De un solo paso de purificación de proteínas etiquetadas-Twin-Strep y sus complejos de Strep-Tactin resina reticulado con Bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3)

Resumen

Se describe un método para la purificación eficiente de proteínas de fusión doble-Strep-etiquetados y sus complejos específicos sobre estreptavidina modificada (Strep-Tactin) de resina covalentemente reticulado con bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3). El método tiene las ventajas de velocidad rápida, buena recuperación proteína diana y alta pureza, y es compatible con el análisis posterior por espectrometría de masas.

Resumen

La purificación por afinidad de proteínas de fusión Strep-etiquetados en resinas que llevan una estreptavidina de ingeniería (Strep-Tactin) se ha convertido en un método ampliamente utilizado para el aislamiento de complejos de proteínas en condiciones fisiológicas. Las proteínas de fusión que contienen dos copias de Strep-tag II, designado doble-Strep-tag o SIII-etiqueta, tienen la ventaja de una mayor afinidad por Strep-Tactin en comparación con los que contienen sólo un único marcador Strep, permitiendo de este modo la purificación de proteínas más eficiente. Sin embargo, esta ventaja se ve compensada por el hecho de que la elución de las proteínas marcadas con doble Strep con biotina puede ser incompleta, lo que lleva a la recuperación baja en proteínas. La recuperación se puede mejorar drásticamente mediante el uso de elución desnaturalizante con dodecil sulfato de sodio (SDS), pero esto conduce a la contaminación de la muestra con Strep-Tactin liberado de la resina, por lo que el ensayo incompatible con el análisis proteómico de aguas abajo. Para superar esta limitación, se ha desarrollado un método por el cual tetrámero acoplado a la resina de Strep-Tactinprimero se estabiliza mediante la reticulación covalente con bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3) y la resina reticulada resultante se utiliza a continuación para purificar los complejos de proteína diana en una única etapa de purificación por lotes. Elución eficiente con SDS asegura una buena recuperación de proteína, mientras que la ausencia de contaminación de Strep-Tactin permite el análisis de proteínas aguas abajo por espectrometría de masas. Como una prueba de concepto, se describe aquí un protocolo para la purificación de la proteína viral SIII etiquetada VPg-Pro a partir de núcleos de N. infectados por el virus benthamiana plantas utilizando la resina de polimetacrilato de Strep-Tactin reticulado con BS3. El mismo protocolo se puede utilizar para purificar cualquier proteína marcada-Strep-gemelo de interés y caracterizar sus parejas de unión fisiológicos.

Introducción

En los últimos años, la tecnología Strep-tag ha sido ampliamente utilizado en muchas áreas de la investigación biomédica, incluida la proteómica y la biología estructural. Esta tecnología de purificación de proteínas, que se basa en la fusión de proteínas recombinantes a un péptido Strep-tag corto, ha madurado con el advenimiento de matrices de afinidad que llevan Strep-Tactin, una variante modificada genéticamente de la estreptavidina con la mejora de la capacidad de unión al péptido. ^{1, 2} Las proteínas de fusión que contienen dos copias de Strep-tag II, designado twin-Strep-tag o SIII-tag, muestran una mayor afinidad por matrices Strep-Tactin que las que contienen sólo un único Strep-tag, asegurando la purificación más eficiente de las proteínas recombinantes y sus parejas de unión asociados. Sin embargo, la mayor afinidad de las proteínas marcadas con doble Strep a Strep-Tactin también tiene su lado negativo. Elución competitiva de estas proteínas con el exceso de biotina puede ser incompleta, lo que lleva a la disminución de la producción de proteína objetivo. Una mmineral eficiente alternativa es elución con SDS, pero conduce a contaminación de la muestra no deseado con Strep-Tactin liberado de la resina, por lo que el ensayo incompatible con el análisis proteómico. Este trabajo presenta una técnica para superar esta limitación por primera estabilizar el tetrámero unido a resina de Strep-Tactin por entrecruzamiento químico y luego utilizando SDS para eluir proteínas etiquetadas-twin-Strep y sus complejos asociados de la resina reticulada resultante. Por lo tanto, suficiente rendimiento de proteína se puede lograr sin contaminación de la muestra con Strep-Tactin, permitiendo de este modo su posterior análisis por espectrometría de masas.

El método es adecuado para la purificación de cualquier proteína de fusión recombinante con una SIII-tag expuesto a la superficie ³ o twin-Strep-tag (secuencia de aminoácidos WSHPQFEK (GGGS) ₃ WSHPQFEK y SAWSHPQFEK (GGGS) ₂ GGSAWSHPQFEK, respectivamente). La proteína puede ser de origen animal, vegetal o bacteriana y puede ser aislado a partir de ya sea total de célulaslisado o fracción enriquecida orgánulo. Como un ejemplo, se describe aquí la purificación de una proteína-SIII etiquetado VPg-Pro de la patata de virus A (PVA) ⁴ de la fracción nuclear de plantas de Nicotiana benthamiana infectadas por el PVA. La fracción nuclear se aisló tal como se describe anteriormente ^5, con las siguientes modificaciones: las células no fueron tratados con formaldehído, butirato de sodio fue sustituido en todos los tampones con fluoruro de sodio 5 mM, inhibidor de proteasa completo fue sustituido con PMSF, Triton X-100 en la extracción de concentración tampón # 2 se redujo a 0,3% (v / v) y el sedimento nuclear obtenido por centrifugación a través de colchón de sacarosa (tampón de extracción # 3) se resuspendió en 1,45 ml de tampón de unión enfriado previamente y se hace girar durante 1,5 horas a 4 ° C. El extracto nuclear resultante que contiene la proteína cebo-etiquetados SIII y complejos asociados (muestra cebo de proteína) se procesó de acuerdo con el protocolo descrito a continuación (véase la sección 2).

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Protocolo

1. La reticulación de Strep-Tactin polimetacrilato de resina con Bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3)

1. Equilibrar un microtubo sellado que contiene 2 mg de BS3 agente de reticulación a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: BS3 es una sustancia peligrosa. Utilice guantes y gafas protectoras.
2. Resina de polimetacrilato Resuspender Strep-Tactin (suspensión al 50% en 100 mM de Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 1 mM; NaCl 150 mM) mediante una breve agitación vigorosa y transferir inmediatamente 600 l de la suspensión a una columna de centrifugación usando una punta de pipeta con la extremo cortado.
3. Centrifugar a 1500 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. Desechar el flujo a través y añadir 450 l de tampón fosfato salino (PBS) a la columna.
4. Repita el paso anterior 2 veces más para reemplazar completamente el tampón Tris con PBS y dejar la resina en 430 l de PBS, ajustada a pH 8,0 después de la última centrifugación.
5. Perfore el papel aluminio de la microtubo con BS3 con una punta de pipeta que contiene 1001; l de agua ultrapura. Disuelva el polvo en agua BS3 pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo y añadir inmediatamente 20 l de la solución a la columna de centrifugación. La concentración final de BS3 en la reacción de reticulación es de ~ 1,2 mM.
6. Girar la columna durante 30 min a temperatura ambiente. Compruebe que la resina se mezcla adecuadamente con la solución de BS3.
7. Para interrumpir la reacción, añadir 6 l de 3M Tris-HCl, pH 7,5 y girar la columna durante otros 15 min a temperatura ambiente.
8. Centrifugar a 1500 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. Desechar el flujo a través y resuspender la resina reticulada en 450 l de solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (TBST). Repetir la centrifugación y etapas de lavado dos veces más. En el último paso, resuspender la resina en 450 l de TBS.
9. Transferir la suspensión de resina a un tubo nuevo usando una punta de pipeta con el extremo cortado. Resuspender la resina que queda en la columna con otros 450 l de TBS y transferir al mismo tubo. Repita ªe último paso una vez más para asegurar la transferencia máxima de la resina de la columna al tubo.
10. Deje que el tubo de reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente y ajustar el volumen a 600 l, eliminando el exceso de TBS. La resina está lista para su uso inmediato (recomendado) o se puede almacenar a 4 ° C, sin congelar.

2. Unión de la proteína cebo etiquetados-Twin-Strep y Associated Complejos para el reticulado Strep-Tactin Polimetacrilato Resina

1. Centrifugar 1 ml de la muestra de proteína cebo en tampón de unión a 17000 xg durante 10 min a 4 ° C y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
2. Para minimizar la unión de proteínas biotiniladas endógenos a la resina de Strep-Tactin, añadir avidina a una concentración final de 100 mg / ml y girar durante 15 minutos a 4 ° C.
   1. Si la resina reticulada de la etapa 1.10 ha sido almacenado durante un período prolongado de tiempo a 4 ° C, recoger la resina por centrifugación a 400 xg FOR 1 min a 4 ° C, descartar el sobrenadante y lavar la resina con 1 ml de TBST. Repetir la centrifugación y etapas de lavado dos veces más, primero con TBST y después con TBS. Centrifugar el tubo a 400 xg durante 1 min a 4 ° C y ajustar hasta el volumen original mediante la eliminación de exceso de TBS.
3. Resuspender la resina Strep-Tactin reticulado mediante agitación. Inmediatamente después, añadir 50 l de la suspensión de resina al tubo que contiene la muestra de proteína cebo usando una punta de pipeta de corte y girar durante otros 30 min a 4 ° C.
4. Mientras espera, establecer termomezclador a 55 ° C y precalentar 500 l de tampón de elución para el uso en el paso 3.1.
5. Centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y lavar la resina en un aparato rotatorio durante 5 min a 4 ° C con 1 ml de pre-refrigerada tampón de lavado # 1. Repetir la centrifugación y etapas de lavado tres veces. En el último paso, resuspender la resina en 250 l de tampón de lavado # 2.
6. Tr ansfer la suspensión de resina a una columna de giro fresco. Resuspender la resina que queda en el tubo en otros 250 l de tampón de lavado # 2 y transferir a la misma columna.
7. Se centrifuga a 400 g durante 3 min a 4 ° C, desechar el flujo a través y la transferencia de la columna a un tubo ml delfines nariz 2 fresco. Proceda inmediatamente a la etapa de elución a continuación.

3. La elución de los complejos de proteínas específicas

1. Añadir 150 l de tampón de elución precalentado desde el paso 2.4 a la columna de centrifugación.
2. Incubar en termomezclador durante 5 min a 55 ° C, agitando a 1400 rpm.
3. Centrifugar a 1500 xg durante 1 min a temperatura ambiente.
4. Deseche la columna y almacenar las proteínas diana purificadas a ≤ -20 ° C.

Tampón fosfato salino (PBS)
Na 2 HPO 4	10 mM
KH 2 PO 4	2 mM
NaCl	137 mM
KCl	2,7 mM
pH ajustado a 7,4 a menos que se indique lo contrario (de pH 8,0 en la sección 1.4)
Solución salina tamponada con Tris (TBS)
Tris-HCl, pH 7,4	50 mM
ght = estilo "20" = "altura: 20px; ancho: 299px;"> NaCl	150 mM
Tris amortiguada salina con Tween 20 (TBST)
Tris-HCl, pH 7,4	50 mM
NaCl	150 mM
De Tween 20	0,1% (v / v)
El tampón de unión
Tris-HCl, pH 8,0	25 mM
NaCl
NaF	5 mM
EDTA	0,5 mM
Glicerol	10% (v / v)
PMSF	0,1 mM
Tampón de lavado # 1
Tris-HCl, pH 8,0	25 mM
NaCl	500 mM
NaF td>	5 mM
EDTA	0,4 mM
Igepal CA-630	0,2% (v / v)
Glicerol	5% (v / v)
PMSF	0,1 mM
Tampón de lavado # 2
Tris-HCl, pH 8,0	25 mM
NaCl	150 mM
Tris-HCl, pH 8,0	25 mM
SDS	1% (w / v)

0 "> x "> 550 mM 2 "height =" "style =" 20 altura: 20px; ancho: 597px; "> Tampón de elución

Tabla 1. Tampones utilizados en el presente estudio.

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Resultados

El procedimiento de purificación se ilustra esquemáticamente en la Figura 1, junto con una representación de los problemas asociados con otros métodos de purificación existentes.

Figura 1. Representación esquemática del procedimiento de purificación. El flujo de trabajo incluye la estabilización de...

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Discusión

El protocolo anterior se puede utilizar para purificar cualquier proteína cebo de etiquetado de doble Strep de interés y sus complejos asociados en cualquier tampón adecuado que no contiene biotina o desnaturalizantes fuertes. En la versión actual del protocolo, de unión y lavado se llevan a cabo bajo condiciones relativamente estrictas en presencia de altas concentraciones de sal y detergente no iónico. Aunque esto da como resultado en menos de fondo, los complejos de proteínas frágiles pueden disociarse bajo e...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg	Pierce/Thermo Scientific	21585	www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)	IBA	2-1505	www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile	Costar (Corning)	8163	www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubes	Costar (Corning)	3213	www.corning.com/lifesciences/
Avidin	IBA	2-0204	www.iba-lifesciences.com