JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Abstract

الخلايا العصبية الدوبامين تمثل أقل من 1٪ من إجمالي عدد الخلايا العصبية في الدماغ. هذه كمية قليلة من الخلايا العصبية في الدماغ وينظم وظائف مهمة مثل التحكم في المحركات، والدافع، والذاكرة العاملة. الخلايا العصبية الدوبامين السوداوي المخططي تتدهور بشكل انتقائي في مرض باركنسون (PD). ويرتبط هذا فقدان الخلايا العصبية التقدمية بشكل لا لبس فيه مع المحركات أعراض أمراض (بطء الحركة، ويستريح ورعاش، وصلابة العضلات). الوكيل الرئيسي المسؤول عن انحطاط الخلايا العصبية الدوبامين لا يزال مجهولا. ومع ذلك، يبدو أن هذه الخلايا العصبية عرضة للغاية في ظروف متنوعة. الثقافات الأولية تشكل واحدة من أكثر النماذج ذات الصلة للتحقيق خصائص وخصائص الخلايا العصبية الدوبامين. ويمكن تقديم هذه الثقافات إلى مختلف العوامل الإجهاد التي تحاكي PD علم الأمراض والمركبات اعصاب من أجل وقف أو إبطاء تدهور الخلايا العصبية. العديد من نماذج الماوس المعدلة وراثيا من PD التي كانت GENERated خلال العقد الماضي زادت مصلحة الباحثين عن الثقافات الخلايا العصبية الدوبامين. هنا، يركز بروتوكول الفيديو على تشريح دقيق من أدمغة فئران جنينية. الاستئصال الدقيق للبطني الدماغ المتوسط ​​أمر بالغ الأهمية للحصول على الثقافات العصبية غنية بما فيه الكفاية في خلايا الدوبامين للسماح دراسات لاحقة. يمكن تحقيق هذا البروتوكول مع الفئران المعدلة وراثيا الجنينية ومناسبة لتلطيخ المناعي، PCR الكمي، الثاني الكمي رسول، أو الخلايا العصبية تقييم الموت / بقاء.

Introduction

الدوبامين، واحدة من الناقلات العصبية في الدماغ الأساسية 1،2، يتم تحريرها أساسا من الدماغ المتوسط ​​الدوبامين (DA) الخلايا العصبية. غالبية الخلايا العصبية DA يقيمون في الجزء البطني من الدماغ المتوسط ​​2-6. تخطيطي، DA الخلايا العصبية الدماغ المتوسط ​​ويمكن تقسيم في ثلاثة تشريحيا ووظيفيا أنظمة متميزة الإسقاط: mesostriatal، mesolimbic، ومسارات mesocortical 2،5. ويشارك المسار السوداوي المخططي في السلوك الحركي، ومسارات mesolimbic تلعب دورا هاما في تعزيز، والدافع، والتعلم، في حين أن مسارات الدوبامين إسقاط لقشرة الفص الجبهي وتورط في الإدراك 2.

وتشارك الخلايا العصبية DA في العديد من الاضطرابات العصبية البشرية مثل الفصام ونقص الانتباه واضطراب فرط النشاط، ومرض باركنسون (PD) 2،4. يتميز PD من قبل انحطاط تدريجي وانتقائي من الخلايا العصبية DA ربط المادة السوداءبارس المكتنزة (SNC) إلى المخطط. فقدان الخلايا العصبية DA النتائج nigro الجسم المخطط في نضوب الدوبامين شديد في المخطط هي المسؤولة من الأعراض الحركية من PD (بطء الحركة، ويستريح ورعاش، وصلابة) 7. لم تثبت السبب الأولي للPD مجهول السبب والعلاجات الحالية هم أعراض فقط، وتهدف إلى استعادة مستوى الدوبامين في الجسم المخطط. الدواء الأكثر المقررة هي L-دوبا (يفودوبا)، من المكونات الطبيعية للدوبامين. وإن إدارة يفودوبا يعوض عن فقدان الدوبامين لفترة معينة، تحدث مضاعفات المحرك بعد العلاج على المدى الطويل (خلل الحركة وعلى / قبالة المتحدة) 8،9.

الأبحاث على الخلايا العصبية الدوبامين وPD هو في تطور مستمر وتبذل جهود مكثفة لتطوير العلاجات على أساس زرع الخلايا، والعلاج الجيني، أو وكلاء اعصاب 10،11. ومع ذلك، تبقى قضية رئيسية غير توضيح: ما هو سبب vulnerab المدقعility من الخلايا العصبية DA؟ جزء من الجواب يمكن العثور عليها في نشاط الخلايا العصبية DA. ويبدو أن الانخفاض في النشاط الكهربائي واستثارة الخلايا العصبية DA لزيادة ميلها لتتحول 12. ومع ذلك، فإن تعقيد PD المرضية يتطلب المزيد من الدراسات لتحديد الآليات التي تشارك في الخلايا العصبية DA انحطاط 13-15.

الثقافات الأولية هي ذات الصلة وخاصة لدراسة خصائص الخلايا العصبية DA 16-19 وتحدي هذه الخلايا العصبية لمختلف الضغوط لتقييم وكلاء اعصاب 20-24. وغالبا ما تستخدم نماذج الثقافة الفئران، حيث أن تشريح الجنين الفئران الدماغ المتوسط ​​هو أسهل، مقارنة مع الماوس، ويمكن الحصول على كميات أكبر من الخلايا العصبية في الفئران. ومع ذلك، وتوليد نماذج الماوس المعدلة وراثيا للمرض 25 قد ازداد بشكل ملحوظ في مصلحة المجتمع الأعصاب للثقافات الأولية من الماوس 26-29. على الرغم من الثقافات والعلاقات العامةepared من الحيوانات حديثة الولادة يمكن استخدامها، فمن الأفضل لإعدادهم من أجنة في مرحلة ما بعد الإنقسامية (E13.5 للعصبونات الدماغ المتوسط)، عندما الاحتفاظ الخلايا العصبية قدرتها على تمييز. يقدم البروتوكول التالية الخلايا العصبية الدماغ المتوسط ​​المعزولة في الثقافة الأولية من أجنة الفئران (E13.5)، والتي هي الأكثر صعوبة للاستعداد. خصوصا، ونحن نقدم بروتوكول باستخدام المصل خالية مستنبت لاستنساخ أفضل. الخطوات الأكثر أهمية اثنين في إعداد ثقافة (تشريح والتفكك الميكانيكي) سيتم تفصيله بعناية في الفيديو المرتبطة.

Protocol

وقد اهتم الفئران المستخدمة في هذا العمل والتعامل معها وفقا للمبادئ التوجيهية لمجلس الاتحاد الأوروبي (86/609 / EU) لاستخدام الحيوانات المختبرية.

1. إعداد الحلول المطلوبة

  1. حلول الأسهم
    1. 10X بولي L-الأورنيثين (منظمة التحرير الفلسطينية) الحل: تزن من 10 ملغ من هيدروبروميد منظمة التحرير الفلسطينية (الوزن الجزيئي = 30،000-70،000) وتذوب في 70 مل من الماء المعقم. تصفية الحل باستخدام حقنة 0.2 ميكرون فلتر، قسامة، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    2. 30٪ الجلوكوز الحل: تزن من 30 غراما من D (+) - الجلوكوز وتذوب في الماء المعقم إلى إجمالي حجم 100 مل. فلتر، قسامة، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    3. التعديل المتوسطة النسر Dulbecco ل5X (DMEM) / خليط المغذيات F-12 هام: يزن من 6 غرام من مسحوق DMEM / F-12 هام وتذوب في الماء المعقم إلى إجمالي حجم 100 مل. فلتر، قسامة، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    4. 7.5٪ بيكربونات الصوديوم (NaHCO 3) Solutiعلى: تزن من 7.5 غرام من NaHCO 3 و تذوب في الماء المعقم إلى إجمالي حجم 100 مل. فلتر، قسامة، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    5. 1 M HEPES الحل: وزن من 23.8 غرام من HEPES وتذوب في الماء المعقم إلى إجمالي حجم 100 مل. فلتر، قسامة، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    6. 70٪ (V / V) الايثانول: تمييع 70 مل من الايثانول المطلق مع 30 مل من الماء المعقم.
  2. الفوسفات مخزنة المالحة مع الجلوكوز والمضادات الحيوية (PBS-الديوان): إضافة 10 مل من محلول الجلوكوز 30٪ و 5 مل من محلول البنسلين الستربتوميسين إلى 500 مل من Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة. تخزينها في 4 درجة مئوية.
  3. المعطل مصل بقري جنيني (iFBS): مصل بقري ذوبان الجليد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو إلغاء تشغيله عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قسامة إلى 50 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  4. الثقافة المتوسطة: في الماء المعقم، مزيج تباعا 40 مل من 5X DMEM / F12-هام، 1 مل من 1 M HEPES، 2 مل من 200 ملي L-الجلوتامين، 2 مل من البنسلين، الستربتومايسين، 4 مل من الجلوكوز 30٪ والثانية 3 مل من 7.5٪ NaHCO 3 إلى الحجم النهائي من 180 مل. تصفية وتستخدم في نفس اليوم.
  5. هرمون ميكس
    1. إعداد 180 مل من مستنبت. حل 200 ملغ من APO-ترانسفيرين في هذه الوسيلة.
    2. تزن من 50 ملغ من الأنسولين وتذوب في 2 مل من حمض الهيدروكلوريك 0.1 M. إضافة ببطء 8 مل من الماء المعقم في حين خلط بلطف. يخفف هذا الحل في مستنبت.
    3. تزن من 19.3 ملغ من هيدروكلوريد بوتريسين وتذوب في 10 مل من الماء المعقم. إضافة محلول 10 مل إلى المزيج الهرمون.
    4. إعداد 3 ملي حل زيلونيت الصوديوم في الماء المعقم والحل البروجسترون 2 مم في الايثانول المطلق. إضافة 20 ميكرولتر من كل حل لمزيج الهرمون.
    5. تصفية المزيج الهرموني، قسامة إلى 10 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.

2. إعداد لوحات والصكوك الثقافة

  1. FBS طلاء لوحات ثقافة: اليوم قبل تشريح، وإعداد 180 مل من مستنبت. إضافة 10 مل منiFBS إلى 90 مل من مستنبت. إضافة 300 ميكرولتر / جيد من مستنبت / 10٪ iFBS في بولي-D-يسين المكسوة مسبقا والمحمولة 24 لوحات جيدا. احتضان ليلا 37 درجة مئوية. تخزين الوسائط المتبقية (مع وبدون iFBS) في 4 درجات مئوية.
  2. تعقيم الأدوات وماصات باستور. جمع المعدات المدرجة في جدول المواد فضلا عن الدرجة الثانية غطاء تدفق الصفحي وحاضنة CO 2.

3. تشريح الفأر الدماغ المتوسط

  1. التضحية ماوس E13.5 حاملا (وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية). تنظيف البطن من الفأر مع الايثانول 70٪ وفتح جدار البطن. جمع قرون الرحم، فتحها باستخدام مقص الدقيقة، تشريح كل جنين من قرون الرحم، وإزالة الأغشية الذي يحيط بالجنين. وضع الأجنة في طبق بتري 100 ملم تحتوي على معقم PBS-الديوان وغسلها عن طريق التحويل في 3 حمامات متطابقة المتعاقبة باستخدام ملقط. للتشريح، ووضع الأجنة بنسبة 3 في 60 ملم طبق بتري معقمة.
  2. وسائل التحققالبريد طبق بيتري النهائي تحت stereomicroscope. لا قطع رأس الأجنة. باستخدام مقص Vannas، استئصال العقول.
    1. إزالة بعناية وتجاهل المناطق fore- والدماغ المؤخر. إلى الجانب منقاري، وقطع على مقربة من المنطقة المهادية، إلى خفض الجانب الذيلية في منطقة البرزخ، وإزالة أكيمة متفوقة.
    2. مرة واحدة يتم عزل الدماغ المتوسط ​​البطني، وإزالة السحايا باستخدام ملقط غرامة فائقة بعناية. جمع شرائح تشريح، دون السحايا، في أنبوب معقم 13 مل مليئة PBS-الديوان.
  3. تنظيف الأنبوب الذي يحتوي على mesencephala تماما مع الايثانول 70٪ وجعله تحت غطاء محرك السيارة.

التفكك 4. خلية

  1. غسل mesencephala 3X مع معقم PBS-الديوان. السماح شظايا الدماغ ليستقر بين كل غسل، وتجنب تعطيل الأنسجة. بعد غسل الماضي، وإزالة بعناية بقدر حل ممكن واحتضان شرائح الدماغ في 3 مل من التربسين / EDTA لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية فيCO 2 الحاضنة.
  2. النار البولندية ماصات باستور لتعظيم بقاء الخلايا العصبية كما في نهاية الماصة الزجاج غير المصقول هو حاد ويمكن أن تتلف الخلايا خلال الخطوات التفكك. قليلا تقليل قطرها أقصى (0.5 مم) من ماصة باستور بينما النار تلميع ذلك.
  3. إزالة بعناية بقدر حل التربسين / EDTA ممكن، وإضافة 10 مل من مستنبت / 10٪ iFBS. شرائح الدماغ غسل 3X مع مستنبت / 10٪ iFBS.
  4. باستخدام باستور ماصة مصقول النار، والبدء تفكك mesencephala في 6 مل من الثقافة 10٪ iFBS متوسطة /. يسحن 10X (تجنب فقاعات الهواء)، والسماح للقطع ليستقر، ثم جمع المتوسط ​​في أنبوب جديد معقمة 13 مل.
  5. إضافة 6 مل من مستنبت، كرر الخطوة السابقة مرة واحدة وجمع المتوسط ​​تحتوي على خلايا فصلها في نفس أنبوب 13 مل.
  6. خلايا الطرد المركزي في 160 غ لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف و resuspend الخلايا في مستنبت تستكمل مع10٪ هرمون المزيج.

5. خلية التصفيحات

  1. عد الخلايا في تعليق في خلية مالاسيه وضبط حجم المتوسطة إلى تركيز 600،000 خلية / مل. ويمكن الحصول على حوالي 1،700،000 خلايا الدماغ المتوسط ​​واحدة من الماوس.
  2. إزالة FBS التي تحتوي على طلاء المتوسطة من 24 لوحات جيدة وإضافة في كل بئر 1 مل من تعليق خلية (600،000 خلية / جيدا، 2-4٪ من خلايا TH +).
  3. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2/95٪ الهواء. أي تغيير المتوسط ​​أمر ضروري. الخلايا العصبية الدوبامين تنضج بعد حوالي 5-7 أيام في المختبر (التعبير المتسق لنقل الدوبامين). إبقاء الخلايا في الثقافة تصل إلى 15 يوما دون استبدال المتوسط.

بروتوكول 6. المناعي

  1. التنظيف لل coverslips
    1. قبل يوم من تشريح، إضافة 10 مل من 1 M حمض الهيدروكلوريك في طبق بيتري. وضع على سطح السائل 12-15 coverslips الزجاج وانتظر 15 دقيقة.
    2. تغرق غطاءتنزلق إلى السائل والانتظار لمدة 15 دقيقة.
    3. إزالة حمض الهيدروكلوريك وغسل 3X مع الماء.
    4. غسل لل coverslips بسرعة مع الإيثانول النقي مرة واحدة، ثم تضاف الإيثانول النقي إلى الطبق وانتظر لمدة 30 دقيقة.
    5. تحت غطاء محرك السيارة، وإزالة coverslips تنظيفها من الإيثانول وإضافة 1 ساترة لكل بئر من 12 لوحة جيدا ثقافة الخلية باستخدام ملقط معقم.
    6. غسل coverslips مرتين مع الماء المعقم (1 مل / جيد). ثم، غسلها مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
  2. طلاء لل coverslips
    1. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولتر / جيد من 2X منظمة التحرير الفلسطينية (المخفف في PBS). احتضان لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2.
    2. إزالة حل منظمة التحرير الفلسطينية وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
    3. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولتر / جيد من 20٪ iFBS / 1 جم / مل Laminin. احتضان ليلا 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2.
  3. طلاء الخلايا لالمناعي
    1. إزالة طلاء المتوسطة من 12 لوحات جيدا.
    2. إضافة 900،000 خلية / جيدا في حجم 2 مل وتنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. يمكن أن تظل الخلايا في الثقافة تصل إلى 15 يوما دون استبدال المتوسط.
  4. المناعية
    1. إزالة المتوسطة من 12 لوحات جيدا ويغسل مع 500 ميكرولتر / جيد مسخن DMEM عند 37 درجة مئوية.
    2. إضافة مسخن 500 ميكرولتر / جيد من DMEM عند 37 درجة مئوية، ثم تضاف برفق 160 ميكرولتر / جيد من 8٪ بارافورمالدهيد (PFA، 2٪ تركيز النهائي)، واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. إزالة PFA وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني / 0.1 M جليكاين لمدة 10 دقيقة.
    4. إزالة برنامج تلفزيوني، إضافة 300 ميكرولتر / جيد من PBS / 0.05٪ تريتون X-100/20٪ الماعز المصل واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. إزالة المتوسطة، إضافة 300 ميكرولتر / جيد من الأجسام المضادة الأولية مخففة في PBS / 0.05٪ تريتون X-100 / بنسبة 1٪ مصل الماعز واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يشار إلى الأجسام المضادة الأولية التي يمكن استخدامها للكشف عن الخلايا العصبية الدوبامين وتوصيف الثقافة في الجدول المواد. إبقاء1 جيدا دون الأجسام المضادة الأولية لتقييم للخلفية الأجسام المضادة الثانوية المختلفة.
    6. إزالة المتوسطة وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني / الجيلاتين 0.2٪ لمدة 10 دقيقة.
    7. إزالة المتوسطة، إضافة 300 ميكرولتر / جيد من الأجسام المضادة الثانوية مخففة في PBS / 0.05٪ تريتون X-100 / بنسبة 1٪ مصل الماعز واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، في الظلام. يشار إلى الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في جدول المواد.
    8. إزالة المتوسطة وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني / الجيلاتين 0.2٪ لمدة 10 دقيقة.
    9. إزالة المتوسطة وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني.
    10. جبل لل coverslips على جانب الزجاج خلية الشرائح أسفل في قطرة من VECTASHIELD. الحفاظ على الشرائح في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها للسماح للجفاف المتوسط ​​المتصاعدة، ثم تخزينها في 4 درجات مئوية.
    11. الحصول على صور باستخدام مجهر متحد البؤر المجهر أو على النقيض من المرحلة مجهزة لepifluorescence. تم الحصول على صور تمثيلية مع المجهر مبائر ايكا SP2 الأشعة فوق البنفسجية.

النتائج

ويظهر على الرسم البياني يتضح من الخطوات الثقافة الدماغ المتوسط ​​في الشكل رقم 1. فترة وجيزة، بعد جمع الأجنة E13.5 من الفأر السويسري حاملا، يتم تشريح الدماغ المتوسط ​​البطني من الجنين بأكمله. وتقدم شظايا الدماغ معزولة تباعا لعملية الهضم الأنزيمي والتفكك الم?...

Discussion

يعرض هذا البروتوكول الإجراءات والكواشف اللازمة لإعداد ثقافة الأولية من الخلايا العصبية الدماغ المتوسط ​​من الفأر الجنينية وإجراءات المناعي للكشف عن الخلايا العصبية الدوبامين. الخطوات الحاسمة من الإجراء هي تشريح الأجنة والتفكك الميكانيكي للشظايا الدماغ التي تم ?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Fetal Bovine SerumLonza14-801F
DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamineLonzaBE12-604F
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol redLife Technologies25300-054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)Life Technologies15140122
L-Glutamine, 200 mM solutionLife Technologies25030123
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineSigma-Aldrich D8537
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 HamSigma-Aldrich D0547Powder
Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaClSigma-Aldrich L2020
Poly-L-Ornithine hydrobromideSigma-Aldrich P3655
Insulin from porcine pancreasSigma-Aldrich I5523
apo-Transferrin humanSigma-Aldrich T1147
Putrescine dihydrochlorideSigma-Aldrich P5780
ProgesteroneSigma-Aldrich P8783
Sodium seleniteSigma-Aldrich S5261
HEPESSigma-Aldrich H4034 
GlycineSigma-Aldrich G7126Stock solution 1 M in water
GelatinSigma-Aldrich G9391Stock solution 2% (w/v) in water
Triton X-100Sigma-Aldrich T8532
Paraformaldehyde 16% in waterElectron Microscopy SciencesRT 15710-S
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Merck Millipore106329
D(+)-Glucose, MonohydrateMerck Millipore4074-2
Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) TitripurMerck Millipore109057
Sterile water - Aqua B. BraunBraun
Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagentVWR20821.321
Sterile Petri dishesVWR82050-566
Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR.VWR612-2297
Counting chamber MalassezVWR631-0975
Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mmPALL Life science4525
Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm longFine Science Tools14002-14To open the abdominal wall
Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm longMORIA4877ATo open the uterine wall
Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mmMORIA2183To manipulate embryos
Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm bladesMORIAMC50To take out the mesencephalon
Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm longMORIA9987To remove meninges
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell PlatesBD Bioscience356414
BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lidBD Bioscience353043
SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90ºMENZEL-GLÄSERAG00008032E
Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm ØMARIENFELD117580
Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) AntibodyChemicon MilliporeAB56221/200
Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2Chemicon MilliporeMAB54061/400
Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt Chemicon MilliporeMAB3691/500
Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Goat Serum, New Zealand OriginLife Technologies16210-064
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AntibodyLife TechnologiesA-315561/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife TechnologiesA-110011/1,000
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) AntibodyLife TechnologiesA-110071/1,000
VECTASHIELD HardSet Mounting MediumVector LaboratoriesH-1400
StereomicroscopeCarl Zeiss microscopyStemi-2000C
Bunsen Burner FIREBOYVWR451-0136

References

  1. Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
  2. Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
  3. Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
  4. Chinta, S. J., Andersen, J. K. Dopaminergic neurons. Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).
  5. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  6. Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
  7. Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. Parkinson's disease. Lancet. 363, 1783-1793 (2004).
  8. Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
  9. Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
  10. Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
  11. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
  12. Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
  13. Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
  14. Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. e. r. k. e. r. i. a. n. -. Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
  15. Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. Pathogenesis of Parkinson's disease. Mov Disord. 28, 24-30 (2013).
  16. di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
  17. Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
  18. Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
  19. Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
  20. Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
  21. Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
  22. Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
  23. Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
  24. Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
  25. Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
  26. Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
  27. Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
  28. Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
  29. Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
  30. Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
  31. Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
  32. Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
  33. Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
  34. Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
  35. Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
  36. Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

91

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved