טיהור צעד אחד של חלבונים מתויגים-Twin-סטרפטוקוקוס והמתחמים שלהם בSuberate (BS3) שרף סטרפטוקוקוס-Tactin הצולב עם Bis (sulfosuccinimidyl)

Summary

שיטה מתוארת לניקוי יעיל של חלבוני תאום סטרפטוקוקוס מתויג היתוך והמתחמים הספציפיים שלהם על streptavidin הותאם שרף (סטרפטוקוקוס-Tactin) קוולנטית צולבים עם Bis suberate (sulfosuccinimidyl) (BS3). יש שיטת היתרונות של מהירות מהירה, התאוששות חלבון מטרה טובה וטוהר גבוהים, והוא תואם את ניתוח שלאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.

Abstract

טיהור זיקה של חלבוני היתוך סטרפטוקוקוס מתויגים על שרפים נושאים streptavidin מהונדס (סטרפטוקוקוס-Tactin) הפכה לשיטה נפוצה לבידוד של קומפלקסי חלבונים בתנאים פיסיולוגיים. יש חלבוני היתוך המכילים שני עותקים של סטרפטוקוקוס התג השני, מיועדים תאום סטרפטוקוקוס תג או SIII תג, היתרון של זיקה גבוהה יותר לסטרפטוקוקוס-Tactin בהשוואה לאלו המכילים סטרפטוקוקוס תג אחד בלבד, ובכך מאפשרים טיהור חלבון יעילה יותר. עם זאת, יתרון זה קוזז על ידי העובדה שelution של חלבונים מתויגים תאום סטרפטוקוקוס עם ביוטין עשוי להיות חלקי, מה שמוביל להחלמה חלבון נמוכה. ההתאוששות ניתן לשפר באופן דרמטי באמצעות elution denaturing עם נתרן גופרתי dodecyl (SDS), אבל זה מוביל ללדגום זיהום עם סטרפטוקוקוס-Tactin שוחרר מהשרף, מה שהופך את assay עולה בקנה אחד עם ניתוח proteomic במורד הזרם. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו שיטה לפיה tetramer מצמידים שרף של סטרפטוקוקוס-Tactinהוא התייצב לראשונה על ידי קוולנטיים cross-linking עם Bis suberate (sulfosuccinimidyl) (BS3) והשרף צולבים וכתוצאה מכך לאחר מכן נעשה שימוש כדי לטהר מתחמי חלבון מטרה בשלב טיהור אצווה אחת. elution יעיל עם SDS מבטיח התאוששות חלבון טובה, ואילו היעדר זיהום סטרפטוקוקוס-Tactin מאפשר ניתוח חלבון במורד הזרם על ידי ספקטרומטריית מסה. כהוכחה של מושג, שאנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור של חלבון נגיפי SIII מתויג VPG-Pro מגרעינים של נ 'נגוע בנגיף צמחי benthamiana באמצעות שרף polymethacrylate סטרפטוקוקוס-Tactin צולבים עם BS3. אותו הפרוטוקול יכול לשמש כדי לטהר את כל חלבון מתויג התאום סטרפטוקוקוס של עניין ולאפיין השותפים המחייבים הפיסיולוגיים שלו.

Introduction

בשנים האחרונות, טכנולוגית סטרפטוקוקוס התג הפכה בשימוש נרחב בתחומים רבים של מחקר ביו, כוללים פרוטאומיקה וביולוגיה מבנית. טכנולוגיה זו חלבון הטיהור, אשר מסתמכת על השילוב של חלבונים רקומביננטי לפפטיד סטרפטוקוקוס תג קצר, התבגרה עם כניסתו של מטריצות זיקה נשאו סטרפטוקוקוס-Tactin, גרסה מהונדסת גנטי של streptavidin עם קיבולת מחייב-peptide משופרת. ^{1, 2} חלבוני היתוך המכילים שני עותקים של סטרפטוקוקוס התג השני, מיועד תאום סטרפטוקוקוס תג או SIII תג, תערוכת זיקה גבוהה יותר עבור מטריצות סטרפטוקוקוס-Tactin מאלה המכילים סטרפטוקוקוס תג אחד בלבד, מה שמבטיח טיהור יעילה יותר של החלבונים רקומביננטיים ו שותפיהם הקשורים המחייבים. עם זאת, הזיקה גבוהה יותר של חלבונים מתויגים תאום סטרפטוקוקוס לסטרפטוקוקוס-Tactin יש גם החסרון שלה. elution התחרותי של כגון חלבונים עם ביוטין העודף עשוי להיות חלקי, מה שמוביל לירידה בתשואה של חלבון מטרה. מ 'חלופת עפרות יעילה היא elution עם SDS, אבל זה מוביל לזיהום מדגם לא רצוי עם סטרפטוקוקוס-Tactin שוחרר מהשרף, מה שהופך את assay עולה בקנה אחד עם ניתוח proteomic. מאמר זה מציג טכניקה כדי להתגבר על מגבלה זו על ידי הייצוב הראשון tetramer מצמידים השרף של סטרפטוקוקוס-Tactin ידי cross-linking הכימי ולאחר מכן באמצעות SDS לelute חלבונים מתויגים תאום סטרפטוקוקוס ומתחמים הקשורים בם מהשרף צולבים וכתוצאה מכך. לפיכך, תשואת חלבון מספקת יכולה להיות מושגת ללא זיהום מדגם עם סטרפטוקוקוס-Tactin, ובכך לאפשר ניתוח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסה.

השיטה מתאימה לטיהור של כל חלבון היתוך רקומביננטי עם משטח חשוף SIII תג ³ או תאום סטרפטוקוקוס תג (WSHPQFEK רצף חומצות אמינו (GGGS) ₃ WSHPQFEK וSAWSHPQFEK (GGGS) ₂ GGSAWSHPQFEK, בהתאמה). החלבון יכול להיות מ, חיה או צמח מקור חיידקים ויכול להיות מבודד משני תאים בסך הכלlysate או שבריר אברון מועשר. כדוגמא, אנו מתארים כאן הטיהור של חלבון SIII מתויג VPG-Pro של וירוס תפוחי אדמה (PVA) ⁴ מהחלק הגרעיני של צמחי benthamiana Nicotiana נגועים ב-PVA. שבריר הגרעיני היה מבודד כפי שתואר בעבר ^5, בשינויים הבאים: תאים לא טופלו בפורמלין, בוטיראט נתרן הוחלף בכל המאגרים עם פלואוריד הנתרן 5 מ"מ, מעכבי פרוטאז שלמים הוחלף עם PMSF, בחילוץ טריטון X-100 ריכוז חיץ # 2 הונמך ל0.3% (v / v) והגלולה הגרעינית שהושגה על ידי צנטריפוגה באמצעות כרית סוכרוז (# חיץ חילוץ 3) הייתה מושעה ב1.45 מיליליטר של חיץ מחייב טרום צונן ומסובב ל1.5 שעות ב 4 ° C. התמצית הגרעינית וכתוצאה מכך המכילה חלבון הפיתיון מתויג-SIII ומתחמים קשורים (מדגם חלבון פיתיון) הייתה מעובד על פי הפרוטוקול המפורט להלן (ראה סעיף 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. Cross-linking של סטרפטוקוקוס-Tactin Polymethacrylate שרף עם Bis (sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

1. לאזן microtube אטום אחד המכיל 2 מ"ג BS3 צולב מקשר לטמפרטורת חדר. זהירות: BS3 הוא חומר מסוכן. יש להשתמש בכפפות ומשקפי מגן.
2. שרף polymethacrylate resuspend סטרפטוקוקוס-Tactin (השעיה 50% ב100 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA; 150 mM NaCl) על ידי קצר נמרץ רועד ולהעביר 600 μl של ההשעיה באופן מיידי לעמודת ספין באמצעות פיפטה קצה עם הסוף נותק.
3. צנטריפוגה ב 1,500 XG במשך 30 שניות בטמפרטורת חדר. מחק את הזרימה דרך ולהוסיף 450 μl של בופר פוספט (PBS) לעמודה.
4. חזור על השלב הקודם 2 יותר פעמים כדי להחליף לחלוטין את חיץ טריס עם PBS ולהשאיר את השרף ב430 μl של PBS מותאם pH 8.0 לאחר צנטריפוגה שעברה.
5. לנקב את נייר הכסף של microtube עם BS3 עם קצה פיפטה מכיל 1001; ליטר של מים ultrapure. ממיסים את אבקת BS3 במים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה ולהוסיף מייד 20 μl של הפתרון לעמודת הספין. הריכוז הסופי של BS3 בתגובת cross-linking הוא ~ 1.2 מ"מ.
6. סובב את העמודה ל30 דקות בטמפרטורת חדר. בדוק שהשרף הוא מעורב כראוי עם פתרון BS3.
7. כדי להרוות את התגובה, להוסיף 6 μl של 3M טריס-HCl, pH 7.5 ולסובב את העמודה במשך דקות 15 אחר בטמפרטורת חדר.
8. צנטריפוגה ב 1,500 XG במשך 30 שניות בטמפרטורת חדר. מחק את הזרימה דרך וresuspend השרף צולבים ב450 μl של טריס שנאגרו מלוח עם Tween 20 (TBST). חזור צנטריפוגה ולשטוף מדרגות שתי פעמים נוספות. בשלב האחרון, resuspend השרף ב450 μl של TBS.
9. מעביר את ההשעיה השרף לצינור טרי באמצעות קצה פיפטה עם הסוף נותק. Resuspend השרף עזב בעמודה עם עוד 450 μl של TBS ולהעביר לאותו צינור. ה חזורדואר השלב אחרון פעם נוספת כדי להבטיח העברה מקסימלי של השרף מהעמודה לצינור.
10. בואו הצינור לעמוד 10 דקות בטמפרטורת חדר ולהתאים את עוצמת הקול ל600 μl ידי הסרת TBS העודף. השרף מוכן לשימוש מיידי (המומלץ) או יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, ללא הקפאה.

2. עקידת חלבון הפיתיון מתויג-Twin-סטרפטוקוקוס וAssociated מכלולים לסטרפטוקוקוס-Tactin Polymethacrylate שרף הצולב

1. צנטריפוגה 1 מיליליטר של מדגם חלבון פיתיון בחיץ מחייב ב17,000 XG 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לצינור טרי.
2. כדי למזער מחייב של חלבוני biotinylated אנדוגני לשרף סטרפטוקוקוס-Tactin, להוסיף avidin לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ולסובב ל15 דקות ב 4 ° C.
   1. אם השרף צולבים משלב 1.10 היה מאוחסן במשך תקופה ארוכה של זמן ב 4 ° C, לאסוף את השרף על ידי צנטריפוגה ב XG 400 עבורדקות r 1 ב 4 ° C, להשליך supernatant ולשטוף את השרף עם 1 מיליליטר של TBST. חזור צנטריפוגה ולשטוף על שלבים עוד פעמיים, תחילה עם TBST ולאחר מכן עם TBS. צנטריפוגות הצינור ב XG 400 דקות 1 על 4 מעלות צלזיוס ולהתאים את הנפח המקורי על ידי הסרת TBS העודף.
3. Resuspend שרף סטרפטוקוקוס-Tactin צולבים על ידי vortexing. מייד להוסיף 50 μl של ההשעיה השרף לצינור המכיל מדגם חלבון פיתיון באמצעות פיפטה קצה לחתוך ולסובב ל30 דקות אחרת ב 4 ° C.
4. בזמן ההמתנה, להגדיר thermomixer ל55 ° C ומחמם 500 μl של חיץ elution לשימוש בשלב 3.1.
5. צנטריפוגה ב XG 400 דקות 1 ב 4 ° C. בטל supernatant ולשטוף את השרף על הכתף במשך 5 דקות ב 4 ° C עם 1 מיליליטר של חיץ לשטוף טרום צונן # 1. חזור צנטריפוגה ולשטוף מדרגות שלוש פעמים. בשלב האחרון, resuspend השרף ב250 μl של חיץ לשטוף # 2.
6. Tr ansfer ההשעיה השרף לעמודת ספין טרי. Resuspend השרף שנותר בצינור בעוד 250 μl של חיץ לשטוף # 2 ותעביר לאותה העמודה.
7. צנטריפוגה ב XG 400 במשך 3 דקות ב 4 ° C, להשליך זרימת הדרך ולהעביר את העמודה לצינור מיליליטר טרי דולפין האף 2. פנה מייד לצעד elution להלן.

3. Elution של קומפלקסי חלבונים ספציפיים

1. הוסף 150 μl של חיץ elution שחומם מראש מצעד 2.4 לעמודת הספין.
2. דגירה בthermomixer 5 דקות ב55 ° C, רועד ב1,400 סל"ד.
3. צנטריפוגה ב 1,500 XG 1 דקות בטמפרטורת חדר.
4. מחק את העמודה ולאחסן את חלבוני היעד המטוהרים ב≤ -20 ° C.

שנאגרו מלוח פוספט (PBS)
Na 2 HPO 4	10 מ"מ
KH 2 PO 4	2 מ"מ
NaCl	137 מ"מ
KCl	2.7 מ"מ
pH מותאם 7.4 אלא אם צוין אחרת (pH 8.0 בסעיף 1.4)
טריס שנאגרו מלוח (TBS)
טריס-HCl, pH 7.4	50 מ"מ
ght = בסגנון "20" "גובה: 20px; רוחב: 299px;" => NaCl	150 מ"מ
טריס שנאגרו מלוח עם Tween 20 (TBST)
טריס-HCl, pH 7.4	50 מ"מ
NaCl	150 מ"מ
Tween 20	0.1% (v / v)
חיץ מחייב
טריס-HCl, pH 8.0	25 מ"מ
NaCl
NAF	5 מ"מ
EDTA	0.5 מ"מ
גליצרול	10% (v / v)
PMSF	0.1 מ"מ
לשטוף חיץ # 1
טריס-HCl, pH 8.0	25 מ"מ
NaCl	500 מ"מ
NAF td>	5 מ"מ
EDTA	0.4 מ"מ
Igepal CA-630	0.2% (v / v)
גליצרול	5% (v / v)
PMSF	0.1 מ"מ
לשטוף חיץ # 2
טריס-HCl, pH 8.0	25 מ"מ
NaCl	150 מ"מ
טריס-HCl, pH 8.0	25 מ"מ
SDS	1% (w / v)

0 "> x; "> 550 מ"מ "Style =" 2 "height =" 20 גובה: 20px; רוחב: 597px; "> חיץ Elution

טבלת 1. Buffers השתמש במחקר הנוכחי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הליך הטיהור מודגם באופן סכמטי באיור 1, יחד עם ייצוג של בעיות הקשורות לשיטות טיהור קיימות אחרות.

איור 1. ייצוג סכמטי של הליך הטיהור.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול לעיל יכול לשמש כדי לטהר את כל חלבון פיתיון מתויג התאום סטרפטוקוקוס של עניין והמכלולים הקשורים אליו בכל חיץ מתאים שאינו מכיל ביוטין או denaturants החזק. בגרסה הנוכחית של הפרוטוקול, כריכה ושטיפה מבוצעת בתנאים מחמירים יחסית בנוכחות מלח גבוה וחומרי ניקוי שאינו יונ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg	Pierce/Thermo Scientific	21585	www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)	IBA	2-1505	www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile	Costar (Corning)	8163	www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubes	Costar (Corning)	3213	www.corning.com/lifesciences/
Avidin	IBA	2-0204	www.iba-lifesciences.com