One-step purificazione di proteine ​​Twin-Strep-taggate e dei loro complessi su Strep-Tactin resina reticolato con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3)

Riepilogo

Un metodo è descritto per la purificazione efficiente di proteine ​​di fusione twin-Strep-tag e dei loro complessi specifiche in materia di streptavidina modificato (Strep-Tactin) resina covalentemente reticolato con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3). Il metodo ha i vantaggi di velocità veloce, buon recupero proteina bersaglio ed elevata purezza, ed è compatibile con la successiva analisi mediante spettrometria di massa.

Abstract

Purificazione per affinità di proteine ​​di fusione Strep-targhetta di resine che trasportano una streptavidina allestita (Strep-Tactin) è diventato un metodo ampiamente utilizzato per l'isolamento di complessi proteici in condizioni fisiologiche. Proteine ​​di fusione contenenti due copie di Strep-tag II, designate twin-Strep-tag o SIII-tag, hanno il vantaggio di una maggiore affinità per Strep-Tactin rispetto a quelli che contengono un solo Strep-tag, permettendo così più efficiente purificazione di proteine. Tuttavia, questo vantaggio è compensato dal fatto che eluizione delle proteine ​​twin-Strep-taggate con biotina può essere incompleta, portando a basso recupero di proteine. Il recupero può essere notevolmente migliorata utilizzando denaturazione eluizione con sodio dodecil solfato (SDS), ma questo porta a campionare contaminazione con Strep-Tactin rilasciato dalla resina, rendendo il saggio incompatibile con analisi proteomica valle. Per superare questa limitazione, abbiamo sviluppato un metodo in base al quale tetramero resina accoppiata di Strep-Tactinè prima stabilizzato da covalente reticolazione con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3) e la resina reticolata risultante viene poi utilizzato per purificare bersaglio complessi proteici in un singolo passaggio di purificazione batch. Eluizione efficiente con SDS assicura buon recupero proteina, mentre l'assenza di contaminazione Strep-Tactin permette valle proteina analisi mediante spettrometria di massa. Come un proof of concept, descriviamo qui un protocollo per la purificazione della proteina virale SIII-tagged VPG-Pro da nuclei di N. infettato da virus piante benthamiana utilizzando la resina di polimetacrilato Strep-Tactin reticolato con BS3. Lo stesso protocollo può essere utilizzato per purificare qualsiasi proteina twin-Strep-tag di interesse e caratterizzare suoi partner di legame fisiologiche.

Introduzione

Negli ultimi anni, la tecnologia Strep-tag è stato ampiamente utilizzato in molti settori della ricerca biomedica, tra cui la proteomica e la biologia strutturale. Questa tecnologia purificazione della proteina, che si basa sulla fusione di proteine ​​ricombinanti ad una breve Strep-tag peptide, è maturata con l'avvento di matrici di affinità che trasportano Strep-Tactin, una variante geneticamente di streptavidina con una migliore capacità di legame peptidico. ^{1, 2} proteine ​​di fusione contenenti due copie di Strep-tag II, designate twin-Strep-tag o SIII-tag, mostrano una maggiore affinità per le matrici Strep-Tactin di quelli contenenti un solo Strep-tag, garantendo la depurazione più efficiente delle proteine ​​ricombinanti e i loro partner di legame associate. Tuttavia, la maggiore affinità delle proteine ​​twin-Strep-tagged per Strep-Tactin ha anche il suo rovescio della medaglia. Eluizione concorrenziale di tali proteine ​​con eccesso di biotina può essere incompleta, con conseguente riduzione della resa di proteine ​​bersaglio. A mminerale efficiente alternativa è eluizione con SDS, ma porta alla contaminazione del campione indesiderato con Strep-Tactin rilasciato dalla resina, rendendo il test incompatibile con l'analisi proteomica. Questo articolo presenta una tecnica per superare questa limitazione prima stabilizzazione del tetramero resina accoppiata di Strep-Tactin dal chimico cross-linking e quindi utilizzando SDS per eluire le proteine ​​twin-Strep-taggate e dei loro complessi associati dalla risultante resina reticolata. Così, sufficiente resa di proteine ​​può essere realizzata senza contaminazione del campione con Strep-Tactin, consentendo così un'ulteriore analisi mediante spettrometria di massa.

Il metodo è adatto per la purificazione di una proteina di fusione ricombinante con un SIII-tag-superficie esposta ³ o twin-Strep-tag (WSHPQFEK sequenza aminoacidica (GGGS) ₃ WSHPQFEK e SAWSHPQFEK (GGGS) ₂ GGSAWSHPQFEK, rispettivamente). La proteina può essere di origine animale, vegetale o batterica e può essere isolato da entrambi cellulare totalelisato o frazione organello arricchito. Come esempio, si descrive qui la purificazione di una proteina SIII-tag VPG-Pro di Potato virus A (PVA) ⁴ dalla frazione nucleare di PVA-infettati Nicotiana benthamiana. La frazione nucleare è stato isolato come descritto in precedenza ^5, con le seguenti modifiche: cellule non sono state trattate con formaldeide, butirrato di sodio è stato sostituito in tutti i buffer con fluoruro di sodio 5 mM, inibitore della proteasi completo è stato sostituito con PMSF, Triton X-100 in concentrazione estrazione tampone # 2 è stato ridotto al 0,3% (v / v) e il pellet nucleare ottenuto mediante centrifugazione attraverso cuscino di saccarosio (tampone di estrazione # 3) è stato risospeso in 1,45 ml di tampone di legame pre-raffreddata e ruotata per 1,5 ore a 4 ° C. L'estratto nucleare risultante contiene la proteina esca SIII-tag e complessi associati (campione proteina esca) è stato elaborato secondo il protocollo descritto di seguito (vedere paragrafo 2).

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Protocollo

1. Cross-linking di Strep-Tactin Polimetacrilato resina con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3)

1. Equilibrare una provetta sigillata contenente 2 mg di BS3 reticolante a temperatura ambiente. ATTENZIONE: BS3 è una sostanza pericolosa. Indossare guanti e occhiali protettivi.
2. Risospendere Strep-Tactin resina di polimetacrilato (sospensione al 50% in 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) di breve vigorosa agitazione e trasferire immediatamente 600 ml di sospensione ad una colonna di spin con un puntale con l' end tagliata.
3. Centrifugare a 1500 xg per 30 secondi a temperatura ambiente. Scartare il flow-through e aggiungere 450 ml di tampone fosfato salino (PBS) alla colonna.
4. Ripetere il passaggio precedente 2 più volte per sostituire completamente tampone Tris con PBS e lasciare la resina in 430 ml di PBS a pH 8,0 dopo l'ultima centrifugazione.
5. Forare il foglio della provetta con BS3 con un puntale contenente 1001; l di acqua ultrapura. Sciogliere la polvere BS3 in acqua pipettando gentilmente su e giù e immediatamente aggiungere 20 ml di soluzione alla colonna di spin. La concentrazione finale di BS3 nella reazione di reticolazione è ~ 1,2 mM.
6. Ruotare la colonna per 30 minuti a temperatura ambiente. Verificare che la resina viene miscelata correttamente con la soluzione BS3.
7. Per spegnere la reazione, aggiungere 6 ml di 3M Tris-HCl, pH 7.5 e ruotare la colonna per altri 15 minuti a temperatura ambiente.
8. Centrifugare a 1500 xg per 30 secondi a temperatura ambiente. Gettare il flow-through e risospendere la resina reticolata in 450 ml di soluzione salina tamponata Tris con Tween 20 (TBST). Ripetere la centrifugazione e lavare i passaggi altre due volte. Nell'ultima fase, risospendere la resina in 450 ml di TBS.
9. Trasferire la sospensione di resina in una nuova provetta utilizzando una punta di pipetta con l'estremità tagliata. Risospendere la resina nella colonna a sinistra con altri 450 ml di TBS e trasferimento al tubo stesso. Ripetere the ultimo passo nuovamente al massimo il trasferimento della resina dalla colonna al tubo.
10. Lasciare riposare la provetta per 10 minuti a temperatura ambiente e regolare il volume a 600 ml rimuovendo l'eccesso di TBS. La resina è pronta per l'uso immediato (raccomandato) o può essere conservato a 4 ° C, senza congelare.

2. Legame della proteina Bait Twin-Strep-tag e associate Complessi al Cross-linked Strep-Tactin Polimetacrilato Resina

1. Centrifugare 1 ml del campione proteina esca in tampone di legame a 17.000 xg per 10 min a 4 ° C e trasferire il surnatante in una nuova provetta.
2. Per minimizzare legame di proteine ​​endogene biotinilati alla resina Strep-Tactin, aggiungere avidina ad una concentrazione finale di 100 pg / ml e ruotare per 15 min a 4 ° C.
   1. Se la resina reticolata dal punto 1.10 è stato conservato per un periodo di tempo prolungato a 4 ° C, raccogliere la resina mediante centrifugazione a 400 xg for 1 min a 4 ° C, scartare il surnatante e lavare la resina con 1 ml di TBST. Ripetere la centrifugazione e lavaggio passaggi altre due volte, prima con TBST e poi con TBS. Centrifugare la provetta a 400 xg per 1 min a 4 ° C e regolare al volume originale rimuovendo l'eccesso di TBS.
3. Risospendere il reticolato resina Strep-Tactin nel vortex. Immediatamente aggiungere 50 microlitri della sospensione resina per il tubo contenente il campione di proteina esca con una punta di pipetta taglio e ruotare per altri 30 min a 4 ° C.
4. Durante l'attesa, impostare thermomixer a 55 ° C e preriscaldare 500 microlitri di tampone di eluizione per uso nel passaggio 3.1.
5. Centrifugare a 400 xg per 1 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e lavare la resina su un rotatore per 5 minuti a 4 ° C con 1 ml di pre-raffreddata tampone di lavaggio # 1. Ripetere la centrifugazione e lavare passi tre volte. Nell'ultima fase, risospendere la resina in 250 ml di tampone di lavaggio # 2.
6. Tr ansfer la sospensione resina per una colonna di spin fresco. Risospendere la resina rimanente nel tubo in altri 250 ml di tampone di lavaggio # 2 e trasferire alla stessa colonna.
7. Centrifugare a 400 xg per 3 min a 4 ° C, scartare il flow-through e trasferire la colonna di una fiala delfini naso 2 ml. Procedere immediatamente alla fase di eluizione sotto.

3. Eluizione di specifici complessi proteici

1. Aggiungere 150 ml di tampone di eluizione preriscaldato dal punto 2.4 alla colonna di spin.
2. Incubare in thermomixer per 5 minuti a 55 ° C, agitando a 1.400 rpm.
3. Centrifugare a 1500 xg per 1 minuto a temperatura ambiente.
4. Eliminare la colonna e memorizzare le proteine ​​bersaglio purificate a ≤ -20 ° C.

Tampone fosfato salino (PBS)
Na 2 HPO 4	10 mM
KH 2 PO 4	2mM
NaCl	137 mm
KCl	2.7 mM
pH regolato a 7,4 se non diversamente specificato (pH 8.0 nella sezione 1.4)
Tris soluzione salina tamponata (TBS)
Tris-HCl, pH 7.4	50 mM
ght = stile "20" = "height: 20px; width: 299px;"> NaCl	150 mm
Tris tamponata salina con Tween 20 (TBST)
Tris-HCl, pH 7.4	50 mM
NaCl	150 mm
Tween 20	0,1% (v / v)
Tampone di legame
Tris-HCl, pH 8.0	25 mm
NaCl
NaF	5 mM
EDTA	0,5 mm
Glicerina	10% (v / v)
PMSF	0,1 mm
Lavare tampone # 1
Tris-HCl, pH 8.0	25 mm
NaCl	500 mm
NaF td>	5 mM
EDTA	0,4 mm
Igepal CA-630	0,2% (v / v)
Glicerina	5% (v / v)
PMSF	0,1 mm
Lavare tampone # 2
Tris-HCl, pH 8.0	25 mm
NaCl	150 mm
Tris-HCl, pH 8.0	25 mm
SDS	1% (w / v)

0 "> x "> 550 mm 2 "height =" "style =" 20 height: 20px; width: 597px; "> tampone di eluizione

Tabella 1. Buffer utilizzati nel presente studio.

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Risultati

La procedura di purificazione è schematicamente illustrato in Figura 1, con una rappresentazione di problemi associati con altri metodi di purificazione esistenti.

Figura 1. Rappresentazione schematica della procedura di purificazione. Il flusso di lavoro comprende stabilizzazione della Strep-Tactin tetram...

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Discussione

Il protocollo di cui sopra può essere usato per purificare qualsiasi proteina esca twin-Strep-tag di interesse e suoi complessi associati in qualsiasi tampone adatto che non contiene biotina o denaturanti forti. Nella versione attuale del protocollo, vincolante e lavaggio vengono eseguiti in condizioni relativamente restrittive in presenza di elevata sale e detergente non ionico. Anche se questo si traduce in meno sfondo, complessi proteici fragili possono dissociare in queste condizioni. Per conservare tali complessi ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg	Pierce/Thermo Scientific	21585	www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)	IBA	2-1505	www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile	Costar (Corning)	8163	www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubes	Costar (Corning)	3213	www.corning.com/lifesciences/
Avidin	IBA	2-0204	www.iba-lifesciences.com