Ein-Schritt-Reinigung von Twin-Strep-markierten Proteine ​​und ihre Komplexe auf Mit Bis (Sulfosuccinimidyl) Strep-Tactin Resin Vernetzte suberat (BS3)

Zusammenfassung

Es wird ein Verfahren zur effizienten Reinigung von Doppel Strep-tag-Fusionsproteine ​​und deren Komplexe spezifisch auf modifizierte Streptavidin beschrieben (Strep-Tactin)-Harz kovalent mit Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) vernetzt. Das Verfahren hat die Vorteile der schnellen Geschwindigkeit, gute Zielprotein Recovery und hohe Reinheit und ist mit nachfolgender Analyse durch Massenspektrometrie kompatibel.

Zusammenfassung

Affinitätsreinigung von Strep-markierten Fusionsproteinen auf Harze Durchführung eines manipulierten Streptavidin (Strep-Tactin) hat sich eine weit verbreitete Methode zur Isolierung von Proteinkomplexen unter physiologischen Bedingungen. Fusionsproteine, zwei Kopien von Strep-tag II, Twin-Strep-Tag oder SIII-Tag bezeichnet, enthalten, haben den Vorteil der höheren Affinität für Strep-Tactin Vergleich zu denen nur eine einzige Strep-Tag enthält, so dass eine effizientere Proteinreinigung. Allerdings wird dieser Vorteil durch die Tatsache, dass die Elution von Zwillings-Strep-markierte Proteine ​​mit Biotin kann unvollständig sein, was zu einer geringen Proteinrückgewinnung auszugleichen. Die Rückgewinnung kann durch die Verwendung stark denaturierender Elution mit Natriumdodecylsulfat (SDS) verbessert werden, aber dies führt zu einer Kontamination mit Strep-Tactin aus dem Harz freigesetzt abzutasten, so dass der Test nicht mit nachgeschalteten Proteomanalyse. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir ein Verfahren, bei dem mit Harz gekoppelt Tetramer von Strep-Tactin entwickeltenZunächst wird durch kovalente Quervernetzung mit Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) und die resultierende vernetzte Harz wird dann verwendet, um Zielprotein-Komplexe in einer einzigen Charge zu reinigen Reinigungsschritt stabilisiert. Effiziente Elution mit SDS-Protein sorgt für eine gute Erholung, während der Abwesenheit von kontaminierenden Strep-Tactin ermöglicht Downstream-Protein-Analyse durch Massenspektrometrie. Als Proof of Concept, beschreiben wir hier ein Protokoll für die Reinigung von SIII-markierten viralen Protein VPg-Pro aus Kernen von Virus-infizierten N. benthamiana-Pflanzen mit dem Strep-Tactin Polymethacrylatharz mit BS3 vernetzt. Das gleiche Protokoll kann verwendet werden, um jede Doppel Strep-markierten Protein von Interesse reinigen und zu charakterisieren seine physiologischen Bindungspartner werden.

Einleitung

In den letzten Jahren hat Strep-Tag-Technologie in vielen Bereichen der biomedizinischen Forschung, einschließlich der Proteomforschung und Strukturbiologie weit verbreitet. Diese Technologie zur Proteinreinigung, die auf der Fusion von rekombinanten Proteinen an einer kurzen Strep-tag-Peptid beruht, mit dem Aufkommen von Affinitätsmatrizes Durchführung Strep-Tactin, eine gentechnisch Variante von Streptavidin mit verbesserter Peptid-Bindungsfähigkeit ^{1, 2} gereift. Fusionsproteine, zwei Kopien von Strep-tag II, Twin-Strep-Tag oder SIII-Tag, zeigen eine höhere Affinität für Strep-Tactin Matrizen als solche, die nur eine einzige Strep-Tag, eine effizientere Reinigung der rekombinanten Proteine ​​und bezeichnet enthält ihre zugeordneten Bindungspartnern. Allerdings hat der höhere Affinität von Twin-Strep-markierte Proteine ​​zu Strep-Tactin auch seine Kehrseite. Kompetitive Elution derartiger Proteine ​​mit einem Überschuss Biotin kann unvollständig sein, was zu einer verringerten Ausbeute Zielprotein. A mErz effiziente Alternative ist die Elution mit SDS, aber es führt zu unerwünschten Kontamination der Probe mit Strep-Tactin aus dem Harz freigesetzt, so dass der Test nicht mit Proteomanalyse. Dieser Artikel stellt eine Technik, um diese Beschränkung durch die ersten Stabilisierungs harzgekuppelten Tetramer von Strep-Tactin durch chemische Vernetzung und dann unter Verwendung von SDS zur Doppel-Strep-markierte Proteine ​​und ihre zugehörigen Komplexe aus der resultierenden vernetzten Harz zu eluieren überwinden. Somit kann eine ausreichende Proteinausbeute ohne Kontamination der Probe mit Strep-Tactin erreicht werden, wodurch eine weitere Analyse durch Massenspektrometrie erlaubt.

Das Verfahren ist mit einer oberflächenexponierten SIII-Tag ³ oder Twin-Strep-Tag (Aminosäuresequenz WSHPQFEK (GGGS) ₃ WSHPQFEK und SAWSHPQFEK (GGGS) ₂ GGSAWSHPQFEK jeweils) geeignet für die Reinigung von jedem rekombinantes Fusionsprotein. Das Protein kann aus tierischen, pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs sein und kann entweder aus insgesamt Zelle isoliert werdenLysat oder angereicherten Organell-Fraktion. Als Beispiel beschreiben wir hier die Reinigung eines SIII-markierten Protein VPg-Pro von Kartoffelvirus A (PVA) ⁴ von der Kernfraktion von PVA-infizierten Nicotiana benthamiana Pflanzen. Die Kernfraktion wurde isoliert, wie zuvor beschrieben ^5, mit den folgenden Modifikationen: die Zellen wurden nicht mit Formaldehyd behandelt wurde Natriumbutyrat in alle Puffer mit 5 mM Natriumfluorid ersetzt wurde komplette Proteaseinhibitor PMSF substituiert mit Triton X-100-Konzentration im Extraktions Puffer # 2 wurde auf 0,3% gesenkt (v / v) und das Kernpellet durch Zentrifugation über Saccharose-Kissen (Extraktionspuffer # 3) erhalten wurde in 1,45 ml vorgekühltem Bindungspuffer resuspendiert und gedreht wird 1,5 Stunden bei 4 ° C. Die daraus resultierende Kernextrakt die SIII-markierten Köderprotein und die damit verbundenen Komplexe (Köder Proteinprobe) enthält, wurde gemäß dem unten beschriebenen (siehe Abschnitt 2)-Protokoll verarbeitet.

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Protokoll

1. Vernetzung von Strep-Tactin Polymethacrylatharz mit Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3)

1. Äquilibrieren einer abgedichteten Mikroröhrchen, das 2 mg BS3 Vernetzer auf Raumtemperatur. ACHTUNG: BS3 ist ein gefährlicher Stoff. Schutzhandschuhe und Schutzbrille tragen.
2. Resuspendieren Strep-Tactin Polymethacrylatharz (50% Suspension in 100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA; 150 mM NaCl) durch kurzes kräftiges Schütteln und sofort übertragen 600 ul der Suspension auf eine Spin-Säule mit einer Pipettenspitze mit der Ende abgeschnitten.
3. Zentrifugieren bei 1500 × g für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Durchfluss und mit 450 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf die Säule.
4. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt 2 mehrmals, um Tris-Puffer vollständig ersetzen mit PBS und lassen Sie den Harz in 430 ul PBS auf pH 8,0 nach der letzten Zentrifugation angepasst.
5. Punktieren Sie die Folie des Mikroröhrchens mit BS3 mit einer Pipettenspitze, die 1001, l Reinstwasser. Lösen Sie das Pulver in Wasser BS3 durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren und sofort 20 ul der Lösung für das Spin-Säule. Die Endkonzentration von BS3 in der Vernetzungsreaktion ist ~ 1,2 mm.
6. Drehen der Säule für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Überprüfen Sie, dass das Harz richtig mit dem BS3-Lösung gemischt.
7. Um die Reaktion abzuschrecken, addieren 6 ul 3 M Tris-HCl, pH 7,5, und dreht die Säule weitere 15 min bei Raumtemperatur.
8. Zentrifugieren bei 1500 × g für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Durchfluss und Resuspendieren des vernetzten Harzes in 450 ul Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST). Wiederholen Sie die Zentrifugation und Waschschritte zwei weitere Male. Im letzten Schritt, resuspendieren Harz in 450 ul TBS.
9. Übertragen Sie die Harzsuspension in ein frisches Röhrchen mit einer Pipettenspitze mit dem Ende abgeschnitten. Resuspendieren des Harzes in der Säule mit weiteren 450 &mgr; l TBS links und übertragen auf den gleichen Rohr. Wiederholen the letzten Schritt nochmals eine maximale Übertragung des Harzes aus der Säule, um das Rohr zu gewährleisten.
10. Lassen Sie den Schlauch stehen für 10 Minuten bei Raumtemperatur und die Lautstärke auf 600 ul indem überschüssiges TBS. Das Harz ist bereit für den sofortigen Einsatz (empfohlen) oder können bei 4 ° C gelagert werden, ohne zu frieren.

2. Bindung des Twin-Strep-markierten Protein-Köder und assoziierten Komplexe auf die Cross-linked Strep-Tactin Polymethacrylatharz

1. Zentrifuge 1 ml der Probe Köderprotein in Bindungspuffer bei 17.000 × g für 10 min bei 4 ° C und den Überstand in ein frisches Röhrchen.
2. Zur Minimierung der Bindung von endogenem biotinylierten Proteine ​​an die Strep-Tactin Harz, Zugabe von Avidin zu einer Endkonzentration von 100 ug / ml und dreht 15 min bei 4 ° C.
   1. Wenn das vernetzte Harz aus Schritt 1,10 für einen längeren Zeitraum bei 4 ° C gelagert wurden, sammeln das Harz durch Zentrifugation bei 400 xg for 1 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen und das Harz mit 1 ml TBST. Wiederholen der Zentrifugations-und Waschschritte noch zweimal, zuerst mit TBST und dann mit TBS gewaschen. Das Röhrchen bei 400 × g für 1 min bei 4 ° C und Einstellen auf das ursprüngliche Volumen, indem überschüssiges TBS.
3. Resuspendieren des vernetzten Strep-Tactin Harz durch Vortexen. Sofort 50 ul der Harzsuspension dem Rohr den Köder-Protein enthaltenden Probe mit einem geschnittenen Pipettenspitze und drehen noch 30 min bei 4 ° C.
4. Während der Wartezeit eingestellt Thermomixer auf 55 ° C vorheizen und 500 ul Elutionspuffer zur Verwendung in Schritt 3.1.
5. Zentrifuge bei 400 × g für 1 min bei 4 ° C. Verwerfen des Überstandes und Waschen des Harzes auf einem Rotator für 5 min bei 4 ° C mit 1 ml vorgekühltes Waschpuffer # 1. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Waschschritte dreimal. Im letzten Schritt, resuspendieren Harz in 250 ul Waschpuffer # 2.
6. Tr ansfer die Harzsuspension in einen frischen Spin-Säule. Resuspendieren des restlichen in dem Rohr in einem anderen 250 ul Waschpuffer # 2 Harz und übertragen auf den gleichen Spalte.
7. Zentrifuge bei 400 g für 3 min bei 4 ° C, entsorgen Sie die Durchfluss und übertragen Sie die Spalte zu einem frischen Delphin-Nase-2-ml-Tube. Gehen Sie sofort auf die Elution Schritt unten.

3. Spezifische Elution der Proteinkomplexe

1. Jeweils 150 ul der vorgewärmten Elutionspuffer von Schritt 2.4, um die Spin-Säule.
2. Inkubation in Thermomixer für 5 min bei 55 ° C, bei 1.400 Umdrehungen pro Minute zittern.
3. Zentrifugieren bei 1500 × g für 1 min bei Raumtemperatur.
4. Entsorgen Sie die Spalte und speichern die gereinigten Zielproteine ​​bei ≤ -20 ° C

Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS)
Na 2 HPO 4	10 mM
KH 2 PO 4	2 mM
NaCl	137 mM
KCl	2,7 mM
pH-Wert auf 7,4 eingestellt, sofern nicht anders angegeben (pH 8.0 in Abschnitt 1.4)
Tris-gepufferter Salzlösung (TBS)
Tris-HCl, pH 7,4	50 mM
ght = "20" style = "height: 20px; width: 299px;"> NaCl	150 mM
Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST)
Tris-HCl, pH 7,4	50 mM
NaCl	150 mM
Tween 20	0,1% (v / v)
Bindungspuffer
Tris-HCl, pH 8,0	25 mM
NaCl
NaF	5 mM
EDTA	0,5 mM
Glycerol	10% (v / v)
PMSF	0,1 mM
Waschpuffer # 1
Tris-HCl, pH 8,0	25 mM
NaCl	500 mM
NaF td>	5 mM
EDTA	0,4 mM
Igepal CA-630	0,2% (v / v)
Glycerol	5% (v / v)
PMSF	0,1 mM
Waschpuffer # 2
Tris-HCl, pH 8,0	25 mM
NaCl	150 mM
Tris-HCl, pH 8,0	25 mM
SDS	1% (w / v)

0 "> x; "> 550 mM 2 "height =" 20 "style =" height: 20px; width: 597px; "> Elutionspuffer

Tabelle 1. Puffer in der vorliegenden Studie verwendet.

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Ergebnisse

Das Reinigungsverfahren ist schematisch in Fig. 1 dargestellt, zusammen mit einer Darstellung von Problemen mit bestehenden Reinigungsverfahren verbunden sind.

1. Schematische Darstellung des Reinigungsverfahrens. Der Workflow umfasst die Stabilisierung des harzgekuppelten Strep-Tactin Tetramer über kovalen...

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Diskussion

Das obige Protokoll kann verwendet werden, um jede Doppel Strep-getaggte Köder Protein von Interesse und die damit verbundenen Komplexe in jeder geeigneten Puffer, die nicht Biotin oder starke Vergällungsmittel enthält reinigen. In der aktuellen Version des Protokolls, Bindung und Waschen unter relativ stringenten Bedingungen in der Gegenwart von hohen Salz und nicht-ionischen Detergens durchgeführt. Dies führt zwar zu weniger Hintergrund, kann fragilen Proteinkomplexe unter diesen Bedingungen zu distanzieren. Um s...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg	Pierce/Thermo Scientific	21585	www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)	IBA	2-1505	www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile	Costar (Corning)	8163	www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubes	Costar (Corning)	3213	www.corning.com/lifesciences/
Avidin	IBA	2-0204	www.iba-lifesciences.com