小鼠多巴胺能神经元的原代培养

摘要

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

摘要

多巴胺能神经元代表了在大脑中的神经元的总数的不到1％。这样低的神经元的数量调节重要脑部功能，如马达控制，动机和工作记忆。黑质纹状体多巴胺能神经元的选择性退化在帕金森氏病（PD）。这种渐进的神经元损失明确的病理症状电机（运动迟缓，静止性震颤和肌强直）有关。负责任的多巴胺能神经元退变主要代理仍是未知数。然而，这些神经元似乎是在各种条件下非常脆弱。原代培养物构成的最相关的模型之一来调查性能和多巴胺能神经元的特征。这些培养物可以以阻止或减缓神经元变性提交模仿PD病理各种应激剂和神经保护性化合物。 PD的大量的转基因小鼠模型中对已根儿在过去十年中ATED进一步增加研究者对多巴胺能神经元培养物的兴趣。在这里，视频协议侧重于胚胎小鼠大脑的细腻解剖。腹侧的精确切除是至关重要的，获得神经元培养足够丰富的多巴胺能细胞，使随后的研究。此协议可实现与胚胎转基因小鼠，并适合免疫荧光染色，定量PCR，第二信使量化，或神经元死亡/存活评估。

引言

多巴胺，基本脑神经递质^1,2中的一个，主要是释放由脑多巴胺能（DA）神经元。大多数DA能神经元位于中脑^2-6的腹侧部分。概略地，中脑多巴胺神经元可在三个解剖和功能划分不同的投影系统:mesostriatal，中脑边缘和mesocortical通路^2,5。黑质纹状体通路参与运动行为，中脑边缘通路在加强，动机和学习中发挥重要作用，而多巴胺能途径投射到额叶前部皮质有牵连的认知^2。

多巴胺神经元参与了几个人的神经系统疾病如精神分裂症，注意力不足，过度活动症和帕金森氏病^{（PD）2,4。}帕金森病的特点是DA能神经元的进行性和选择性变性连接黑质致密部（SNC）的纹状体。的黑质-纹状体多巴胺神经元的结果在纹状体严重多巴胺耗竭的损失，是负责对帕金森病的运动症状（运动迟缓，静止性震颤，和刚性^）7。的特发性帕金森病的初始原因尚未确定与当前治疗是唯一的症状，目的是恢复的多巴胺水平在纹状体。最常用的处方药物是左旋多巴（左旋多巴），多巴胺的前体自然。尽管左旋多巴的给药补偿多巴胺在一定时间内的损耗，运动并发症后发生的长期治疗（运动障碍和开/关状态^）8,9。

研究多巴胺能神经元和PD是在不断发展和正在作出巨大努力来开发基于细胞移植，基因治疗，或神经保护剂^10,11治疗。然而，一个重要问题仍然是非阐明:什么是极端vulnerab的原因DA能神经元的能性？部分答案可以在DA能神经元的活性被发现。在DA能神经元的兴奋性电活动和减速似乎增加他们的倾向退化^12。然而，帕金森病发病机制的复杂性，需要进一步研究，以确定神经元变性^13-15参与多巴胺的机制。

小学文化，特别是有关研究多巴胺神经元的特性^16-19和对神经保护剂^20-24评估挑战这些神经元的各种压力。大鼠培养模型是最常用的，如大鼠胚胎中脑的解剖比较容易，比较用鼠标，以及较高量的神经元可以在大鼠中获得。然而，新一代的²⁵病转基因小鼠模型大大提高了社区的神经学家小学文化，从鼠标^26-29的兴趣。虽然文化公关从新生动物epared都可以使用，最好是它们的胚胎在有丝分裂后的阶段（E13.5的中脑的神经元）制备，当神经元都保留其分化能力。以下协议呈现在来自小鼠胚胎（E13.5），这是最困难的，制备原代培养物分离的脑的神经元。值得注意的是，我们提供了使用无血清培养基更好的重现性的协议。在培养制备物（夹层和机械解离）的两个最重要的步骤将被仔细地详述于相关联的视频。

研究方案

在这项工作中所用的小鼠照料并符合欧盟理事会（86/609 / EU）的使用实验动物的指导方针进行处理。

1，准备所需的解决方案

1. 库存解决方案
   1. 10X聚-L-鸟氨酸（巴解组织）溶液:称取10mg解放军氢溴酸盐（分子量= 30,000-70,000），溶于70毫升无菌水。筛选储存在-20℃下用0.2微米的针筒式过滤器，等分试样的溶液，和。
   2. 30％葡萄糖溶液:称取30克D（+） - 糖和无菌水溶解至100ml的总体积。过滤，分装，并储存在4℃。
   3. 5倍的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）/营养混合物F-12火腿:称取6克的DMEM / F-12火腿粉末和在无菌水中溶解至100ml的总体积。过滤，分装，并储存在4℃。
   4. 7.5％的碳酸氢钠（ _碳酸氢钠 ）Soluti于:称取7.5克的NaHCO ₃和在无菌水中溶解至100ml的总体积。过滤，分装，并储存在4℃。
   5. 的1M HEPES溶液:称取23.8克的HEPES和在无菌水中溶解至100ml的总体积。过滤，分装，并储存在4℃。
   6. 70％（V / V）乙醇稀释:将70ml无水乙醇溶液用30ml无菌水。
2. 磷酸盐缓冲盐水与葡萄糖和抗生素（PBS-GAB）:加入10毫升30％的葡萄糖溶液和5毫升的青霉素 - 链霉素溶液至500ml Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水中。保存在4℃。
3. 灭活胎牛血清（IFBS）:解冻的牛血清一夜之间在4°C和灭活，在56℃下30分钟。等分入50ml并储存在-20℃。
4. 培养基:在灭菌水中，混匀依次40毫升5×DMEM / F12-火腿，加入1ml的1M HEPES，将2ml的200mM的L-谷氨酰胺，2个ml的青霉素 - 链霉素的加入4ml的30％的葡萄糖次加入3ml 7.5％的NaHCO _3，以180 ml ​​的终体积。过滤并使用相同的天。
5. 激素混合
   1. 制备180毫升培养基。溶解200mg的脱辅基转铁蛋白的这种媒介。
   2. 称取50毫克胰岛素的和溶解于2ml 0.1M的HCl中。加入慢慢加入8毫升无菌水混合的同时轻轻地。稀释此溶液在培养基中。
   3. 称取19.3毫克腐胺二盐酸盐和溶解在10ml的无菌水。加入10 ml溶液的激素组合。
   4. 制备在无菌水中的3mM的亚硒酸钠溶液并在无水乙醇中的2mM的孕酮溶液。加入20μl每个解决方案的激素组合。
   5. 过滤激素混合，分装到10ml，并储存在-20℃。

2，准备培养板和仪器

1. 培养皿中的FBS涂层:先解剖当天，准备180毫升培养基。加入10毫升IFBS到90毫升培养介质中。加入300μl/孔的培养基/ 10％IFBS到聚-D-赖氨酸预涂布的24孔板。孵育过夜，在37℃。在4℃下储存剩余的介质（有或无IFBS）。
2. 消毒器械和巴氏吸管。聚集在材料表中列出，以及一个II级层流罩和CO ₂培养箱设备。

3，解剖小鼠中脑的

1. （根据机构的指导方针）牺牲一个E13.5孕鼠。清洁鼠标，用70％乙醇的腹部和打开腹部壁。收集的子宫角，用细腻的剪刀打开它们，从子宫角解剖每个胚胎，取出羊膜。将胚胎在含有无菌PBS-GAB 100毫米的培养皿中，用血管钳在连续3个相同的浴用转移把它们洗干净。对于剥离，将胚胎由3 60mm的无菌培养皿中。
2. MOVË在体视显微镜下最后的培养皿中。不要杀头的胚胎。使用Vannas剪刀，切除大脑。
   1. 小心地取出并丢弃fore-和后脑区域。以喙侧，切断靠近丘脑区域，以尾侧切口在峡部区域，除去上丘。
   2. 一旦中脑腹侧被隔离，小心地取出使用的超精细镊子脑膜。收集解剖段，无脑膜，在无菌13毫升套管内填充的PBS-GAB。
3. 清洁管彻底含有mesencephala用70％乙醇，并把它罩下。

4，细胞分离

1. 洗mesencephala 3倍用无菌PBS-GAB。让大脑碎片每次冲洗之间解决，避免破坏组织。最后一次洗涤后，在3毫升胰蛋白酶/ EDTA的15分钟的仔细去除尽可能多的解决方案，尽可能孵育脑段，在37℃CO ₂的培养箱中培养。
2. 火抛光的巴斯德吸液管以最大化神经元作为非抛光的玻璃移液管的端部的存活是锋利的，并且可以在解离步骤，损伤细胞。稍微减轻肢体的直径（最大0.5mm）的巴斯德吸管，而火抛光的。
3. 小心除去尽可能多的胰蛋白酶/ EDTA溶液尽可能和加入10 ml培养基/ 10％IFBS。洗脑段与3倍的培养基/ 10％IFBS。
4. 用火抛光的巴斯德吸液管，开始在6ml培养基/ 10％IFBS的mesencephala的离解。磨碎10X（避免产生气泡），使块定居，然后收集在一个新的无菌13毫升管中。
5. 加入6毫升培养介质中，重复前面的步骤一次，并收集含有解离的细胞在相同13毫升管的平台。
6. 离心细胞，在160 g下5分钟。弃上清，悬浮细胞培养液中添加了10％的激素组合。

5，细胞接种

1. 计数细胞悬液中Malassez细胞和调节介质的体积的60万个细胞/ ml的浓度。周围1700000细胞可以从一个小鼠中脑获得。
2. 除去含FBS的涂覆​​介质从24孔板中，并添加于各孔的1 ml的细胞悬浮液（600,000个细胞/孔，TH +细胞的2-4％）。
3. 孵育板在37℃和5％CO _2/95％空气。无介质的改变是必要的。多巴胺能神经元后， 在体外各地5-7天（多巴胺转运体的表达相一致）的成熟。保持文化的长达15天不更换培养基细胞。

6，免疫荧光协议

1. 盖玻片清洗
   1. 解剖前一天，加入10毫升1 M盐酸到培养皿中。放置在所述液体12-15盖玻片的表面上，等待15分钟。
   2. 沉封面潜入该液体，然后等待15分钟。
   3. 除去HCl和水洗涤3次。
   4. 一次，用纯乙醇快速洗涤盖玻片，然后加入纯乙醇的培养皿，并等待30分钟。
   5. 引擎盖下，从乙醇中取出清洁的盖玻片上，并加入用无菌镊子12孔细胞培养板中的1盖玻片每孔。
   6. 冲洗用无菌水（1ml /孔）盖玻片两次。然后，用无菌PBS洗涤一次它们。
2. 盖玻片的涂布
   1. 除去PBS中，加入500μl/ 2倍巴解组织以及（PBS稀释）。孵育4小时，在37℃下在CO ₂培养箱中培养。
   2. 删除巴解组织溶液和洗涤3次，用无菌的PBS。
   3. 除去PBS，加入500微升/孔的20％IFBS / 1克/毫升的层粘连蛋白。在CO ₂培养箱中孵育过夜，在37℃。
3. 电镀的细胞免疫
   1. 从12孔板中除去涂层介质。
   2. 添加900,000个细胞/孔的2ml体积，并在培养箱中生长的细胞中，在37℃。细胞可以保持在培养最多15天而不更换培养基。
4. 免疫组化
   1. 从12孔板中除去培养基，并用500微升/孔的DMEM预热至37℃。
   2. 加入500μl/孔的DMEM中预热至37℃，再加入微升轻轻160 /孔8％多聚甲醛（PFA，2％的最终浓度），并孵育10分钟，在37℃。
   3. 除去PFA，洗3次，用PBS / 0.1M甘氨酸10分钟。
   4. 除去PBS，加入300微升/孔的PBS / 0.05％的Triton X-100/20％山羊血清和温育30分钟，在室温下进行。
   5. 除去培养基，加入300微升/孔的在PBS中稀释的第一抗体/ 0.05％的Triton X-100/1％山羊血清孵育2小时，在室温下进行。可用于多巴胺能神经元和培养特性的检测初级抗体被显示在材料表中。保持1以及无第一抗体，以评估不同的第二抗体的背景。
   6. 除去培养基洗3次，用PBS / 0.2％明胶的10分钟。
   7. 除去培养基，加入300微升/孔的在PBS中稀释的二级抗体/ 0.05％的Triton X-100/1％山羊血清孵育1小时，在室温下，在黑暗中。使用的二级抗体中注明的材料表中。
   8. 除去培养基洗3次，用PBS / 0.2％明胶的10分钟。
   9. 除去培养基，用PBS洗3次。
   10. 装在载玻片上的细胞一侧的盖玻片下来一滴的Vectashield的。保持载玻片在室温下过夜，以让该安装介质干燥，然后将它们存储在4℃。
   11. 掌握用共聚焦显微镜或装备表面荧光相差显微镜图像。被收购与徕卡SP2的紫外激光共聚焦显微镜的代表图像。

结果

的中脑培养步骤的图示流程图如图1所示。简言之，从怀孕的瑞士小鼠收集E13.5胚胎后，腹侧被从整个胚胎解剖。在分离脑片段依次提交酶促消化和机械解离。解离的细胞，通过离心沉淀，重新悬浮在培养基中，并接种在预​​先包被12或24孔板中。将细胞保持15天不更换培养基。

腹侧中脑解剖的详细流程图，对应于步骤3.2中，示于图2。虚线红色线条表...

讨论

这个协议提出必要从胚胎小鼠和免疫荧光法检测多巴胺能神经元的制备中脑的神经元的原代培养物的方法和试剂。关键步骤的程序是在胚胎的清扫和收集的脑碎片的机械解离。高品质的解剖工具，有助于掌握解剖技术。 DA能神经元构成脑的一小部分。因此，收集的腹侧中脑的右侧部分是必不可少的，以获得含有多巴胺神经元的2-4％的培养。机械解离应仔细并轻轻进行。如果文化包含集群的非游离?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine	Lonza	BE12-604F
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red	Life Technologies	25300-054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140122
L-Glutamine, 200 mM solution	Life Technologies	25030123
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma-Aldrich	D0547	Powder
Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl	Sigma-Aldrich	L2020
Poly-L-Ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P3655
Insulin from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	I5523
apo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	T1147
Putrescine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P5780
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783
Sodium selenite	Sigma-Aldrich	S5261
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126	Stock solution 1 M in water
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	Stock solution 2% (w/v) in water
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Paraformaldehyde 16% in water	Electron Microscopy Sciences	RT 15710-S
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck Millipore	106329
D(+)-Glucose, Monohydrate	Merck Millipore	4074-2
Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur	Merck Millipore	109057
Sterile water - Aqua B. Braun	Braun
Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent	VWR	20821.321
Sterile Petri dishes	VWR	82050-566
Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR.	VWR	612-2297
Counting chamber Malassez	VWR	631-0975
Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm	PALL Life science	4525
Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long	Fine Science Tools	14002-14	To open the abdominal wall
Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long	MORIA	4877A	To open the uterine wall
Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm	MORIA	2183	To manipulate embryos
Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades	MORIA	MC50	To take out the mesencephalon
Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long	MORIA	9987	To remove meninges
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates	BD Bioscience	356414
BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid	BD Bioscience	353043
SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º	MENZEL-GLÄSER	AG00008032E
Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø	MARIENFELD	117580
Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody	Chemicon Millipore	AB5622	1/200
Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2	Chemicon Millipore	MAB5406	1/400
Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt	Chemicon Millipore	MAB369	1/500
Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody			1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Goat Serum, New Zealand Origin	Life Technologies	16210-064
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-31556	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-11001	1/1,000
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-11007	1/1,000
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400
Stereomicroscope	Carl Zeiss microscopy	Stemi-2000C
Bunsen Burner FIREBOY	VWR	451-0136