マウスドーパミン作動性ニューロンの初代培養

要約

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

要約

ドーパミン作動性ニューロンは、脳におけるニューロンの総数の1％未満を表す。ニューロンのこの低い量は、モータ制御、モチベーション、およびワーキングメモリなどの重要な脳の機能を調節する。黒質線条体ドーパミン作動性ニューロンを選択的にパーキンソン病（PD）に変性する。この進行性の神経細胞の損失は、明確に病理のモータ症状（動作緩慢、安静時振戦、筋固縮と）に関連付けられています。ドーパミン作動性ニューロン変性の責任を主剤はまだ不明です。しかし、これらのニューロンは、多様な条件で非常に脆弱であることが表示されます。初代培養は、ドーパミン作動性ニューロンの特性および特徴を調べるため、最も関連性の高いモデルの一つを構成する。これらの培養物を停止またはニューロン変性を遅くするために、PDの病理を模倣するさまざまなストレス剤および神経保護化合物に提出することができます。 GENERていたPDの多数のトランスジェニックマウスモデル過去10年間にatedはさらにドーパミン作動性ニューロン培養のための研究者の関心を増大させた。ここで、ビデオプロトコルは、マウス胎児の脳の繊細な解剖に焦点を当てています。腹側中脳の正確な切除がその後の研究を可能にするためにドーパミン作動性細胞において十分に豊富な神経細胞培養を得ることが重要です。このプロトコルは、胚のトランスジェニックマウスを用いて実現し、免疫蛍光染色、定量P​​CR、セカンドメッセンジャーの定量化、または神経細胞死/生存性評価に適していることができます。

概要

ドーパミンは、本質的な脳の神経伝達物質^1,2の一方は、主として中脳ドーパミン作動性（DA）ニューロンによって放出される。 DAニューロンの大部分は、中脳^2-6の腹の部分に存在します。概略的に、中脳DAニューロンは3解剖学的および機能的に異なる投影システムに分けることができます。mesostriatal、中脳辺縁系、および中間皮質経路^2,5。前頭前皮質に突出するドーパミン作動性経路が認知²に関係しているのに対し、黒質線条体経路は、中脳辺縁系経路が強化、モチベーション、学習に重要な役割を果たし、運動行動に関与している。

DAニューロンは、統合失調症、注意欠陥、過活動障害、及びパーキンソン病^（PD）2,4のようないくつかのヒト神経疾患に関与している。 PDは、黒質を接続するDAニューロンの進行性かつ選択的な変性によって特徴づけられる線条体への緻密部（SNC）。 PDの運動症状の責任がある線条体における深刻なドーパミン枯渇黒質線条体DAニューロン結果の損失（動作緩慢、安静時振戦、及び剛性^）7。線条体におけるドーパミンレベルの復元を目指し、特発性PDの初期の原因は確立されておらず、現在の治療法は対症療法のみである。最も多く処方された薬物は、L-ドーパ（レボドパ）、ドーパミンの自然な前駆体である。レボドパの投与は、一定時間ドーパミンの損失を補償するのに、運動合併症は、長期間の治療（ジスキネジーおよびオン/オフ状態^）8,9を生じる。

ドーパミン作動性ニューロンおよびPDの研究は、一定の進行であり、強烈な努力が細胞移植、遺伝子治療、または神経保護剤^10,11に基づいて治療法を開発するために行われている。しかし、大きな問題は、非解明のまま：極端なvulnerabの原因が何であるかDAニューロンのility？その答えの一部は、DAニューロンの活動で見つけることができます。電気的活動およびDAニューロンの興奮性の減少は^、12を縮退させる彼らの傾向を増大させると思われる。それにもかかわらず、PDの病因の複雑さは、DAニューロンに関与する機構は^13-15退化識別するために、さらなる研究が必要である。

初代培養は、DAニューロンの性質^16-19を研究すると、神経保護剤^20〜24の評価のためにさまざまなストレスにこれらのニューロンに挑戦することが特に関連しています。ラット培養モデルは、ほとんどの場合、ラット胚中脳の解剖が容易であるように、マウスと比べて、ニューロンのより高い量は、ラットで得ることができ、使用されている。しかし、病気²⁵のトランスジェニックマウスモデルの生成が大幅にマウス^26-29からの初代培養のための神経科学コミュニティの関心が高まっている。広報文化ものの生まれたばかりの動物からepared使用することができ、それが神経細胞が分化する能力を保持しているときには、有糸分裂後の段階（中脳の神経細胞のためE13.5）で胚からそれらを準備することをお勧めします。以下のプロトコルを準備することが最も困難であるマウス胚（E13.5）からの初代培養中の単離中脳ニューロンを提示します。注目すべきことに、私たちは、より良い再現性のために、無血清培地を使用してプロトコルを提供する。培養の準備（解剖および機械的解離）内の2つの最も重要なステップは慎重に関連したビデオの中で詳細に説明する。

プロトコル

この研究で使用したマウスは、世話および実験動物の使用のための欧州連合評議会（86/609 / EU）のガイドラインに従って取り扱った。

必要な溶液の調製

1. ストック溶液
   1. 10倍のポリ-L-オルニチン（PLO）ソリューション：PLO臭化水素酸（分子量= 30,000-70,000）を10mg秤量し、滅菌水70mlに溶解する。 -20℃で0.2μmのシリンジフィルター、分量、およびストアを使用してソリューションをフィルタリングします。
   2. 30％グルコース溶液は：D（+）を30g秤量 - グルコースを、100mlの全量を滅菌水に溶解する。フィルター、分量、そして4℃で保存する。
   3. 5×ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）/栄養素混合物F-12ハム：DMEM /ハムF-12粉末を6gを秤量し、100mlの全体積に滅菌水に溶解する。フィルター、分量、そして4℃で保存する。
   4. 7.5％重炭酸ナトリウム（ _炭酸水素ナトリウム）Soluti上：NaHCO ₃を7.5グラムを秤量し、100mlの全体積に滅菌水に溶解する。フィルター、分量、そして4℃で保存する。
   5. 1 M HEPES溶液：HEPES 23.8gのを秤量し、100mlの全体積に滅菌水に溶解する。フィルター、分量、そして4℃で保存する。
   6. 70％（v / v）のエタノール：滅菌水30mlの無水エタノール70ml中に希釈する。
2. グルコース及び抗生物質をリン酸緩衝生理食塩水（PBS-GAB）：ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水の500ミリリットルのペニシリン - ストレプトマイシン溶液、30％グルコース溶液10mlと5ミリリットルを追加します。 4℃で保存。
3. 不活性化したウシ胎児血清（IFBS）：4℃で一晩ウシ血清を解凍し、30分間56℃で不活性化する。 -20℃で50ミリリットルに分注して保存。
4. 培養培地：滅菌水で、連続して5回DMEM / F12-ハム40mlのを混ぜ、1 M HEPES、200mMのL-グルタミン、2mlのペニシリン - ストレプトマイシン2mlの30％グルコースaを4mlの1mlのndは180ミリリットルの最終容量を7.5％NaHCO ₃を3mlの。濾過し、同じ日に使用します。
5. ホルモンミックス
   1. 培養液180ミリリットルを用意してください。この培地中でアポトランスフェリンを200mg溶解する。
   2. インスリン50mgを秤量し、0.1 M HClを2mlに溶解する。静かに混合しながら、滅菌水をゆっくりと8ミリリットルを追加します。培養培地中でこの溶液を希釈。
   3. プトレシン二塩酸塩19.3 mgの秤量し、滅菌水10mlに溶解する。ホルモンミックスに10ミリリットル溶液を加える。
   4. 滅菌水と無水エタノール中2mMのプロゲステロン溶液中の3 mMの亜セレン酸ナトリウム溶液を調製する。ホルモンミックスに各溶液20μlを追加します。
   5. ホルモンミックス、-20℃で10ミリリットルとストアに一定分量をフィルタリングします。

培養プレートと楽器の調製

1. 培養プレートのFBSコーティング：解剖前日は、培養液180ミリリットルを用意。 10mlのを追加します。培地90mlのにIFBS。追加の300μl/ウェルの培地/ポリ-D-リシンプレコート24ウェルプレートに10％IFBS。 37℃で一晩インキュベートする。 4℃で（ととIFBSずに）残っているメディアを保管してください。
2. 楽器やパスツールピペットを滅菌する。クラスII層流フードとCO ₂インキュベータだけでなく、材料表にリストされている機器を収集します。

マウス中脳の3解剖

1. （施設のガイドラインに従って）E13.5の妊娠マウスを生け贄に捧げる。 70％エタノールでマウスの腹部をきれいにし、腹壁を開きます。 、子宮角を集めて繊細なハサミを使用してそれらを開き、子宮角から各胚を解剖し、羊膜を取り除く。滅菌PBS-GABを含む100ミリメートルペトリ皿に胚を置き、ピンセットを用いて3連続した同一の浴に転送することにより、それらを洗ってください。解剖のために、60ミリメートルの滅菌ペトリ皿に3によって胚を配置します。
2. 楽章実体顕微鏡下での最終的なペトリ皿をメール。胚首をはねるないでください。 Vannasはさみを使用して、脳を切除。
   1. 慎重に前足と後脳領域を除去し、廃棄する。吻側側には、視床領域に近いカット、峡部領域における尾サイドカットに、上丘を削除します。
   2. 腹側中脳が単離されたら、慎重に超微細鉗子を用いて髄膜を除去します。 PBS-GABで満たされた無菌の13ミリリットルチューブに、髄膜なしで、解剖したセグメントを収集します。
3. 70％エタノールで徹底的に中脳を含むチューブをきれいにし、ボンネットの下にそれをもたらす。

4。細胞解離

1. 滅菌PBS-GABと中脳3回洗浄する。脳の断片は、各洗浄の間で和解し、組織を破壊することを避けるためにできるようにします。最後の洗浄の後、できるだけ慎重な限り溶液を除去し、37℃で15分間、トリプシン/ EDTA 3ml中脳セグメントをインキュベート₂インキュベーターのCO。
2. 非研磨したガラスピペットの終了とニューロンの生存を最大にするために火ポリッシュパスツールピペットは、シャープで、解離工程の間に細胞を損傷することができます。それを火研磨しながら、わずかにパスツールピペットの（0.5ミリメートルまで）四肢径を小さく。
3. 慎重に、できるだけ多くのトリプシン/ EDTA溶液を除去し、培養培地10ml / 10％IFBSを追加する。洗浄脳セグメントは、培地/ 10％IFBSで3倍。
4. 熱加工パスツールピペットを用いて、培地/ 10％IFBS 6mlの中脳の解離を開始する。粉末化し、10倍は（気泡を避けるため）、チャンクが新しい無菌の13ミリリットルチューブに培地を収集した後、沈降させる。
5. 、培養液の6ミリリットルを追加すると、前の手順を繰り返し、同じ13ミリリットルチューブに解離した細胞を含む培地を収集します。
6. 5分間160グラムで遠心細胞。上澄みを捨て、補充した培養培地中で細胞を再懸濁10％のホルモンミックス。

5。細胞のプレーティング

1. Malassezセルに懸濁液中の細胞をカウント600,000細胞/ mlの濃度になるように培地の容量を調整します。周り170万細胞は、一匹のマウスの中脳から得ることができる。
2. 24ウェルプレートからFBS含有コーティング培地を除去し、（600000個/ウェル、TH +細胞の2〜4％）を各ウェルに細胞懸濁液1ミリリットルを追加します。
3. 37℃でプレートをインキュベートし、5％CO _2/95％空気。いいえ培地交換の必要はありません。ドーパミン作動性ニューロンは、 インビトロ （ドーパミントランスポーターの一貫した式） で約5〜7日後に成熟している。培地交換せずに15日間培養までで細胞を保管してください。

6。免疫蛍光プロトコル

1. カバーガラスの清掃
   1. 解剖前日は、ペトリ皿に1MのHClを10mlを加える。液体12-15カバーガラスの表面に置き、15分待ちます。
   2. カバーをシンク液体中にスリップし、15分間待ちます。
   3. HClを除去し、水で3回洗う。
   4. 一度純粋なエタノールで迅速にカバーグラスを洗浄し、その後、皿に純エタノールを追加し、30分間待ちます。
   5. フードの下で、エタノールから洗浄カバースリップを除去し、滅菌ピンセットを用いて12ウェル細胞培養プレートのウェルあたり1カバースリップを加える。
   6. 洗濯物は、滅菌水（1ml /ウェル）で2回カバースリップ。その後、滅菌PBSで一回洗っ。
2. カバーガラスのコーティング
   1. PBSを削除し、2×PLO（PBSで希釈）を500μl/ウェルを追加。 CO ₂インキュベーター中、37℃で4時間インキュベートする。
   2. PLO溶液を除去し、滅菌PBSで3回洗浄する。
   3. PBSを削除し、500μL/ウェルの20％IFBS / 1グラム/ mlのラミニンを追加。 CO ₂インキュベーター内で37℃で一晩インキュベートする。
3. 免疫蛍光のために細胞を播種
   1. 12ウェルプレートからコーティング媒体を取り外します。
   2. 900,0を追加00細胞/ウェル2ミリリットルの容量で、インキュベーター中、37℃で細胞を増殖させる。細胞を、培地交換せずに15日間培養最大に維持することができる。
4. 免疫染色
   1. 12ウェルプレートから培地を除去し、500μlの洗浄/ウェルのDMEMを、37℃で予熱。
   2. のDMEM /ウェル500μLを加え、ゆっくり160 /ウェルの8％パラホルムアルデヒド（PFA、最終濃度2％）を追加し、37℃で10分間インキュベート、37℃で予熱。
   3. PFAを削除し、PBSで3回洗浄/ 0.1Mグリシンを10分間。
   4. 、PBSを除去する300 /ウェルのPBS / 0.05％トリトンX-100/20％ヤギ血清を追加し、室温で30分間インキュベートする。
   5. 、培地を除去し、300μlの/ウェルのPBSで希釈した一次抗体/ 0.05％トリトンX-100/1％ヤギ血清を追加し、室温で2時間インキュベートする。ドーパミン作動性ニューロン及び文化の特性を検出するために使用することができる一次抗体は、材料表に示されている。キープ異なる二次抗体の背景で評価する一次抗体なしのウェル1。
   6. 培地を除去し、10分間、PBS / 0.2％ゼラチンで3回洗う。
   7. 、培地を除去し、300μlの/ウェルのPBSで希釈した二次抗体/ 0.05％トリトンX-100/1％ヤギ血清を追加し、暗所で、室温で1時間インキュベートする。使用した二次抗体は、材料表に示されている。
   8. 培地を除去し、10分間、PBS / 0.2％ゼラチンで3回洗う。
   9. メディア取り出し、PBSで3回洗浄する。
   10. ダウンVECTASHIELDのドロップガラススライドセル側のカバースリップをマウントします。その後、4℃で保管してください、封入剤の乾燥をさせ、室温で一晩スライドを保管してください。
   11. 共焦点顕微鏡又は落射蛍光のために装備位相差顕微鏡を用いて画像を取得する。代表的な画像は、ライカSP2 UV共焦点顕微鏡で取得した。

結果

中脳培養ステップの例示フローチャートを図1に示す。簡単に述べると、妊娠中のスイスマウスからE13.5の胚を収集した後、腹側中脳全体の胚から切開される。分離された脳の断片を連続酵素消化および機械的解離に送信されます。解離した細胞を、培養培地中に再懸濁し、プレコーティング12または24ウェルプレートに播種し、遠心分離によりペレット化する。細胞は、培地交換?...

ディスカッション

このプロトコルは、ドーパミン作動性ニューロンを検出するために、胚性マウスと免疫蛍光手順から中脳ニューロンの初代培養を調製するのに必要な手順および試薬を提供する。手順の重要なステップは、胚の解剖し、収集脳断片の機械的解離である。高品質の解剖器具解剖技術を習得するのに役立ちます。 DAニューロンは、中脳のごく一部を構成している。したがって、腹側中脳の右側部?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine	Lonza	BE12-604F
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red	Life Technologies	25300-054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140122
L-Glutamine, 200 mM solution	Life Technologies	25030123
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma-Aldrich	D0547	Powder
Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl	Sigma-Aldrich	L2020
Poly-L-Ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P3655
Insulin from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	I5523
apo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	T1147
Putrescine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P5780
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783
Sodium selenite	Sigma-Aldrich	S5261
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126	Stock solution 1 M in water
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	Stock solution 2% (w/v) in water
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Paraformaldehyde 16% in water	Electron Microscopy Sciences	RT 15710-S
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck Millipore	106329
D(+)-Glucose, Monohydrate	Merck Millipore	4074-2
Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur	Merck Millipore	109057
Sterile water - Aqua B. Braun	Braun
Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent	VWR	20821.321
Sterile Petri dishes	VWR	82050-566
Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR.	VWR	612-2297
Counting chamber Malassez	VWR	631-0975
Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm	PALL Life science	4525
Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long	Fine Science Tools	14002-14	To open the abdominal wall
Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long	MORIA	4877A	To open the uterine wall
Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm	MORIA	2183	To manipulate embryos
Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades	MORIA	MC50	To take out the mesencephalon
Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long	MORIA	9987	To remove meninges
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates	BD Bioscience	356414
BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid	BD Bioscience	353043
SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º	MENZEL-GLÄSER	AG00008032E
Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø	MARIENFELD	117580
Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody	Chemicon Millipore	AB5622	1/200
Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2	Chemicon Millipore	MAB5406	1/400
Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt	Chemicon Millipore	MAB369	1/500
Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody			1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Goat Serum, New Zealand Origin	Life Technologies	16210-064
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-31556	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-11001	1/1,000
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-11007	1/1,000
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400
Stereomicroscope	Carl Zeiss microscopy	Stemi-2000C
Bunsen Burner FIREBOY	VWR	451-0136