes biotinylés à la résine Strep-Tactin, ajouter de l'avidine à une concentration finale de 100 pg / ml et de tourner pendant 15 min à 4 ° C.
   1. Si la résine réticulée de l'étape 1.10 a été stocké pendant une longue période de temps à 4 ° C, de recueillir la résine par centrifugation à 400 xg for 1 min à 4 ° C, éliminer le surnageant et laver la résine avec 1 ml de TBST. Répétez la centrifugation et lavage étapes deux fois, d'abord avec TBST puis avec le SCT. Centrifuger le tube à 400 x g pendant 1 min à 4 ° C et ajuster le volume d'origine en enlevant l'excès de TBS.
3. Remettre en suspension la résine Strep-Tactin réticulé au vortex. Ajouter immédiatement 50 pi de la suspension de résine dans le tube contenant l'échantillon de protéine appât en utilisant un embout de pipette de coupe et faire tourner pendant encore 30 min à 4 ° C.
4. En attendant, mettre thermomixer à 55 ° C et préchauffer à 500 pi de tampon d'élution pour une utilisation dans l'étape 3.1.
5. Centrifuger à 400 g pendant 1 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et laver la résine sur un agitateur pendant 5 min à 4 ° C avec 1 ml de la pré-réfrigérés tampon de lavage n ° 1. Répétez la centrifugation et les étapes de lavage trois fois. Lors de la dernière étape, remettre en suspension la résine dans 250 ul de tampon de lavage n ° 2.
6. Tr ansfer la suspension de résine d'une colonne de centrifugation douce. Remettre en suspension la résine restant dans le tube dans un autre 250 ul de tampon de lavage n ° 2 et le transférer dans la même colonne.
7. Centrifugeuse à 400 g pendant 3 min à 4 ° C, jeter le accréditives et transférer la colonne à un dauphin nez 2 nouveau tube de ml. Procéder immédiatement à l'étape d'élution ci-dessous.

3. L'élution de la protéine spécifique Complexes

1. Ajouter 150 pi de tampon d'élution préchauffé provenant de l'étape 2.4 de la colonne de centrifugation.
2. Incuber dans thermomixer pendant 5 min à 55 ° C, en agitant à 1400 tours par minute.
3. Centrifuger à 1500 g pendant 1 min à température ambiante.
4. Jeter la colonne et stocker les protéines cibles purifiés à ≤ -20 ° C.

Tampon phosphate salin (PBS)
Na 2 HPO 4	10 mM
KH 2 PO 4	2 mM
NaCl	137 mM
KCl	2,7 mM
pH ajusté à 7,4, sauf indication contraire (pH 8,0 à la section 1.4)
Tris solution saline tamponnée (SCT)
Tris-HCl, pH 7,4	50 mM
ght = le style "20" = "height: 20px; largeur: 299px;"> NaCl	150 mM
Tris solution saline tamponnée avec du Tween 20 (TBST)
Tris-HCl, pH 7,4	50 mM
NaCl	150 mM
Tween 20	0,1% (v / v)
Tampon de liaison
Tris-HCl, pH 8,0	25 mM
NaCl
NaF	5 mM
EDTA	0,5 mM
Glycérol	10% (v / v)
PMSF	0,1 mM
Laver tampon # 1
Tris-HCl, pH 8,0	25 mM
NaCl	500 mM
NaF td>	5 mM
EDTA	0,4 mM
Igepal CA-630	0,2% (v / v)
Glycérol	5% (v / v)
PMSF	0,1 mM
Laver tampon # 2
Tris-HCl, pH 8,0	25 mM
NaCl	150 mM
Tris-HCl, pH 8,0	25 mM
SDS	1% (p / v)

0 "> x "> 550 mM 2 "height =" "style =" 20 hauteur: 20px; largeur: 597px; "> tampon d'élution

Tableau 1. Tampons utilisés dans la présente étude.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

La procédure de purification est illustrée schématiquement sur ​​la figure 1, avec une représentation des problèmes associés à d'autres procédés de purification existants.

Figure 1. Représentation schématique de la procédure de purification. Le flux de travail comprend la stabilisation d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Le protocole ci-dessus peut être utilisé pour purifier n'importe quelle protéine appât double-Strep-marqué d'intérêt et ses complexes sont associés à n'importe quel tampon convenable qui ne contient pas de la biotine ou des dénaturants forts. Dans la version actuelle du protocole, de liaison et de lavage sont effectuées dans des conditions relativement strictes en la présence de forte teneur en sel et un détergent non-ionique. Bien que cela se traduit par moins de fond, des complexes de protéin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg	Pierce/Thermo Scientific	21585	www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)	IBA	2-1505	www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile	Costar (Corning)	8163	www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubes	Costar (Corning)	3213	www.corning.com/lifesciences/
Avidin	IBA	2-0204	www.iba-lifesciences.com