Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Zusammenfassung

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Zusammenfassung

Dopaminergen Neuronen weniger als 1% der gesamten Anzahl von Neuronen im Gehirn. Diese geringe Menge an Neuronen regelt wichtige Hirnfunktionen wie Motorsteuerung, Motivation und Arbeitsgedächtnis. Nigrostriatalen dopaminergen Neuronen selektiv degenerieren bei Parkinson-Krankheit (PD). Diese fortschreitende Verlust von Nervenzellen ist eindeutig mit den Motoren Symptome der Pathologie (Bradykinesie, Ruhetremor und Muskelstarre) assoziiert. Die wichtigsten Vertreter der dopaminergen Neuronen verantwortlich Degeneration ist noch unbekannt. Allerdings scheinen diese Neuronen extrem anfällig in unterschiedlichen Bedingungen zu sein. Primärkulturen stellen eine der wichtigsten Modelle Eigenschaften und Merkmale von dopaminergen Neuronen zu untersuchen. Diese Kulturen können auf verschiedene Stressmittel, die PD Pathologie imitieren und zu neuroprotektiven Verbindungen, um zu stoppen oder zu verlangsamen neuronale Degeneration vorgelegt werden. Die zahlreichen transgenen Mausmodellen der PD, die Gener habenergaben sich im letzten Jahrzehnt weiter erhöht das Interesse der Forscher für dopaminerge Neuronenkulturen. Hier konzentriert sich das Video-Protokoll auf den empfindlichen Dissektion der embryonalen Gehirn der Maus. Präzise Exzision der ventralen Mittelhirn ist entscheidend für die neuronalen Kulturen ausreichend reich an dopaminergen Zellen zu erhalten, um nachfolgende Studien zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann mit embryonalen transgenen Mäusen realisiert werden und ist für die Immunfluoreszenzfärbung, quantitative PCR, second messenger Quantifizierung oder zum neuronalen Tod / Überleben Beurteilung.

Einleitung

Dopamin, eine der wesentlichen Neurotransmitter im Gehirn ^1,2, wird hauptsächlich von dopaminergen Mittelhirn (DA) Neuronen freigesetzt. Die Mehrheit der DA Neuronen befinden sich in der ventralen Teil des Mittelhirns ^2-6. Mesostriatal, mesolimbischen und mesocorticalen Wege ^2,5: schematisch, Mittelhirn-Neuronen DA kann in drei anatomisch und funktionell verschiedene Projektionssysteme aufgeteilt werden. Der Weg wird in nigrostriatale Motorik beteiligt, die mesolimbischen Bahnen spielen eine wichtige Rolle in der Verstärkung, Motivation und Lernen, während die dopaminergen Bahnen zum präfrontalen Kortex vorstehen, sind in Erkenntnis ² beteiligt.

DA-Neuronen in mehreren neurologischen Störungen menschlichen wie Schizophrenie, Aufmerksamkeitsdefizit, Hyperaktivität Erkrankung und Parkinson-Krankheit (PD) ^2,4 beteiligt. PD wird durch eine progressive Degeneration der selektiven und DA Neuronen verbinden Substantia nigra gekennzeichnetpars compacta (SNC) zum Striatum. Der Verlust der nigrostriatalen DA Neuronen führt zu einer starken Verarmung Dopamin im Striatum, die verantwortlich für die motorischen Symptome der PD (Bradykinesie, Ruhetremor, und Steifigkeit) ^7. Die ursprüngliche Ursache der idiopathischen PD ist nicht nachgewiesen und die aktuellen Behandlungen sind nur symptomatisch, mit dem Ziel der Wiederherstellung Dopaminspiegel im Striatum. Das verschriebene Medikament ist L-Dopa (Levodopa), das natürliche Vorläufer von Dopamin. Obwohl Verabreichung von Levodopa kompensiert den Verlust von Dopamin zu einer bestimmten Zeit auftreten Motor Komplikationen nach einer Langzeitbehandlung (Dyskinesie und / AUS-Zustände) ^8,9.

Forschung auf dopaminerge Neuronen und PD ist in ständiger Progression und intensive Anstrengungen unternommen werden, um Behandlungen auf Zelltransplantation, Gentherapie, oder neuroprotektive Mittel ^10,11 zu entwickeln. Allerdings bleibt ein wichtiges Thema nicht geklärt: Was ist die Ursache für die extreme vulnerability von DA Neuronen? Ein Teil der Antwort kann in der Aktivität von Neuronen DA gefunden werden. Eine Reduktion der elektrischen Aktivität und der Erregbarkeit von DA-Neuronen scheint die Neigung zu degenerieren ¹² zu erhöhen. Dennoch ist die Komplexität der PD Pathogenese erfordert weitere Studien, um die Mechanismen in DA Neuronen beteiligt Degeneration ^13-15 identifizieren.

Primärkulturen sind besonders relevant für die DA Neuron Eigenschaften ^16-19 studieren und diese Neuronen auf verschiedene Belastungen für die Bewertung der neuroprotektive Mittel ^20-24 herauszufordern. Ratte Kulturmodelle werden häufig verwendet, da die Präparation der Rattenembryohirn ist einfacher, verglichen mit der Maus, und höhere Mengen von Neuronen bei Ratten erhalten werden. Allerdings hat von transgenen Mausmodellen der Krankheit ²⁵ deutlich erhöht das Interesse der Neurowissenschaftler Community für Primärkulturen von der Maus ^26-29. Obwohl Kulturen prvon neugeborenen Tieren epared verwendet werden kann, ist es besser, sie von Embryonen im post-mitotischen Stadium (E13.5 für Mesencephalon-Neuronen) herzustellen, wenn Neuronen haben ihre Fähigkeit zur Differenzierung beibehalten. Das folgende Protokoll stellt isoliert Hirn-Neuronen in Primärkultur von Maus-Embryonen (E13.5), die am schwierigsten zu vorzubereiten. Insbesondere stellen wir ein Protokoll mit serumfreiem Kulturmedium für eine bessere Reproduzierbarkeit. Die beiden wichtigsten Schritte in der Kultur-Präparat (Dissektion und mechanische Dissoziation) wird vorsichtig in den zugehörigen Video detailliert werden.

Protokoll

Die in dieser Arbeit verwendeten Mäuse wurden gepflegt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Rates der Europäischen Union (86/609 / EU) für den Einsatz von Labortieren behandelt.

1. Herstellung der erforderlichen Lösungen

1. Stammlösungen
   1. 10x Poly-L-Ornithin (PLO) Lösung: wiegen 10 mg PLO Hydrobromid (Molekulargewicht = 30,000-70,000) und in 70 ml sterilem Wasser auflösen. Die Lösung wird mit 0,2 um Spritzenfilter, aliquoten, und bei -20 ° C.
   2. 30% Glucose-Lösung: wiegen 30 g D (+) - Glucose und Auflösen in sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. Filter, aliquoten, und bei 4 ° C.
   3. 5x Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) / Nährstoff-Mischung F-12 Ham: abwiegen 6 g DMEM / F-12 Ham Pulver und lösen sich in sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. Filter, aliquoten, und bei 4 ° C.
   4. 7,5% Natriumbicarbonat (NaHCO ₃₎ Solutiauf: wiegen 7,5 g NaHCO ₃ und lösen sich in sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. Filter, aliquoten, und bei 4 ° C.
   5. 1 M HEPES-Lösung: Man wiegt 23,8 g HEPES und Auflösen in sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. Filter, aliquoten, und bei 4 ° C.
   6. 70% (v / v) Ethanol: Verdünnen mit 70 ml absolutem Ethanol mit 30 ml sterilem Wasser.
2. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Glucose und Antibiotika (PBS-GAB): 10 ml 30% ige Glucoselösung und 5 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung zu 500 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Lagerung bei 4 ° C.
3. Inaktiviertes fötales Rinderserum (IFB) auftauen Rinderserum über Nacht bei 4 ° C inaktiviert bei 56 ° C für 30 min. Aliquot in 50 ml und bei -20 ° C.
4. Kulturmedium: in sterilem Wasser, Mischung nacheinander mit 40 ml 5x DMEM / F12-Ham, 1 ml 1 M HEPES, 2 ml von 200 mM L-Glutamin, 2 ml Penicillin-Streptomycin, 4 ml 30% Glucose einnd 3 ml 7,5% iger NaHCO ₃ auf ein Endvolumen von 180 ml. Zu filtern und verwenden am selben Tag.
5. Hormon-Mix
   1. Planen 180 ml Kulturmedium. Man löst 200 mg des apo-Transferrin in diesem Medium.
   2. Man wiegt 50 mg Insulin und in 2 ml 0,1 M HCl zu lösen. Fügen Sie langsam 8 ml sterilem Wasser unter Mischen sanft. Verdünne die Lösung in dem Kulturmedium.
   3. Wiegen 19,3 mg Putrescin-dihydrochlorid und in 10 ml sterilem Wasser auflösen. Fügen Sie die 10 ml-Lösung auf das Hormon-Mix.
   4. Bereiten Sie eine 3 mM Natriumselenit-Lösung in sterilem Wasser und 2 mM Progesteron-Lösung in absolutem Ethanol. Mit 20 ul jeder Lösung auf das Hormon-Mix.
   5. Filtern Sie die Hormon-Mix, Aliquot in 10 ml und bei -20 ° C.

2. Herstellung von Kulturplatten und Instrumente

1. FBS Beschichtung der Kulturplatten: Der Tag vor der Dissektion, bereiten 180 ml Kulturmedium. 10 mlIFB auf 90 ml Kulturmedium. Geben Sie 300 ul / Kulturmedium / 10% IFBS in Poly-D-Lysin-Fertig 24-Well-Platten. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C aufweist. Bewahren Sie die übrigen Medien (mit und ohne IFBS) bei 4 ° C.
2. Sterilisieren die Instrumente und Pasteur-Pipetten. Sammeln Sie die in der Materialliste aufgeführt als Class II Laminarströmungshaube und einem CO _2-Inkubator Ausrüstung.

3. Präparation der Maus Mesencephalon

1. Opfern eine E13.5 schwangere Maus (gemäß gültiger Richtlinien). Reinigen Sie den Bauch der Maus mit 70% Ethanol und öffnen Sie die Bauchdecke. Sammeln Sie die Gebärmutterhörner, öffnen Sie sie mit zarten Schere, sezieren jedem Embryo von der Gebärmutterhörner, und entfernen Sie das Frucht Membranen. Legen Sie die Embryonen in einer 100 mm Petrischale mit sterilem PBS-GAB und waschen Sie sie durch Übertragung in 3 aufeinanderfolgenden gleichen Bäder mit einer Pinzette. Für die Präparation, legen Sie die Embryonen von 3 in einer 60 mm sterilen Petrischale.
2. Move die letzten Petrischale unter dem Stereomikroskop. Enthaupten nicht die Embryonen. Verwendung Vannas Schere, die Gehirne herauszuschneiden.
   1. Entfernen und entsorgen den Vordergrund und Hinterhirn Regionen. Um rostralen Seite, schneiden in der Nähe des Thalamus-Region, an der Schwanzseite Schnitt an der Landenge Region, entfernen Sie den Colliculus superior.
   2. Sobald der ventralen Mittelhirn isoliert ist, sorgfältig Hirnhäute mit ultra feinen Pinzette entfernen. Sammeln Sie die Segmente zerlegt, ohne die Hirnhäute, in einer sterilen 13-ml-Tube mit PBS-GAB gefüllt.
3. Reinigen Sie das Rohr mit dem mesencephala gründlich mit 70% Ethanol und bringen sie unter der Haube.

4. Zelldissoziation

1. Wasch mesencephala mit sterilem PBS-GAB 3x. Erlauben Gehirn Fragmente zwischen jedem Wasch absetzen und vermeiden das Gewebe zu beeinträchtigen. Nach dem letzten Wasch, entfernen Sie sorgfältig, wie viel Lösung wie möglich und Inkubation Gehirn Segmente in 3 ml Trypsin / EDTA für 15 min bei 37 ° C in eineCO _2-Inkubator.
2. Feuer-Politur die Pasteur-Pipetten, um das Überleben der Neuronen als das Ende eines nicht-polierten Glaspipette zu maximieren ist scharf und kann die Zellen während der Dissoziation Schritte beschädigen. Reduzieren Sie die Extremität Durchmesser (bis 0,5 mm) des Pasteur-Pipette, während Feuer-polieren.
3. So viel Trypsin / EDTA-Lösung entfernen Sie vorsichtig wie möglich und mit 10 ml Kulturmedium / 10% IFBS. Wasch Gehirn Segmente 3x mit Kulturmedium / 10% IFBS.
4. Verwendung der feuerpolierten Pasteurpipette beginnen Dissoziation mesencephala in 6 ml Kulturmedium / 10% IFBS. Man reibt 10x (Luftblasen vermeiden), lassen die Stücke zu regeln, dann sammeln das Medium in ein neues steriles 13-ml-Tube.
5. 6 ml Kulturmedium, wiederholen Sie den vorherigen Schritt einmal zu sammeln und das Medium mit dissoziierten Zellen in der gleichen 13-ml-Tube.
6. Zentrifuge Zellen bei 160 g für 5 min. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in Kulturmedium, ergänzt mit10% Hormon-Mix.

5. Handy-Überzug

1. Zählen von Zellen in Suspension in einem Malassez Zelle und die Lautstärke von mittleren bis zu einer Konzentration von 600.000 Zellen / ml. Rund 1.700.000 Zellen können aus einer Maus Hirn gewonnen werden.
2. Entfernen FBS-haltigen Beschichtungsmedium von 24-Well-Platten und fügen Sie in jede Vertiefung 1 ml Zellsuspension (600.000 Zellen / Well, 2-4% der TH + Zellen).
3. Inkubieren der Platte bei 37 ° C und 5% CO _2/95% Luft. Kein Medium Veränderung ist notwendig. Dopaminergen Neuronen sind ausgereift nach etwa 5-7 Tagen in vitro (in Übereinstimmung Ausdruck der Dopamin-Transporter). Zellen in Kultur zu halten bis zu 15 Tage ohne Mediumwechsel.

6. Immunfluoreszenz-Protokoll

1. Reinigung der Deckgläser
   1. Am Tag vor der Präparation, 10 ml 1 M HCl in eine Petrischale. Lag an der Oberfläche der Flüssigkeit 12-15 Deckgläser und warten Sie 15 min.
   2. Sinken die Abdeckungschlüpfen in die Flüssigkeit und warten Sie 15 min.
   3. HCl zu entfernen und waschen 3x mit Wasser.
   4. Schnell waschen Sie die Deckgläser mit reinem Ethanol einmal, dann fügen reinem Ethanol in die Schale und warten Sie 30 min.
   5. Unter der Haube entfernen gereinigt Deckgläser aus Ethanol und fügen Sie ein Deckglas pro Vertiefung einer 12-Well-Zellkulturplatte mit sterilisierten Pinzette.
   6. Waschdeckgläser zweimal mit sterilem Wasser (1 ml / Vertiefung). Dann waschen Sie einmal mit sterilem PBS.
2. Beschichtung der Deckgläser
   1. PBS zu entfernen und fügen Sie 500 ul / 2x PLO (verdünnt in PBS). Inkubation für 4 Stunden bei 37 ° C im CO _2-Inkubator.
   2. Entfernen Sie die PLO-Lösung und waschen 3x mit sterilem PBS.
   3. PBS zu entfernen und fügen Sie 500 ul / 20% IFBS / 1 g / ml Laminin. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C im CO _2-Inkubator.
3. Ausplattieren der Zellen für Immunfluoreszenz
   1. Entfernen Beschichtungsmedium von 12-Well-Platten.
   2. Fügen 900,000 Zellen / Vertiefung in 2 ml Volumen und Wachstum der Zellen bei 37 ° C im Brutschrank. Zellen können in Kultur bis zu 15 Tage ohne Mediumwechsel gehalten werden.
4. Immunfärbung
   1. Entfernen Medium von 12-Well-Platten und Waschen mit 500 ul / well DMEM vorgewärmt auf 37 ° C.
   2. Gib 500 ul / Vertiefung DMEM vorgewärmt auf 37 ° C, dann fügen vorsichtig 160 ul / Vertiefung von 8% Paraformaldehyd (PFA, 2% Endkonzentration) und Inkubation für 10 min bei 37 ° C aufweist.
   3. PFA entfernen und waschen 3x mit PBS / 0,1 M Glycin für 10 min.
   4. PBS zu entfernen, fügen Sie 300 ul / PBS / 0,05% Triton X-100/20% Ziegenserum und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
   5. Medium entfernen, werden 300 ul / Vertiefung von primärem Antikörper, verdünnt in PBS / 0,05% Triton X-100/1% Ziegenserum und Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Primäre Antikörper, die zum Nachweis von dopaminergen Neuronen und Charakterisierung der Kultur verwendet werden können, sind in der Tabelle angegebenen Materialien. Halten1 auch ohne primären Antikörper für Hintergrund der verschiedenen Sekundärantikörper zu bewerten.
   6. Medium entfernen und waschen 3x mit PBS / 0,2% Gelatine für 10 min.
   7. Medium entfernen, werden 300 ul / Vertiefung des sekundären Antikörpers, verdünnt in PBS / 0,05% Triton X-100/1% Ziegenserum und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. Sekundärantikörper verwendet werden, in der Tabelle angegebenen Materialien.
   8. Medium entfernen und waschen 3x mit PBS / 0,2% Gelatine für 10 min.
   9. Medium entfernen und waschen 3x mit PBS.
   10. Montieren Sie die Deckgläser auf Glasobjektträgern Zellseite nach unten in einem Tropfen Vectashield. Halten Sie die Folien bei Raumtemperatur über Nacht, um die Montage Medium trocknen lassen, dann speichern Sie sie bei 4 ° C.
   11. Erwerben Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop oder einem Phasenkontrast Epifluoreszenz ausgestattet. Repräsentative Bilder wurden mit einem Leica SP2 UV konfokalen Mikroskop erfasst.

Ergebnisse

Eine illustrierte Flussdiagramm der Mittelhirn-Kultur Schritte ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, nach dem Sammeln von E13.5 Embryonen von einer schwangeren Schweizer Maus, Ventralmesenzephalons von der gesamten Embryo seziert. Die isolierten Gehirnfragmente werden nacheinander auf die enzymatische Verdauung und mechanische Dissoziation eingereicht. Dissoziierten Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert und in vorbeschichteten 12 oder 24-Well-Platten ausplat...

Diskussion

Dieses Protokoll stellt die Verfahren und Reagenzien notwendig, eine Primärkultur von Mittelhirnneuronen von der embryonalen Maus und der Immunfluoreszenz-Verfahren zu dopaminergen Neuronen zu erkennen vorzubereiten. Kritische Schritte des Verfahrens sind die Dissektion der Embryonen und die mechanische Dissoziation der Fragmente gesammelt Gehirn. Hochwertige Dissektionsinstrumente hilft, die Technik zu beherrschen Dissektion. DA-Neuronen bilden einen kleinen Teil des Mittelhirns. Dementsprechend sammelt den rechten Te...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine	Lonza	BE12-604F
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red	Life Technologies	25300-054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140122
L-Glutamine, 200 mM solution	Life Technologies	25030123
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma-Aldrich	D0547	Powder
Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl	Sigma-Aldrich	L2020
Poly-L-Ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P3655
Insulin from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	I5523
apo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	T1147
Putrescine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P5780
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783
Sodium selenite	Sigma-Aldrich	S5261
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126	Stock solution 1 M in water
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	Stock solution 2% (w/v) in water
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Paraformaldehyde 16% in water	Electron Microscopy Sciences	RT 15710-S
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck Millipore	106329
D(+)-Glucose, Monohydrate	Merck Millipore	4074-2
Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur	Merck Millipore	109057
Sterile water - Aqua B. Braun	Braun
Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent	VWR	20821.321
Sterile Petri dishes	VWR	82050-566
Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR.	VWR	612-2297
Counting chamber Malassez	VWR	631-0975
Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm	PALL Life science	4525
Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long	Fine Science Tools	14002-14	To open the abdominal wall
Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long	MORIA	4877A	To open the uterine wall
Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm	MORIA	2183	To manipulate embryos
Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades	MORIA	MC50	To take out the mesencephalon
Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long	MORIA	9987	To remove meninges
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates	BD Bioscience	356414
BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid	BD Bioscience	353043
SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º	MENZEL-GLÄSER	AG00008032E
Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø	MARIENFELD	117580
Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody	Chemicon Millipore	AB5622	1/200
Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2	Chemicon Millipore	MAB5406	1/400
Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt	Chemicon Millipore	MAB369	1/500
Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody			1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Goat Serum, New Zealand Origin	Life Technologies	16210-064
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-31556	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-11001	1/1,000
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-11007	1/1,000
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400
Stereomicroscope	Carl Zeiss microscopy	Stemi-2000C
Bunsen Burner FIREBOY	VWR	451-0136