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요약

방법은 (연쇄상 구균 - Tactin) 수지가 공유 비스 (술포 숙신 이미 딜) 수베 (BS3)와 가교 수정 스트렙 타비 딘에 트윈 패 혈성 태그가 융합 단백질 및 특정 단지의 효율적인 정제에 설명되어 있습니다. 방법은 빠른 속도, 좋은 표적 단백질의 회수 및 고순도의 이점을 갖고, 질량 분석법에 의한 후속 분석과 호환된다.

초록

설계 스트렙 타비 딘 (연쇄상-Tactin)를 운반하는 수지에 패 혈성 태그가 융합 단백질의 친 화성 정제는 생리 학적 조건에서 단백질 복합체의 분리를위한 널리 사용되는 방법이되고있다. 트윈 패 혈성 태그 또는 SIII 태그를 지정 패 혈성 태그 II의 두 복사본을 포함하는 융합 단백질 따라서보다 효율적인 단백질 정제를 허용, 단 하나의 패 혈성 태그를 포함하는 사람에 비해 연쇄상-Tactin에 대한 높은 친 화성의 장점이 있습니다. 그러나, 이러한 장점은 비오틴과 트윈 연쇄상 구균 - 태그 단백질의 용출이 낮은 단백질 복구에 이르는, 불완전 할 수 있다는 사실에 의해 상쇄된다. 복구 극적 도데 실 황산나트륨 (SDS)으로 변성 용출을 사용함으로써 개선 될 수 있지만 하류 단백질체 분석으로 분석 호환되지 수지로부터 방출 연쇄상-Tactin 오염을 샘플링 리드. 이 한계를 극복하기 위해, 우리는 방법 연쇄상-Tactin의 그것에 수지 결합 사량을 개발했습니다제 공유 비스 (술포 숙신 이미 딜) 수베 레이트 (BS3)와 가교하고, 생성 된 가교 된 수지를 다음 번의 배치 정제 단계에서 목적 단백질 복합체를 정제하는 데 사용함으로써 안정화된다. 패 혈성-Tactin 오염의 부재는 질량 분석에 의한 하류 단백질 분석을 허용하는 동안 SDS와 효율적인 용출, 좋은 단백질 복구를 보장합니다. 개념의 증거로서, 우리는 바이러스에 감염된 N.의 핵에서 VPG-프로 SIII 태그가 바이러스 성 단백질의 정제를 위해 여기 프로토콜을 설명 BS3으로 가교 패 혈성-Tactin의 폴리 메타 크릴 레이트 수지를 사용한 benthamiana 식물. 동일한 프로토콜은 또한 어떤 트윈 연쇄상-태그 단백질을 정제 및 생리 바인딩 파트너를 특성화하는데 사용될 수있다.

서문

최근 몇 년 동안, 패 혈성 태그 기술은 단백질 체학 및 구조 생물학을 포함한 생물 의학 연구의 많은 분야에서 널리 사용되고있다. 짧은 Strep의 태그 펩티드로 재조합 단백질의 융합에 의존이 단백질 정제 기술은, 패 혈성-Tactin 향상된 펩티드 결합능과 스트렙 타비 딘의 유전 공학적 변형을 운반 궁합 행렬들의 출현으로 성숙. 1,2 트윈 패 혈성 태그 또는 SIII 태그, 전시 재조합 단백질을보다 효율적으로 정화를 보장, 단 하나의 패 혈성 태그를 포함하는보다 연쇄상 구균 - Tactin 행렬에 대한 높은 선호도와 지정 패 혈성 태그 II의 두 복사본을 포함하는 융합 단백질 연관된 바인딩 파트너. 그러나, 패 혈성-Tactin에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 단백질의 높은 친화력은 또한 단점이있다. 과량의 비타민 B 복합체와 단백질의 경쟁 용출 대상 단백질 수율 감소로 이어지는, 불완전 할 수 있습니다. M광석 효율적인 대안 SDS와 용출이지만, 프로테오믹스 분석 분석 호환되지 수지에서 발표 연쇄상-Tactin와 바람직하지 않은 샘플의 오염으로 이어집니다. 이 논문은 제 화학적 가교에 의하여 패 혈성-Tactin의 수지 - 결합 사량을 안정화 한 후 얻어진 가교 수지와 트윈 연쇄상-태그 된 단백질과 관련 복합체를 용출 SDS를 사용하여이 제한을 극복하는 기술을 제시한다. 따라서, 충분한 단백질 수율함으로써 질량 분석에 의한 추가 분석을 허용 연쇄상-Tactin 샘플 오염없이 달성 될 수있다.

이 방법은 표면에 노출 된 SIII 태그 3 트윈 패 혈성 태그 (아미노산 서열 WSHPQFEK (GGGS) 각각 3 WSHPQFEK 및 SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK) 어떤 재조합 융합 단백질의 정제를 위해 적당하다. 단백질은 동물, 식물 또는 세균 기원 일 수 있으며 전체 셀 중 하나로부터 단리 될 수있다해물이나 농축 세포 기관의 분수. 예를 들어, 우리는 여기에 PVA에 감염된는 담배 benthamiana 식물의 핵 부분에서 감자 바이러스 A (PVA) 4 SIII 태그가 단백질 VPG-PRO의 정화에 대해 설명합니다. 이전에 다음과 같이 수정하여, 5 바와 같이 핵 분획을 단리 하였다 : 세포를 포름 알데히드로 처리되지 않은, 나트륨 부티레이트를 5 mM의 불소화 나트륨으로 모든 버퍼에 치환하여, 완전 프로테아제 억제제 PMSF로 치환하고, 추출 트리톤 X-100 농도 버퍼 # 2는 0.3 %로 감소 하였다 (V / V) 및 (추출 버퍼 # 3) 자당 쿠션을 통해 원심 분리하여 얻은 핵 펠릿 사전 냉장 바인딩 버퍼의 1.45 ㎖에 재현 탁하고, 4 ℃에서 1.5 시간 동안 회전 SIII-태그 미끼 단백질과 관련된 단지 (미끼 단백질 샘플)를 포함하는 결과 핵 추출물 (섹션 2 참조) 아래에 설명 된 프로토콜에 따라 처리되었습니다.

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프로토콜

1. 비스와 패 혈성-Tactin 폴리 메타 크릴 수지 (술포 숙신 이미 딜)의 가교 수베 (BS3)

  1. 실온 BS3 가교제의 2 ㎎을 함유 한 밀봉 된 마이크로 튜브를 평형화. 주의 : BS3는 유해 물질이다. 보호 장갑과 고글을 착용 할 것.
  2. 재현 탁 패 혈성-Tactin의 폴리 메타 크릴 레이트 수지 (100 MM 트리스 - 염산, 산도 8.0의 50 % 현탁액, 1 mM의 EDTA, 150 mM의 염화나트륨)에 의한 간단한 격렬한 흔들림 즉시에 피펫 팁을 사용하여 스핀 컬럼으로 서스펜션의 600 μl를 전송 끝은 잘라.
  3. 실온에서 30 초 동안 1,500 XG에 원심 분리기. 흐름을 통해 폐기하고 열을 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 450 μl를 추가합니다.
  4. 완전히 PBS로 트리스 버퍼를 교체하고 마지막으로 원심 분리 한 후 pH를 8.0로 조정 PBS 430 μL에 수지를 떠나 이전 단계 2를 번 더 반복합니다.
  5. (100)를 포함하는 피펫 팁 BS3으로 모세관의 호일에 구멍을1, 초순수의 L. 부드럽게 아래로 피펫에 의해 물에 BS3 분말을 녹여 바로 스핀 열 용액 20 μl를 추가합니다. 가교 반응에 BS3의 최종 농도는 ~ 1.2 ㎜이다.
  6. 실온에서 30 분 동안 열을 돌립니다. 수지가 BS3 솔루션을 적절하게 혼합되어 있는지 확인합니다.
  7. 반응을 해소하기 위해, 3M 트리스 - 염산, 산도 7.5의 10 μl를 추가하고 실온에서 또 다른 15 분 동안 열을 돌립니다.
  8. 실온에서 30 초 동안 1,500 XG에 원심 분리기. 흐름을 통해 폐기 및 트리스 450 μL의 가교 수지를 재현 탁은 트윈 20 (TBST)와 완충 식염수. 원심 분리를 반복하고 단계를 두 번 더 씻는다. 마지막 단계에서, TBS 450 μL에 재현 탁 수지.
  9. 끝으로 피펫 팁을 사용하여 새로운 튜브에 수지 현탁액을 전송 차단. TBS의 또 다른 450 μL와 컬럼에 남아있는 수지를 재현 탁하고 같은 튜브에 전송할 수 있습니다. 반복 일한 번 더 튜브에 열에서 수지의 최대 전송을 보장하기 위해 전자 마지막 단계.
  10. 관을 실온에서 10 분간 방치하고 과량의 TBS를 제거하여 600 μL로 볼륨을 조절하자. 수지 (권장) 즉시 사용할 준비가 또는 냉동하지 않고, 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

2. 교차 연결된 연쇄상-Tactin 폴리 메타 크릴 레이트 수지에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 미끼 단백질 및 관련 단지의 바인딩

  1. 4 ° C에서 10 분 동안 17,000 XG에서 버퍼를 결합하고 새로운 튜브에 뜨는을 전송의 미끼 단백질 시료의 원심 분리기 1 ML.
  2. , 패 혈성-Tactin 수지에 내인성 바이오틴 단백질의 결합을 최소화 100 μg / ML의 최종 농도에 아비딘을 추가하고 4 ℃에서 15 분 동안 회전하려면
    1. 단계 1.10에서 가교 수지는 4 ° C에서 장기간 보관 한 경우에, FO 400 XG에서 원심 분리에 의해 수지를 상환4 ° C에서 R 1 분, 상층 액을 버리고 TBST 1 ㎖​​로 수지를 세척한다. 원심 분리를 반복 세척 먼저 TBST로 다음 TBS와 두 번 더, 단계를 반복합니다. 4 ° C에서 1 분 400 XG에 튜브를 원심 분리기 및 초과 TBS를 제거하여 원래 볼륨을 조정합니다.
  3. 볼 텍싱에 의해 가교 된 패 혈성-Tactin 수지에 resuspend. 즉시 컷 피펫 팁을 사용하여 미끼 단백질 샘플이 들어있는 튜브에 수지 현탁액의 50 μl를 추가하고 4 ℃에서 또 다른 30 ​​분 동안 회전
  4. 기다리는 동안, 55 ° C에 thermomixer을 설정하고 단계 3.1에서 사용하기 위해 용출 버퍼 500 μl를 예열.
  5. 4 ℃에서 1 분 400 XG에 원심 분리기 뜨는을 취소하고 미리 냉각 세척 버퍼 1 중 1 ㎖를 4 ° C에서 5 분 동안 회전에 수지를 씻어. 원심 분리를 반복하고 단계를 세 번 씻는다. 마지막 단계에서, 세척 버퍼 # 2 250 μL의 수지를 재현 탁.
  6. TR 신선한 스핀 열 수지 현탁액을 ansfer. 세척 버퍼 # 2의 또 다른 250 μL의 튜브에 남아있는 수지를 재현 탁하고 같은 C 럼에 전송할 수 있습니다.
  7. 4 ° C에서 3 분 400 XG에 원심 분리기, 흐름을 통해 폐기하고 신선한 돌고래 코 2 ㎖ 튜브에 열을 전송합니다. 아래의 용출 단계로 바로 진행합니다.

특정 단백질 복합체의 3. 용출

  1. 스핀 컬럼에 2.4 단계에서 예열 된 용출 버퍼 150 μl를 추가합니다.
  2. 1,400 rpm으로 흔들어, 55 ° C에서 5 분 thermomixer에 품어.
  3. 실온에서 1 분 1,500 XG에 원심 분리기.
  4. 열을 버리고 ≤ -20 ℃에서 정제 된 표적 단백질을 저장
인산염 완충 생리 식염수 (PBS)
나 2 HPO 4 10 mM의
KH 2 PO 4 2mM의
염화나트륨 137 밀리
의 KCl 2.7 mM의
(섹션 1.4의 pH 8.0) 달리 명시되지 않는 pH는 7.4로 조정
트리스 (TBS)를 완충 식염수
트리스 - 염산, pH 7.4의 50 mM의
GHT = "20"스타일 = "높이 : 20px의 폭 : 299px;"> 염화나트륨 150 밀리미터
트리스는 트윈 20 (TBST)와 완충 식염수
트리스 - 염산, pH 7.4의 50 mM의
염화나트륨 150 밀리미터
트윈 20 0.1 % (V / V)
바인딩 버퍼
트리스 - 염산, pH를 8.0 25 mM의
염화나트륨
불화 나트륨 5 mM의
EDTA 0.5 ㎜
글리세린 10 % (V / V)
PMSF 0.1 ㎜
버퍼 # 1을 씻으
트리스 - 염산, pH를 8.0 25 mM의
염화나트륨 500 밀리미터
불화 나트륨 TD> 5 mM의
EDTA 0.4 ㎜
이게 팔 CA-630 0.2 % (V / V)
글리세린 5 % (V / V)
PMSF 0.1 ㎜
버퍼 # 2를 세척
트리스 - 염산, pH를 8.0 25 mM의
염화나트륨 150 밀리미터
트리스 - 염산, pH를 8.0 25 mM의
SDS 1 % (W / V)
0 "> X; "> 550 밀리미터 2 "높이 ="20 "스타일 ="높이 : 20px의 폭 : 597px; "> 용출 버퍼

표 1. 본 연구에 사용 된 버퍼.

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결과

정화 절차를 개략적으로 서로 다른 기존의 정제 방법과 관련된 문제의 표현과 함께,도 1에 도시되어있다.

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그림 1. 정화 절차의 도식 표현. 워크 플로는 공유가 가교 수지에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 미끼 단백질과 연관된 복합체의 결합...

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토론

상기 프로토콜은 비오틴 또는 강한 변성제를 포함하지 않는 임의의 적절한 버퍼에 대한 관심 및 관련 착체의 트윈-Strep의 태그 미끼 단백질을 정제하는데 사용될 수있다. 프로토콜의 현재 버전에서, 결합 및 세척이 높은 염과 비 이온 세제의 존재하에 비교적 엄격한 조건하에 수행된다. 이 적은 배경을 초래하지만, 깨지기 쉬운 단백질 복합체는 이러한 조건에서 해리 수 있습니다. 이러한 낮은 친?...

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공개

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 말

우리는 기꺼이 시니 Miettinen, 미나 Pöllänen 및 한인 Rautavesi의 기술 지원을 인정합니다. 우리는 HEK에게 녹음 장비를 제공하는 트윈 연쇄상 구균 - 태그 GFP 및 페카 Evijärvi을 표현하는 293 세포를 제공 헬카 Nurkkala 감사합니다. 이 작품은 핀란드의 아카데미에 의해 투자되었다, 번호 138329, 134684 및 258978을 부여합니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mgPierce/Thermo Scientific21585www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)IBA2-1505www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterileCostar (Corning)8163www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubesCostar (Corning)3213www.corning.com/lifesciences/
Avidin IBA2-0204www.iba-lifesciences.com

참고문헌

  1. Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).
  2. Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).
  3. Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).
  4. Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).
  5. Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
  6. Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).
  7. Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).
  8. Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).
  9. Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).
  10. Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).
  11. Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).
  12. Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5 (9), (2010).
  13. Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63(2011).
  14. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
  15. Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45(2011).

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