JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Описан способ эффективного очищения твин-Strep-меченых гибридных белков и их специфических комплексов на модифицированной стрептавидином (Strep-Tactin) смолу, ковалентно сшитый с бис (сульфосукцинимидил) суберат (BS3). Способ имеет преимущества высокой скорости, хорошее восстановление белка-мишени и высокой степенью чистоты, и совместим с последующим анализом методом масс-спектрометрии.

Аннотация

Affinity очистка Стрептококковое метками слитых белков на смол, несущих инженерии стрептавидин (Стрептококковое-Tactin) стал широко используемым методом для выделения белковых комплексов в физиологических условиях. Гибридные белки, содержащие две копии Strep-тега II, обозначенные двойной-Strep-теги или SIII-тег, имеют то преимущество, более высокое сродство к Strep-Tactin по сравнению с те, которые содержат только один Strep-тег, что позволяет более эффективную очистку белка. Однако это преимущество компенсируется тем, что вымывание твин-Стрептококковое-меченых белков с биотин может быть неполной, что приводит к низкой восстановления белка. Восстановление может быть значительно улучшена с помощью денатурирующего элюирование с додецилсульфатом натрия (SDS), но это приводит к образцу заражение Strep-Tactin выпущенный из смолы, что делает анализ несовместимы с последующей протеомного анализа. Чтобы преодолеть это ограничение, мы разработали метод, посредством смолы в сочетании тетрамерное из Strep-Tactinсначала стабилизированы ковалентной сшивки с бис (сульфосукцинимидил) суберат (BS3) и полученную сшитый полимер затем использовать для очистки целевых комплексов белков в одной стадии очистки пакета. Эффективное элюирование SDS обеспечивает хорошее восстановление белка, а отсутствие загрязнения Strep-Tactin позволяет потоку анализа белков методом масс-спектрометрии. Как доказательство концепции, мы описываем здесь протокол для очистки SIII-меченого вирусного белка ВПГ-Pro из ядер инфицированных вирусом N. benthamiana растения, использующие полиметакрилатные смолы Стрептококковое-Tactin сшитый с БС3. То же протокол может быть использован для очистки любой твин-Strep-меченый белок, представляющий интерес и характеризуют его физиологических партнеров по связыванию.

Введение

В последние годы технология Стрептококковое-тег стал широко используемым во многих областях биомедицинских исследований, в том числе протеомики и структурной биологии. Эта технология очистки белка, которая опирается на слияние рекомбинантных белков на короткий пептид Стрептококковое-тега, созрел с появлением сродства матриц, несущих Strep-Tactin, генетически модифицированного варианта стрептавидином с улучшенной пептид-связывающей способности. 1, 2 Гибридные белки, содержащие две копии Strep-тега II, обозначенные двойной Стрептококковое-теги или SIII-тег, проявляют высокое сродство к Стрептококковое-Tactin матриц, чем те, которые содержат только один Strep-тег, обеспечивая более эффективную очистку рекомбинантных белков и связанные с ними связывающие партнеры. Тем не менее, более высокое сродство твин-Стрептококковое-меченых белков Strep-Tactin также имеет свою оборотную сторону. Конкурентная вымывание таких белков с избыточным биотина может быть неполным, что приводит к снижению выход белка целевой. Мруда эффективной альтернативой является элюирование SDS, но это приводит к нежелательному загрязнения образца с Strep-Tactin выпущенный из смолы, что делает анализ несовместимы с протеомного анализа. Эта статья представляет собой технику, чтобы преодолеть это ограничение, сначала стабилизации смолы связью тетрамер стрептококкового-Tactin с помощью химической сшивки, а затем с помощью SDS для элюирования твин-Стрептококковое-тегом белки и связанные с ними комплексы из полученного сшитого полимера. Таким образом, достаточно выход белка может быть достигнуто без загрязнения образца с Strep-Tactin, тем самым позволяя дальнейшего анализа методом масс-спектрометрии.

Метод подходит для очистки любого рекомбинантного гибридного белка с поверхности, подвергшихся воздействию SIII-тега 3 или двумя-Strep-тега (последовательность аминокислот WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK и SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, соответственно). Белок может быть животного, растительного или бактериального происхождения и может быть выделен из клеток либо общийлизат или обогащенный органелл фракция. В качестве примера, мы описываем здесь очищение в SIII с метками белка ВПГ-Профи Картофель Virus A (ПВС) 4 от ядерной фракции ПВА-инфицированных Nicotiana benthamiana растений. Ядерный фракцию выделяли, как описано ранее 5, со следующими изменениями: клетки не были обработаны формальдегидом, бутират натрия замещенных во всех буферов 5 мМ фторида натрия, в комплекте ингибитор протеазы был замещен PMSF, Тритон Х-100 в концентрации добычи буфер # 2 был снижен до 0,3% (объем / объем) и ядерный осадок получали центрифугированием через сахарозы (экстракционный буфер # 3) ресуспендировали в 1,45 мл предварительно охлажденной буфером для связывания и вращают в течение 1,5 часов при 4 ° С. Полученную ядерный экстракт, содержащий SIII-меченого белка приманки и связанные комплексы (примеры приманка белка) обрабатывают в соответствии с протоколом, описанным ниже (см. раздел 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Сшивка Strep-Tactin полиметакрилатные Ресин с бис (сульфосукцинимидил) суберат (BS3)

  1. Равновесие один запечатанный микропробирок, содержащий 2 мг BS3 сшивающего агента до комнатной температуры. ВНИМАНИЕ: BS3 является опасным веществом. Носите защитные перчатки и очки.
  2. Ресуспендируют Strep-Tactin полиметакрилат смола (50%-ная суспензия в 100 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ EDTA; 150 мМ NaCl) при кратковременном энергичного встряхивания и немедленно передать 600 мкл суспензии на ротационную колонку с использованием пипетки с конец отрезать.
  3. Центрифуге при 1500 х г в течение 30 сек при комнатной температуре. Отменить проточные и добавить 450 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) в колонну.
  4. Повторите предыдущий шаг 2 несколько раз, чтобы полностью заменить Трис буфер PBS и оставить смолы в 430 мкл PBS доводили до 8,0 после последнего центрифугирования.
  5. Прокол фольгу микропробирок с БС3 с кончика пипетки, содержащей 1001; л сверхчистой воды. Растворить BS3 порошок в воде, осторожно пипеткой вверх и вниз и сразу же добавить 20 мкл раствора в колонну спина. Конечная концентрация BS3 в сшивающего реакции составляет ~ 1,2 мм.
  6. Поверните колонку в течение 30 мин при комнатной температуре. Убедитесь, что смолу смешивают с надлежащим BS3 раствора.
  7. Для гашения реакции, добавляют 6 мкл 3 М Трис-HCl, рН 7,5, и вращать колонну в течение еще 15 мин при комнатной температуре.
  8. Центрифуге при 1500 х г в течение 30 сек при комнатной температуре. Отменить проточные и ресуспендируют сшитый полимер в 450 мкл забуференным трис физиологическим раствором с Tween 20 (TBST). Повторите центрифугирования и мыть шаги еще два раза. На последнем шаге, ресуспендируют смолы в 450 мкл TBS.
  9. Передача смолы суспензии в свежую пробирку с помощью пипетки с конца отрезаны. Ресуспендируют смолы слева в столбце с еще 450 мкл TBS и трансфер в той же пробирке. Повторите йэ последний шаг еще раз, чтобы обеспечить максимальную передачу смолы из колонки к трубе.
  10. Оставьте пробирку в течение 10 мин при комнатной температуре и регулировать громкость в 600 мкл путем удаления избытка TBS. Смола готовы к немедленному использованию (рекомендуется) или можно хранить при температуре 4 ° С, без замораживания.

2. Связывание Твин-Стрептококковое-меткой Bait белка и связанного комплексов в сшитом Стрептококковое-Tactin полиметакрилатные Ресин

  1. Центрифуга 1 мл образца приманка белка в буфере для связывания при 17000 х г в течение 10 мин при 4 ° С и передачи супернатант в новую пробирку.
  2. Чтобы свести к минимуму связывание эндогенных биотинилированных белков в смоле Strep-Tactin, добавьте авидин в конечной концентрации 100 мкг / мл и вращаться в течение 15 мин при 4 ° С.
    1. Если сшитый смола с шагом 1,10 был сохранен в течение длительного периода времени при 4 ° С, собирают смолу центрифугированием при 400 х г FOR 1 мин при 4 ° С, отбросить супернатант и мыть смолы 1 мл TBST. Повторите центрифугирования и мыть шаги еще два раза, сначала с TBST и затем с TBS. Центрифуга трубки при 400 х г в течение 1 мин при 4 ° С и отрегулировать до первоначального объема путем удаления избытка TBS.
  3. Ресуспендируют сшитый Стрептококковое-Tactin смолы путем встряхивания. Сразу же добавить 50 мкл суспензии смолы в пробирку, содержащую образец приманка белка с использованием наконечника пипетки вырезать и вращать течение еще 30 мин при 4 ° С.
  4. Ожидая, установите Thermomixer до 55 ° С и подогрева 500 мкл буфера для элюции для использования на стадии 3.1.
  5. Центрифуга при 400 мкг в течение 1 мин при 4 ° С. Удалите супернатант и мыть смолы на ротатора в течение 5 мин при 4 ° С с 1 мл предварительно охлажденной промывочный буфер № 1. Повторите центрифугирования и мыть шаги три раза. На последнем шаге, ресуспендируйте смолы в 250 мкл промывочного буфера # 2.
  6. Тр ansfer смолы суспензии свежей колонке спина. Ресуспендируют смолу, оставшуюся в пробирке в еще 250 мкл промывочного буфера # 2 и передавать в том же столбце.
  7. Центрифуга при 400 мкг в течение 3 мин при 4 ° С, отбросить проточные и передавать столбец к новому дельфин-нос 2 мл трубки. Немедленно приступить к стадии элюирования ниже.

3. Элюцию специфический белок комплексов

  1. Добавить 150 мкл элюирующего буфера предварительно разогретой с шагом 2,4 в колонну спина.
  2. Выдержите в термомиксере в течение 5 мин при 55 ° С, встряхивая при 1400 оборотах в минуту.
  3. Центрифуге при 1500 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре.
  4. Откажитесь от колонки и хранить очищенные белки-мишени при ≤ -20 ° C.
Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS)
Na 2 HPO 4 10 мМ
KH 2 PO 4 2 мМ
NaCl 137 мм
KCl 2,7 мм
рН доводили до 7,4, если не указано иное (рН 8,0 в разделе 1.4)
Трис буферном растворе (TBS)
Трис-HCl, рН 7,4 50 мМ
нравом = стиль "20" = "высота: 20px; ширина: 299px;"> NaCl 150 мМ
Трис-солевом буфере с Tween 20 (TBST)
Трис-HCl, рН 7,4 50 мМ
NaCl 150 мМ
Tween 20 0,1% (объем / объем)
Привязка буфер
Трис-HCl, рН 8,0 25 мм
NaCl
NaF 5 мм
ЭДТА 0,5 мМ
Глицерин 10% (объем / объем)
ПМСФ 0,1 мм
Вымойте буфера # 1
Трис-HCl, рН 8,0 25 мм
NaCl 500 мм
NaF TD> 5 мм
ЭДТА 0,4 мм
Igepal CA-630 0,2% (объем / объем)
Глицерин 5% (объем / объем)
ПМСФ 0,1 мм
Вымойте буфера # 2
Трис-HCl, рН 8,0 25 мм
NaCl 150 мМ
Трис-HCl, рН 8,0 25 мм
SDS 1% (вес / объем)
0 "> х; "> 550 мм 2 "высота =" "стиль =" 20 высота: 20px; ширина: 597px; "> Элюирующий буфер

Таблица 1. Буферы, используемые в настоящем исследовании.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Процедура очистки схематически показано на фиг.1, вместе с представлением проблем, связанных с другими существующими методами очистки.

figure-results-244
Рисунок 1. Схематическое предста?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Данный протокол может быть использован для очистки любой твин-Strep-меченого приманки интерес белок и связанных комплексов в любом подходящем буфере, который не содержит биотин или сильные денатурирующих. В текущей версии протокола, связывание и стиральная выполняются в относительно ж?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Мы выражаем искреннюю благодарность за техническую поддержку Сини Миеттиненом, Минна Pöllänen и Тару Раутавеси. Мы благодарим Helka Nurkkala для обеспечения НЕК 293 клетки, экспрессирующие твин-Стрептококковое-меткой GFP и Пекка Evijärvi для обеспечения звукового оборудования записи. Эта работа финансировалась Академией Финляндии, предоставить номера 138329, 134684 и 258978.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mgPierce/Thermo Scientific21585www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)IBA2-1505www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterileCostar (Corning)8163www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubesCostar (Corning)3213www.corning.com/lifesciences/
Avidin IBA2-0204www.iba-lifesciences.com

Ссылки

  1. Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).
  2. Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).
  3. Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).
  4. Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).
  5. Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
  6. Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).
  7. Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).
  8. Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).
  9. Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).
  10. Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).
  11. Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).
  12. Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5 (9), (2010).
  13. Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63(2011).
  14. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
  15. Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Biochemistry86StrepStrep TactinBS3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены