JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Özet

Dopaminerjik nöronlar, beyindeki sinir hücrelerinin toplam sayısının en az% 1 temsil etmektedir. Nöronların Bu düşük miktarı, motor kontrolü, motivasyon ve çalışma belleği gibi önemli beyin fonksiyonlarını düzenler. Nigrostriatal dopaminerjik nöronlar selektif Parkinson hastalığı (PH) dejenere. Bu ilerleyici nöron kaybı tümden patolojinin motorlar semptomları (bradikinezi, dinlenme tremor ve kas sertliği) ile ilişkili. Dopaminerjik nöron dejenerasyonu sorumlu ana ajan hala bilinmemektedir. Bununla birlikte, bu nöronlar çeşitli koşullarda çok hassas olduğu görülmektedir. Primer kültürler özellikleri ve dopaminerjik nöronların özelliklerini araştırmak için en uygun modellerden birini oluşturmaktadır. Bu kültürler durdurmak ya nöronal dejenerasyonu yavaşlatmak amacıyla PD patolojiyi taklit çeşitli stres ajanları ve nöroprotektif bileşiklere sunulabilir. Jeneratör olmuştur PH çok sayıda transgenik fare modellerison on yılda ated başka dopaminerjik nöron kültürler için araştırmacıların ilgisini artırmıştır. Burada, video protokol embriyonik fare beyinleri hassas diseksiyon üzerinde duruluyor. Ventral mezensefalon hassas eksizyonu Daha sonraki çalışmalar, izin vermek için yeteri kadar dopaminerjik hücrelerin nöronal zengin kültürler elde etmek için önemlidir. Bu protokol, embriyonik transgenik fareler ile gerçekleştirilir ve immünofloresan boyama, nicel PCR, ikinci haberci miktarının ya da nöronal ölüm / hayatta kalma değerlendirme için uygundur edilebilir.

Giriş

Dopamin, temel beyin nörotransmitter 1,2 biri, esas olarak orta beyin dopaminerjik (DA) nöronlar tarafından serbest bırakılır. DA nöronlarının çoğunluğu mezensefalon 2-6 ventral kısmında bulunur. Mesostriatal, mezolimbik ve mezokortikal yollar 2,5 şematik olarak, orta beyin DA nöronlar anatomik ve fonksiyonel üç ayrı projeksiyon sistemleri ayrılabilir. Prefrontal korteks projelendirme dopaminerjik yollar biliş 2 karıştığı oysa nigrostriyatal yolu, mezolimbik yollar takviyesi, motivasyon ve öğrenme önemli bir rol oynar, motor davranışları yer almaktadır.

DA nöronlar örneğin, şizofreni, dikkat eksikliği, hiper aktivite bozukluğu, ve Parkinson hastalığı (PD) 2,4 gibi bazı insan nörolojik hastalıklarda rol oynamaktadır. PD substantia nigra bağlantı DA nöronlarının bir ilerici ve seçici dejenerasyonu ile karakterizedirstriatum pars compacta (SNc). PD motor semptomların sorumlu striatum şiddetli dopamin tükenmesine nigro-striatal DA nöronlar sonuçlarının kaybı (bradikinezi, dinlenme tremor ve rijidite) 7. Idiyopatik PH başlangıç ​​nedeni kanıtlanmamıştır ve güncel tedaviler striatum dopamin seviyesini yeniden amaçlayan, sadece semptomatik vardır. En reçete ilaç, L-dopa (levodopa), dopamin doğal öncüsüdür. Levodopa yönetimi belirli bir süre için dopamin kaybı telafi rağmen, motor komplikasyonlar sonra (üzerine diskinezi ve / kapalı devletler) uzun süreli tedaviler 8,9 oluşur.

Dopaminerjik nöronlar ve PH ilgili araştırma sürekli ilerlemesi ve yoğun çabalar hücre nakli, gen tedavisi veya nöroprotektif ajanların 10,11 dayalı tedaviler geliştirmek için yapılıyor. Ancak, büyük bir sorun olmayan aydınlatılamamıştır kalır: aşırı vulnerab nedeni nedirDA nöronların lü k? Cevap kısmı DA nöron aktivitesi bulunabilir. Elektriksel aktivitesinde ve DA, nöronların uyarılabilirliğinin bir azalma 12 dejenere için eğilimlerini artırmak gibi görünüyor. Bununla birlikte, PD patojenezin karmaşıklığı DA katılan mekanizmaları nöronlar 13-15 dejenerasyonu tespit için ileri çalışmalara gerek.

Primer kültürler DA nöron özelliklerini 16-19 incelemek ve nöroprotektif ajanların 20-24 değerlendirilmesi için çeşitli streslere bu nöronların meydan özellikle alakalı. Sıçan kültürü modeli, genellikle fare embriyo mezensefalon ayrılmasının daha kolay olduğu için, fare ile karşılaştırıldığında, nöronların ve daha yüksek miktarlar da Fare içinde elde edilebilir kullanılır. Ancak, hastalığın 25 transgenik fare modelleri nesil fare 26-29 primer kültürler için nörolog toplumun ilgi artmıştır ölçüde etti. Pr kültürlerin rağmenyeni doğmuş hayvanların epared bu nöronların ayırt etme kapasitelerini muhafaza zaman, mitotik sonrası aşaması (mezensefalon nöronlar için E 13.5) embriyo bunları hazırlamak için daha da kullanılabilir. Aşağıdaki protokol hazırlamak için en zor olan fare embriyoları (E 13.5), birincil kültürde izole mezensefalon nöronlar sunar. Özellikle, daha iyi bir yeniden üretilebilirlik için, serum içermeyen kültür ortamı kullanılarak bir protokol sağlar. Kültür hazırlama (diseksiyon ve mekanik ayrışma) olarak iki en kritik adımlar dikkatle ilişkili videoda detaylı olarak açıklanacaktır.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan farenin bakım ve Avrupa Birliği Konseyi kurallarına laboratuvar hayvanlarının kullanımı için (86/609 / AB) uyarınca ele alınmıştır.

Gerekli Çözümleri 1. Hazırlık

  1. Hazır Çözümler
    1. 10x Poli-L-Ornitin (PLO) Çözüm: PLO hidrobromid 10 mg tartılır (molekül ağırlığı = 30,000-70,000) doldurulmuş ve steril, 70 ml su içinde çözülür. -20 ° C de 0.2 um şırınga filtresi, kısım kullanılarak çözeltisi ve mağaza Filtre.
    2. % 30 glükoz solüsyonu: 30 D (+) g tartın - Glukoz ve 100 ml'lik toplam hacme kadar steril su içinde çözülür. 4 ° C'de filtre, kısım ve saklayın.
    3. 5x Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) / Nutrient Mixture Ham F-12: DMEM / Ham F-12, 6 g toz tartılarak 100 ml'lik toplam hacme kadar steril su içinde çözülür. 4 ° C'de filtre, kısım ve saklayın.
    4. % 7.5 Sodyum Bikarbonat (NaHCO3) Solutiile: NaHCO 3, 7.5 g tartılır ve 100 ml'lik toplam hacme kadar steril su içinde çözülür. 4 ° C'de filtre, kısım ve saklayın.
    5. 1 M HEPES Çözüm: HEPES 23.8 g tartılır ve 100 ml'lik toplam hacme kadar steril su içinde çözülür. 4 ° C'de filtre, kısım ve saklayın.
    6. % 70 (h / h) etanol: steril su, 30 ml mutlak etanol içinde 70 ml seyreltin.
  2. Glikoz ve Antibiotics (PBS-GAB) Fosfat Tamponlu Tuz Çözeltisi: 10% 30 glükoz solüsyonu ve Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin, 500 ml penisilin-streptomisin çözeltisi 5 ml ilave ediniz. 4 ° C'de saklayın.
  3. Pasif hale getirilmiş fetal sığır serumu (iFBS) gece boyunca 4 ° C'de bovin serum çözülme ve 30 dakika boyunca 56 ° C'de etkisiz hale getirirler. -20 ° C'de 50 ml kısım ve mağaza.
  4. Kültür vasatı: steril suda, 5x DMEM / Ham F12-ardışık olarak 40 mi, 1 M HEPES 1 mi, 2 mi 200 mM L-glutamin, Penisilin-Streptomisin, 2 mi, 4 ml% 30 glikoz, bir karıştırınnd 180 ml'lik bir nihai hacme kadar% 7.5 NaHCO3 3 mi. Filtre ve aynı gün kullanın.
  5. Hormon Mix
    1. Kültür ortamının 180 ml hazırlayın. Bu ortamda apo-transferin 200 mg çözülür.
    2. Insülin 50 mg tartılır ve 0.1 M HCI, 2 ml içinde çözülür. Yavaşça, karıştırma sırasında steril su içinde yavaş yavaş 8 ml ilave edilir. Kültür ortamında bu çözüm ile seyreltilir.
    3. Putresin dihidroklorür 19,3 mg tartılır ve steril 10 ml su içinde çözülür. Hormon karışımı 10 ml'lik bir solüsyon ilave edin.
    4. , Steril su içinde bir 3 mM sodyum selenit çözeltisi ve mutlak etanol içinde bir 2 mM progesteron çözelti hazırlayın. Hormon karışımı her çözeltiden 20 ul ekle.
    5. -20 ° C'de hormon karışımı, bir kısım halinde, 10 ml ve mağaza Filtre.

Kültür Plakalar ve Araçların 2. Hazırlık

  1. Kültür levhalarını FBS Kaplama: diseksiyon önceki gün, kültür ortamının 180 ml hazırlar. 10 ml eklemekültür ortamı 90 ml iFBS. Ekle 300 ul / oyuk kültür ortamı / poli-D-lizin önceden kaplanmış 24 oyuklu plakalar içinde% 10 iFBS. 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. 4 ° C 'de (ve iFBS olmadan) kalan ortamı saklayın.
  2. Aletleri ve Pasteur pipetler sterilize edin. Sınıf II laminar akış ve CO 2 inkübatör yanı sıra malzemeler tabloda listelenen ekipmanı toplayın.

Fare mezensefalonun 3. Diseksiyon

  1. (Kurumsal kurallarına göre) E13.5 hamile fare Kurban. % 70 etanol ile fare karın temizleyin ve karın duvarı açın. , Narin makas kullanarak bunları açmak, rahim boynuzları toplayın rahim boynuzları her embriyo incelemek ve amniyotik membranlar kaldırmak. Steril PBS-GAB içeren bir 100 mm Petri kabındaki embriyolar yerleştirin ve forseps kullanarak 3 ardışık aynı hamam transferi ile yıkayın. Diseksiyon için, 60 mm steril Petri kabı içinde 3 embriyolar yerleştirin.
  2. Movstereomicroscope altında son Petri e. Embriyoların kafasını etmeyin. Vannas makas kullanma, beyinleri kesip.
    1. Dikkatlice çıkarın ve ön ve arka beyin bölgeleri atın. Rostral tarafına, berzah bölgede kaudal yan kesim için, talamik bölgeye yakın kesim üstün kollikulusu çıkarın.
    2. Ön orta beyin izole edildikten sonra, dikkatli bir şekilde ultra ince forseps kullanılarak meninks çıkarın. PBS-GAB ile dolu bir steril 13 ml tüp içinde, meninkslerde olmadan kesilmiş parçalarını toplamak.
  3. % 70 etanol ile iyice mesencephala içeren tüp temizleyin ve kaputun altında getirmek.

4. Hücre Ayrılma

  1. Yıkama steril PBS ile 3 kez GAB mesencephala. Beyin fragmanları Her yıkama arasında yerleşmek ve doku bozmamak için izin ver. Son yıkamadan sonra, 37 ° C'de 15 dakika boyunca tripsin / EDTA, 3 ml beyin bölümleri mümkün olduğu kadar çok dikkatli bir şekilde çözeltinin ayrılması ve inkübe2 inkübatör CO.
  2. Yangın-lehçe Pastör pipetleri olmayan bir parlatılmış cam pipet sonu olarak nöronların canlılığını maksimize keskin ve ayrışma adımları sırasında hücrelere zarar verebilir. Bunu yangın parlatma esnasında hafifçe ekstremite çapını Pasteur pipet (0,5 mm) azaltır.
  3. Dikkatle mümkün olduğu kadar tripsin / EDTA çözeltisi çıkarın ve kültür ortamı 10 ml /% 10 iFBS ekleyin. Yıkama beyin bölümleri kültür ortamı /% 10 iFBS ile 3 kez.
  4. Yangın cilalanmış Pasteur pipeti kullanarak, kültür ortamı /% 10 iFBS 6 ml mesencephala ayrılmasını başlar. Öğütün 10x daha sonra yeni bir steril 13 ml tüp içinde orta toplamak parçalar oturmasına izin verin, (hava kabarcıklarını önlemek).
  5. , Kültür ortamı, 6 ml ilave kez önceki adımı tekrar ve aynı 13 ml'lik bir tüp içinde çözülmüş hücreleri içeren ortamın toplanması.
  6. 5 dakika boyunca 160 g'de santrifüje hücreleri. Süpernatant atılır ile takviyeli kültür ortamında tekrar süspansiyon hücreleri10% hormon karışımı.

5. Hücre Kaplama

  1. Bir Malassez hücre içinde süspansiyon halinde hücrelerin sayısı ve 600,000 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon ortamın seviyesini ayarlar. Çevresi 1,700,000 hücreleri bir fare mesensefalonundan elde edilebilir.
  2. 24-delikli plakadan boyama maddesini FBS içeren çıkarın ve her bir kuyu hücre süspansiyonu 1 ml eklemek (600,000 hücre / göz, TH + hücrelerinin% 2-4).
  3. 37 ° C'de inkübe edin ve% 5 CO 2/95% hava. Hiçbir orta değişim gereklidir. Dopaminerjik nöronlar in vitro yaklaşık 5-7 gün (dopamin taşıyıcı tutarlı ifadesi) sonra olgun. Orta değiştirmeden 15 gün kültür up hücreleri tutun.

6. İmmünofloresan Protokol

  1. Lameller Temizleme
    1. Diseksiyon bir gün önce, bir Petri kutusu içine 1 M HCI 10 ml ekleyin. Sıvı 12-15 cam kapak yüzeyinde yerleştirin ve 15 dakika bekleyin.
    2. Kapağın Evyesıvı girebilir ve 15 dakika boyunca bekleyin.
    3. , HCI yi uzaklaştırmak ve su ile 3 kez yıkanır.
    4. Bir kez saf etanol ile hızlı bir şekilde lamelleri yıkayın, sonra tabak saf etanol ilave edin ve 30 dakika boyunca bekleyin.
    5. Kapağın altında, etanolden temizlenmiş lamelleri çıkarın ve steril pensler kullanılarak bir 12-yuvalı hücre kültürü plakasının oyuk başına 1 lamel ekleyin.
    6. Yıkama steril su (1 ml / oyuk) ile iki kere lamelleri. Daha sonra, steril bir kez PBS ile yıkayın.
  2. Lameller Kaplama
    1. PBS çıkarın ve 500 ul / 2x FKÖ'nün (PBS içinde seyreltilmiş) ilave edin. CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C de 4 saat süreyle inkübe edilir.
    2. FKÖ çözüm çıkarın ve steril PBS ile 3x yıkayın.
    3. PBS çıkarın ve 500 ul / gözenek% 20 iFBS / 1 ug / ml laminin ekleyin. CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
  3. İmmünofloresan için Hücreleri Kaplama
    1. 12-delikli plakadan kaplama orta çıkarın.
    2. 900,0 ekleme00 hücre / göz 2 ml hacim içinde ve inkübatör içinde 37 ° C'de hücreler büyür. Hücreler ortam değiştirme olmadan 15 gün kültür kadar tutulabilir.
  4. İmmünoboyama
    1. 12-delikli plakadan Ortamı çıkarın ve DMEM, 37 ° C'de önceden ısıtılmış / 500 ul ile yıkayın.
    2. / Oyuk DMEM 500 ul, 37 ° C'de önceden ısıtılmış eklenmekte, daha sonra yavaşça 160 | il / göz, 8% paraformaldehid (PFA,% 2 nihai konsantrasyon) ilave ediniz ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
    3. PFA çıkarın ve PBS ile 3x yıkama / 0.1 M glisin, 10 dakika boyunca.
    4. , PBS çıkarın 300 ul / göz PBS /% 0.05 Triton X-100/20% Keçi serumu ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
    5. , Orta çıkarın 300 ul / göz PBS içinde seyreltilmiş birincil antikor /% 0.05 Triton X-100/1% Keçi serumu ilave edilir ve oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin. Dopaminerjik nöron ve kültürün karakterizasyonu tespiti için kullanılabilecek primer antikorlar Malzeme tabloda belirtilmiştir. Keep1 kuyusu primer antikor olmadan farklı ikincil antikorların arka değerlendirmek için.
    6. Ortamı çıkarın ve PBS ile 3x yıkama /% 0.2 jelatin 10 dakika karıştırıldı.
    7. , Orta çıkarın 300 ul / göz PBS içinde seyreltilmiş sekonder antikor /% 0.05 Triton X-100/1% Keçi serumu ekleyin ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. Kullanılan ikincil antikorlar malzemeleri tabloda belirtilmiştir.
    8. Ortamı çıkarın ve PBS ile 3x yıkama /% 0.2 jelatin 10 dakika karıştırıldı.
    9. Orta çıkarın ve PBS ile 3x yıkayın.
    10. Aşağı Vectashield bir damla cam slaytlar hücre tarafında lamelleri monte edin. Daha sonra 4 ° C'de saklayın, montaj orta kuruması için oda sıcaklığında bir gece slaytlar tutun.
    11. Konfokal mikroskop ya epifluoresan için donatılmış bir faz-kontrast mikroskobu kullanılarak görüntü kazanır. Temsilcisi görüntüleri Leica SP2 UV odaklı mikroskop ile elde edildi.

Sonuçlar

Mezensefalon kültür adımların bir akış şeması gösterilmektedir, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Kısaca, bir gebe fare E 13.5 İsviçre embriyolar alındıktan sonra, ventral mezensefalon tüm embriyo parçalanmıştır. Izole beyin parçaları arka arkaya enzimatik sindirim ve mekanik ayrılma sunulur. Ayrılan hücreler, önceden kaplanmış 12 ya da 24 oyuklu plakalar üzerinde kültür ortamı içinde yeniden süspansiyona alınmış ve kaplama, santrifüj ile pelet haline getirildi. Hü...

Tartışmalar

Bu protokol, embriyonik fare ve dopaminerjik nöronlar tespit etmek için immünofloresan prosedürden mezensefalik nöronlar primer kültürü hazırlamak için gerekli prosedürler ve reaktif maddeler sunmaktadır. Prosedürün kritik aşamaları embriyoların diseksiyon ve toplanan beyin parçalarının mekanik ayrışma bulunmaktadır. Yüksek kaliteli diseksiyon aletleri diseksiyon tekniği master yardımcı olur. DA nöronlar mezensefalonun küçük bir kısmını oluşturmaktadır. Bu duruma göre, ventral mezens...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Fetal Bovine SerumLonza14-801F
DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamineLonzaBE12-604F
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol redLife Technologies25300-054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)Life Technologies15140122
L-Glutamine, 200 mM solutionLife Technologies25030123
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineSigma-Aldrich D8537
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 HamSigma-Aldrich D0547Powder
Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaClSigma-Aldrich L2020
Poly-L-Ornithine hydrobromideSigma-Aldrich P3655
Insulin from porcine pancreasSigma-Aldrich I5523
apo-Transferrin humanSigma-Aldrich T1147
Putrescine dihydrochlorideSigma-Aldrich P5780
ProgesteroneSigma-Aldrich P8783
Sodium seleniteSigma-Aldrich S5261
HEPESSigma-Aldrich H4034 
GlycineSigma-Aldrich G7126Stock solution 1 M in water
GelatinSigma-Aldrich G9391Stock solution 2% (w/v) in water
Triton X-100Sigma-Aldrich T8532
Paraformaldehyde 16% in waterElectron Microscopy SciencesRT 15710-S
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Merck Millipore106329
D(+)-Glucose, MonohydrateMerck Millipore4074-2
Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) TitripurMerck Millipore109057
Sterile water - Aqua B. BraunBraun
Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagentVWR20821.321
Sterile Petri dishesVWR82050-566
Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR.VWR612-2297
Counting chamber MalassezVWR631-0975
Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mmPALL Life science4525
Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm longFine Science Tools14002-14To open the abdominal wall
Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm longMORIA4877ATo open the uterine wall
Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mmMORIA2183To manipulate embryos
Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm bladesMORIAMC50To take out the mesencephalon
Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm longMORIA9987To remove meninges
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell PlatesBD Bioscience356414
BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lidBD Bioscience353043
SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90ºMENZEL-GLÄSERAG00008032E
Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm ØMARIENFELD117580
Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) AntibodyChemicon MilliporeAB56221/200
Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2Chemicon MilliporeMAB54061/400
Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt Chemicon MilliporeMAB3691/500
Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Goat Serum, New Zealand OriginLife Technologies16210-064
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AntibodyLife TechnologiesA-315561/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife TechnologiesA-110011/1,000
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) AntibodyLife TechnologiesA-110071/1,000
VECTASHIELD HardSet Mounting MediumVector LaboratoriesH-1400
StereomicroscopeCarl Zeiss microscopyStemi-2000C
Bunsen Burner FIREBOYVWR451-0136

Referanslar

  1. Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
  2. Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
  3. Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
  4. Chinta, S. J., Andersen, J. K. Dopaminergic neurons. Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).
  5. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  6. Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
  7. Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. Parkinson's disease. Lancet. 363, 1783-1793 (2004).
  8. Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
  9. Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
  10. Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
  11. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
  12. Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
  13. Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
  14. Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. e. r. k. e. r. i. a. n. -. Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
  15. Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. Pathogenesis of Parkinson's disease. Mov Disord. 28, 24-30 (2013).
  16. di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
  17. Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
  18. Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
  19. Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
  20. Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
  21. Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
  22. Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
  23. Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
  24. Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
  25. Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
  26. Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
  27. Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
  28. Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
  29. Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
  30. Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
  31. Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
  32. Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
  33. Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
  34. Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
  35. Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
  36. Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robiyolojiSay 91Mus musculusMezensefalonembriyoniktirozin hidroksilazdopamin transport rParkinson hastal In vitro Modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır