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要約

この方法は、ツインのStrepタグ融合タンパク質と共有結合的にビス（スルホスクシンイミジル）（BS3）で架橋された修正されたストレプトアビジン（ストレプト-Tactinの）樹脂上での具体的な複合体の効率的な精製方法が記載されている。この方法は、速い速度の利点は、良好な標的タンパク質の回収および高純度を有し、質量分析によるその後の分析に対応している。

要約

操作されたストレプトアビジン（のStrep-Tactinの）を有する樹脂上Strepタグ融合タンパク質のアフィニティー精製は、生理学的条件下でタンパク質複合体の単離のために広く用いられる方法となった。ツインStrepタグまたはSIIIタグを指定StrepタグIIの2つのコピーを含有する融合タンパク質は、より効率的なタンパク質精製を可能にする、単一のStrepタグを含有するものと比較してのStrep-Tactinのための高い親和性の利点を有する。しかし、この利点は、ビオチンとのツインStrepタグタンパク質の溶出は低タンパク質の回収につながる、不完全になる可能性があるという事実によって相殺される。回収率は劇的にドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で変性溶出を使用することによって改善することができるが、これは下流のプロテオーム解析を用いたアッセイ互換性がなくなり、樹脂から遊離のStrep-Tactinの混入をサンプリングするために導く。この制限を克服するために、我々は、ストレプト-Tactinの方法により、樹脂結合型四量体を開発した第ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）で処理し、得られた架橋樹脂との架橋は、単一のバッチ精製段階における標的タンパク質複合体を精製するために使用される共有結合によって安定化される。ストレプト-Tactinのを汚染の不在は、質量分析による下流のタンパク質分析を可能にしながら、SDSによる効率的な溶出は、優れたタンパク質回収を確実にします。概念実証として、我々はここではウイルスに感染したNの核からSIIIタグ付きウイルスタンパク質のVPg-Proを精製するためのプロトコルを記述BS3と架橋したストレプト-Tactinのポリメタクリレート樹脂を用いてベンサミアナタバコ植物 。同じプロトコルは、目的の任意の二Strepタグタンパク質を精製し、その生理学的結合パートナーを特徴付けるために使用することができる。

概要

近年では、Strepタグ技術は、プロテオミクスと構造生物学などの生物医学研究の多くの分野で広く使用されるようになった。ショートStrepタグペプチドに組換えタンパク質の融合に依存するこのタンパク質精製技術は、ストレプト-Tactinの、改良されたペプチド結合能を有するストレプトアビジンの遺伝子操作された変異体を担持するアフィニティーマトリックスの出現により成熟した図1、図2ツインStrepタグまたはSIIIタグを指定StrepタグIIの2つのコピーを含有する融合タンパク質は、組換えタンパク質のより効率的な浄化を保証する、単一のStrepタグを含有するものよりストレプ-Tactinのマトリックスに対して高い親和性を示し、そしてそれに関連付けられた結合パートナー。しかし、連鎖球菌-TactinのにツインStrepタグタンパク質の高い親和性はまた、その欠点を持っています。過剰のビオチンを有するこのようなタンパク質の競合的溶出は、標的タンパク質の収率の低下につながる、不完全であってもよい。 M鉱石効率的な代替は、SDSで溶出されていますが、プロテオーム解析を用いたアッセイ互換性がなくなり、樹脂から遊離のStrep-Tactinのとの望ましくないサンプル汚染につながる。本論文では、最初に化学架橋した後、得られる架橋樹脂からツインStrep-tag IIタグタンパク質およびそれに関連する複合体を溶出させるために、SDSを使用してのStrep-Tactinの樹脂結合型四量体を安定化させることにより、この制限を克服するための技術を提供します。したがって、十分なタンパク質収量、それによって、質量分析によるさらなる分析を可能にする、ストレプト-Tactinの試料汚染することなく達成することができる。

この方法は、表面に露出SIIIタグ3又は二Strepタグ（アミノ酸配列WSHPQFEK（GGGS）3 WSHPQFEKそれぞれSAWSHPQFEK（GGGS）2 GGSAWSHPQFEK）を有する任意の組換え融合タンパク質の精製に適している。タンパク質は、動物、植物または細菌起源のものとすることができ、全細胞のいずれかから単離することができる溶解物または濃縮された細胞小器官画。例として、ここでは、PVAに感染したベンサミアナタバコ植物の核画分からのジャガイモウイルスA（PVA）4のSIIIタグ化タンパク質のVPg -プロの精製を説明します。以前に以下の改変を、5に記載のように、核画分を単離した細胞をホルムアルデヒドで処理しなかった、酪酸ナトリウム、5 mMのフッ化ナトリウムとのすべてのバッファに置換し、完全プロテアーゼ阻害剤は、PMSFで置換し、抽出におけるトリトンX-100濃度バッファ＃2は0.3％に低下した（v / v）で（抽出緩衝液＃3）ショ糖クッションを通した遠心分離により得られた核ペレットを、予め冷却した結合緩衝液1.45中に再懸濁し、4℃で1.5時間回転SIIIタグ化ベイトタンパク質と会合した複合体（ベイトタンパク質試料）を含有する得られた核抽出物（セクション2を参照）、以下に記載されるプロトコルに従って処理した。

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プロトコル

ビスのStrep-Tactinのポリメタクリレート樹脂の1。架橋（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）

  1. 室温にBS3架橋剤の2ミリグラムを含む1密封されたマイクロチューブを平衡化させます。注意：BS3は、危険な物質である。保護手袋、ゴーグルを着用してください。
  2. 再懸濁のStrep-Tactinのメタクリル樹脂（100 mMトリス - 塩酸、pH8.0の50％懸濁液、1mMのEDTA、150mMのNaCl）による簡単な激しく振盪し、すぐにピペットチップを用いてスピンカラムに懸濁液600μLを転送最後に切り落とした。
  3. 室温で30秒間1500×gで遠心分離する。フロースルーを捨て、カラムにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）450μlのを追加します。
  4. 完全にPBSでトリス緩衝液を交換し、最後の遠心分離後のpHを8.0に調整のPBS 430μlに樹脂を残すように、前のステップ2を複数回繰り返します。
  5. 100を含むピペットチップでBS3とマイクロチューブの箔を穿刺1、超純水のL。優しく上下にピペッティングし、水中でBS3の粉末を溶解し、すぐにスピンカラムに溶液20μlを加える。架橋反応におけるBS3の最終濃度は〜1.2 mMである。
  6. 室温で30分の列を回転させます。樹脂はBS3溶液と適切に混合されていることを確認してください。
  7. 反応をクエンチし、3Mのトリス-HCl、pH7.5中の6μlを添加し、室温でさらに15分間、カラムを回転させる。
  8. 室温で30秒間1500×gで遠心分離する。フロースルーを捨て、トリス450μlの中で架橋した樹脂を再懸濁トゥイーン20（TBST）で緩衝生理食塩水。遠心分離を繰り返して、手順をさらに2回洗う。最後のステップでは、TBSを450μlの樹脂を再懸濁。
  9. カットオフ末にピペットチップを使用して、新しいチューブに樹脂懸濁液を転送します。 TBS系の別の450μLでカラムに残った樹脂を再懸濁し、同じチューブに移す。繰り返し目もう一度チューブにカラムからの樹脂の最大転送を確保するための電子最後のステップ。
  10. チューブを室温で10分間放置し、過剰のTBSを除去して600μlの体積を調整してみましょう。樹脂は、そのまま使用することができます（推奨）または凍結することなく、4℃で保存することができます。

2。架橋のStrep-Tactinのポリメタクリレート樹脂にツイン·Strepタグbaitタンパク質と会合した複合体の結合

  1. 4℃で10分間、17,000×gで、結合緩衝液中のベイトタンパク質サンプルの遠心分離機1 mlの上清を新しいチューブに移す。
  2. 、連鎖球菌-Tactinの樹脂に対する内因性ビオチン化タンパク質の結合を最小限に100μg/ mlのの最終濃度にアビジンを追加し、4℃で15分間回転させるには
    1. ステップ1.10から架橋された樹脂は4℃で長期間保管した場合、400×gでのfoでの遠心分離によって樹脂を回収4℃でR 1分、上清を廃棄し、TBST 1mlで樹脂を洗浄。遠心分離を繰り返し、洗浄は、まずTBSTで、その後TBSで2回、繰り返します。 4℃で1分間400×gでチューブを遠心分離し、過剰のTBSを削除して元のボリュームに調節してください。
  3. ボルテックスにより架橋された連鎖球菌-Tactinの樹脂を再懸濁します。すぐに切断されたピペットチップを用いてベイトタンパク質試料を含むチューブに樹脂懸濁液50μlを添加し、4℃でさらに30分間回転させる
  4. 待っている間、55℃にサーモを設定し、ステップ3.1で使用するために、溶出緩衝液500μlを予熱。
  5. 4℃で1分間400×gで遠心分離上澄み液を捨て、あらかじめ冷却洗浄バッファー＃1の1ミリリットルで4℃で5分間ローテーター上樹脂を洗浄。遠心分離を繰り返して、手順3回洗浄する。最後のステップでは、洗浄バッファー＃2の250μlの樹脂を再懸濁。
  6. TR新鮮なスピンカラムに樹脂懸濁液をansfer。洗浄バッファー＃2の別の250μlのチューブ内に残った樹脂を再懸濁し、同じ列に移す。
  7. 4℃で3分間400×gで遠心し、フロースルーを捨て、新鮮なイルカ鼻2ミリリットルチューブにカラムを移す。以下の溶出ステップにすぐに進んでください。

特定のタンパク質複合体の3。溶出

  1. ステップ2.4​​からのスピンカラムに予熱した溶出バッファー150μLを加える。
  2. 1,400 rpmで振とうし、55℃で5分間サーモミキサー中でインキュベートする。
  3. 室温で1分間1500×gで遠心分離する。
  4. 列を捨て、≤-20℃で精製された標的タンパク質を保存する
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）
のNa 2 HPO 4 10 mMの
KH 2 PO 4 2mMの
NaClを 137 mMの
塩化カリウム 2.7 mMの
（セクション1.4のpH 8.0）、特に明記しない限り、pHを7.4に調整した
トリス生理食塩水（TBS）にバッファリングされた
トリス-HCl、pH7.4の 50 mMの
GHT = "20"スタイル= "高さ：ULは幅：299px;">のNaCl 150 mMの
トリスはトゥイーン20（TBST）で緩衝化生理食塩水
トリス-HCl、pH7.4の 50 mMの
NaClを 150 mMの
トゥイーン20 0.1％（v / v）の
結合バッファー
トリス-HCl、pH8.0の 25 mMの
NaClを
NaFを 5 mMの
EDTA 0.5 mMの
グリセロール 10％（v / v）の
PMSF 0.1 mMの
洗浄バッファー＃1
トリス-HCl、pH8.0の 25 mMの
NaClを 500 mMの
NaFを TD> 5 mMの
EDTA 0.4 mMの
IGEPAL CA-630 0.2％（v / v）の
グリセロール 5％（v / v）の
PMSF 0.1 mMの
洗浄バッファー＃2
トリス-HCl、pH8.0の 25 mMの
NaClを 150 mMの
トリス-HCl、pH8.0の 25 mMの
SDS 1％（w / v）の
0 "> X; "> 550 mMの2 "高さ=" 20 "スタイル="高さ：ULは幅：597px; ">溶出バッファー

表1本研究で用いたバッファ。

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結果

精製手順を模式的に一緒に他の既存の精製方法に伴う問題の表現と、 図1に示されている。

figure-results-151
図1精製手順の概略図。ワークフローは、共有結合架橋樹脂に二Strepタグベイトタンパク質と会合した複合体の結合を、BS3との架橋を介して樹?...

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ディスカッション

上記のプロトコルは、ビオチンまたは強力な変性剤を含まない任意の適切な緩衝液中の目的とそれに関連する複合体のいずれかの二Strepタグベイトタンパク質を精製するために使用することができる。プロトコルの現在のバージョンでは、結合および洗浄は、高い塩および非イオン性界面活性剤の存在下で比較的ストリンジェントな条件下で行われる。これはより少ないバックグラウンドを?...

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開示事項

利害の対立が宣言されていません。

謝辞

我々は感謝SiniがMiettinen、みんなPöllänenとたるRautavesiの技術サポートを認める。私たちは、HEKに録音機器を提供するためのツインStrepタグ、GFPとペッカEvijärviを発現する293細胞を提供するためのヘルカNurkkalaに感謝します。この作品は、フィンランド·アカデミーによって資金を供給された、数字138329、134684と258978を付与します。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mgPierce/Thermo Scientific21585www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)IBA2-1505www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterileCostar (Corning)8163www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubesCostar (Corning)3213www.corning.com/lifesciences/
Avidin IBA2-0204www.iba-lifesciences.com

参考文献

  1. Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).
  2. Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).
  3. Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).
  4. Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).
  5. Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
  6. Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).
  7. Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).
  8. Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).
  9. Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).
  10. Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).
  11. Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).
  12. Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5 (9), (2010).
  13. Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63(2011).
  14. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
  15. Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45(2011).

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