Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

Resumo

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Resumo

Neurónios dopaminérgicos representam menos de 1% do número total de neurónios no cérebro. Esta baixa quantidade de neurônios regula funções importantes do cérebro, como controle motor, motivação e memória de trabalho. Neurônios dopaminérgicos nigrostriatal degenerar seletivamente na doença de Parkinson (DP). Esta perda neuronal progressiva é inequivocamente associado aos motores sintomas da patologia (bradicinesia, tremor de repouso, rigidez muscular e). O principal agente responsável dos neurônios dopaminérgicos degeneração ainda é desconhecida. No entanto, esses neurônios parecem ser extremamente vulneráveis ​​em diversas condições. As culturas primárias constitui um dos modelos mais relevantes para investigar as propriedades e características de neurónios dopaminérgicos. Estas culturas podem ser submetidos a vários agentes estressores que imitam PD patologia e compostos neuroprotetores, a fim de parar ou abrandar a degeneração neuronal. Os inúmeros modelos de camundongos transgênicos do PD que foram generciados durante a última década aumentou ainda mais o interesse dos pesquisadores para as culturas de neurónios dopaminérgicos. Aqui, o protocolo de vídeo concentra-se na dissecação delicada de cérebros embrionárias de rato. Excisão precisa do mesencéfalo ventral é crucial para obter culturas neuronais suficientemente ricos em células dopaminérgicas para permitir estudos posteriores. Este protocolo pode ser realizado com camundongos transgênicos embrionárias e é adequado para imunofluorescência, PCR quantitativo, segundo quantificação mensageiro, ou avaliação morte / sobrevivência neuronal.

Introdução

A dopamina, um dos neurotransmissores cerebrais essenciais ^1,2, é libertada principalmente por dopaminérgicos do mesencéfalo (AD) neurónios. A maioria dos neurónios DA residir na parte ventral do mesencéfalo ^2-6. Esquematicamente, neurônios DA mesencéfalo podem ser divididos em três sistemas distintos de projeção anatômica e funcionalmente: mesostriatal, mesolímbico, e caminhos mesocorticais ^2,5. A via nigroestriatal está envolvida no comportamento do motor, as vias mesolímbica desempenhar um papel importante no reforço, a motivação, aprendizagem e, ao passo que as vias dopaminérgicas que se projectam para o córtex pré-frontal estão implicados na cognição ^2.

Neurônios DA estão envolvidos em diversas doenças neurológicas humanas, como a esquizofrenia, déficit de atenção, transtorno de hiperatividade, e doença de Parkinson (DP) ^{de 2,4.} A DP é caracterizada por uma degeneração progressiva e selectiva dos neurónios DA ligar substantia nigrapars compacta (SNC) para o estriado. A perda de Nigro-estriatal da neurônios resulta na depleção de dopamina no corpo estriado grave que é responsável de os sintomas motores da DP (bradicinesia, tremor de repouso, rigidez e) ^7. A causa inicial da DP idiopática não foi estabelecida e os tratamentos atuais são apenas sintomático, com o objetivo de restaurar o nível de dopamina no corpo estriado. A droga mais prescrita é L-Dopa (Levodopa), o precursor natural da dopamina. Embora a administração de Levodopa compensa a perda de dopamina por um certo tempo, complicações motoras ocorrer após tratamentos de longa duração (discinesia e liga / desliga estados) ^8,9.

Pesquisa sobre neurônios dopaminérgicos e PD está em progressão constante e estão sendo feitos intensos esforços para desenvolver tratamentos baseados em transplante de células, a terapia gênica, ou agentes neuroprotetores ^10,11. No entanto, um grande problema permanece não elucidado: o que é a causa da extrema vulnerability de neurônios DA? Parte da resposta pode ser encontrada na actividade dos neurónios DA. A redução da atividade elétrica e da excitabilidade dos neurônios de DA parece aumentar sua propensão a se degenerar ^12. No entanto, a complexidade do PD patogênese requer mais estudos para identificar os mecanismos envolvidos na degeneração de neurônios DA ^13-15.

As culturas primárias são especialmente relevantes para estudar propriedades DA neurônio ^16-19 e desafiar esses neurônios para várias tensões para avaliação de agentes neuroprotetores ^20-24. Modelos de rato de cultura são os mais frequentemente utilizados, como a dissecação do mesencéfalo de embriões de rato é mais fácil, em comparação com o rato, e maiores quantidades de neurónios podem ser obtidos na ratazana. No entanto, a geração de modelos transgênicos da doença ²⁵ aumentou consideravelmente o interesse da comunidade neurocientista para culturas primárias do rato ^26-29. Embora a cultura da prepared de animais recém-nascidos podem ser utilizados, é preferível prepará-los a partir de embriões na fase de pós-mitótico (E13.5 mesencéfalo de neurónios), quando os neurónios mantiveram a sua capacidade de se diferenciar. O protocolo a seguir apresenta os neurónios do mesencéfalo isoladas em cultura primária a partir de embriões de rato (E13.5), as quais são as mais difíceis de preparar. Nomeadamente, é proporcionado um protocolo utilizando meio de cultura isento de soro para uma melhor reprodutibilidade. As duas etapas mais críticas na preparação cultura (dissecção e dissociação mecânica) será cuidadosamente detalhado no vídeo associado.

Protocolo

Os ratos utilizados neste trabalho foram atendidas e tratadas de acordo com as diretrizes do Conselho da União Europeia (86/609 / UE) para o uso de animais de laboratório.

1 Preparação de soluções necessárias

1. Soluções de Stock
   1. 10x de poli-L-ornitina (PLO) Solução: pesam-se 10 mg de bromidrato de PLO (peso molecular = 30,000-70,000) e dissolver em 70 ml de água estéril. Filtra-se a solução com uma seringa de filtro de 0,2 um, alíquota, e armazenar a -20 ° C.
   2. 30% Solução de Glucose: pesam-se 30 g de D (+) - glicose e dissolve-se em água estéril para um volume total de 100 ml. Filter, alíquota, e armazenar a 4 ° C.
   3. Meio de Eagle Modificado de 5x Dulbecco (DMEM) / Mistura nutriente F-12 de Ham: pesam-se 6 g de DMEM / Ham F-12 em pó e dissolve-se em água estéril para um volume total de 100 ml. Filter, alíquota, e armazenar a 4 ° C.
   4. 7,5% de Bicarbonato de Sódio _(NaHCO3) Solutiem: pesam-se 7,5 g de NaHCO ₃ e dissolve-se em água estéril para um volume total de 100 ml. Filter, alíquota, e armazenar a 4 ° C.
   5. Solução 1 M de HEPES: Pesar 23,8 g de HEPES e dissolvem-se em água estéril para um volume total de 100 ml. Filter, alíquota, e armazenar a 4 ° C.
   6. 70% (v / v) de etanol: Diluir 70 ml de etanol absoluto, com 30 ml de água estéril.
2. Salina tamponada com fosfato com glicose e antibióticos (PBS-GAB): adicionar 10 ml de solução de glucose a 30% e 5 ml de solução de penicilina-estreptomicina a 500 ml de fosfato de Dulbecco tamponado salino. Armazenar a 4 ° C.
3. De soro fetal bovino inactivado (ifbs): Descongelar soro bovino durante a noite a 4 ° C e inactiva a 56 ° C durante 30 min. Alíquota em 50 ml e armazenar a -20 ° C.
4. Meio de Cultura: Em água estéril, misturar sucessivamente 40 mL de 5x DMEM / Ham F12-, 1 ml de HEPES 1 M, 2 ml de 200 mM de L-glutamina, 2 ml de penicilina-estreptomicina, 4 ml de 30% de glicose umaº 3 ml de 7,5% de NaHCO ₃ para um volume final de 180 ml. Filtra-se e usar o mesmo dia.
5. Hormônio Mix
   1. Preparar 180 ml de meio de cultura. Dissolve-se 200 mg de apo-transferrina neste meio.
   2. Pesar 50 mg de insulina e dissolver em 2 ml de 0,1 M de HCl. Adicionar lentamente 8 ml de água estéril, enquanto se mistura com cuidado. Dilui-se esta solução no meio de cultura.
   3. Pesar 19,3 mg de dicloridrato de putrescina e dissolver em 10 ml de água estéril. Adicionar a solução de 10 ml à mistura de hormona.
   4. Prepara-se uma solução de selenito de sódio 3 mM em água estéril e uma solução 2 mM de progesterona em etanol absoluto. Adicionar 20 mL de cada solução para o mix de hormônios.
   5. Filtrar a mistura hormonal, alíquota em 10 ml e armazenar a -20 ° C.

2 Preparação de Pratos e Instrumentos Cultura

1. FBS revestimento das placas de cultura: O dia antes da dissecção, preparar 180 ml de meio de cultura. Adicionar 10 ml deifbs para 90 ml de meio de cultura. Adicionar 300 ul / poço de meio de cultura / 10% ifbs em pré-revestidas placas de 24 poços com poli-D-lisina. Incubar durante a noite a 37 ° C. Armazene a mídia restante (com e sem OIF) a 4 ° C.
2. Esterilizar os instrumentos e pipetas Pasteur. Reúna os equipamentos listados na tabela de materiais, bem como uma capa de Classe II de fluxo laminar e uma incubadora de CO _2.

3. Dissection of Mouse Mesencéfalo

1. Sacrifique um rato grávida E13.5 (de acordo com as diretrizes institucionais). Limpe o abdômen do mouse com etanol 70% e abrir a parede abdominal. Recolha os cornos uterinos, abri-los usando uma tesoura delicada, dissecar cada embrião dos cornos uterinos, e remover as membranas amnióticas. Coloque os embriões em uma placa de Petri 100 milímetros contendo PBS estéril-GAB e lavá-los por transferência em 3 sucessivos banhos idênticos usando uma pinça. Para dissecção, coloque os embriões por 3 em um 60 milímetros placa de Petri estéril.
2. MovÊ O prato final Petri sob o microscópio estereoscópico. Não decapitar os embriões. Com uma tesoura Vannas, extirpar os cérebros.
   1. Cuidadosamente retire e descarte as regiões das letras e do rombencéfalo. Para o lado rostral, cortada perto do tálamo, para o corte lateral caudal na região do istmo, remover o colículo superior.
   2. Uma vez que o mesencéfalo ventral é isolado, retire cuidadosamente meninges usando uma pinça ultrafinas. Recolher os segmentos dissecados, sem as meninges, em um tubo estéril 13 ml cheio de PBS-GAB.
3. Limpe o tubo contendo o mesencephala exaustivamente com etanol 70% e trazê-lo sob o capô.

A dissociação 4. celular

1. Lavar mesencephala 3x com PBS estéril-GAB. Permitir fragmentos do cérebro para resolver entre cada lavagem e evitar a ruptura do tecido. Após a última lavagem, retirar cuidadosamente, tanto quanto possível solução e incubar segmentos cerebrais em 3 ml de tripsina / EDTA durante 15 minutos a 37 ° C numaIncubadora de CO _2.
2. -Polonês fogo as pipetas de Pasteur para maximizar a sobrevivência dos neurónios como a extremidade de uma pipeta de vidro não polido é afiado e pode danificar as células, durante os passos de dissociação. Reduzir ligeiramente o diâmetro da extremidade (+ 0,5 mm) da pipeta de Pasteur, enquanto fogo polimento-lo.
3. Remova cuidadosamente tanta solução / EDTA tripsina possível e adicionar 10 ml de meio de cultura / 10% OIF. Segmentos cerebrais Lavar 3x com meio de cultura / 10% OIF.
4. Utilizando a pipeta de Pasteur polida ao fogo, começam a dissociação de mesencephala em 6 ml de meio de cultura / 10% ifbs. Triturar 10x (evitar bolhas de ar), deixe os pedaços para resolver, em seguida, recolher o meio em um novo tubo estéril 13 ml.
5. Adicionar 6 ml de meio de cultura, repetir o passo anterior, uma vez e recolher o meio contendo células dissociadas no mesmo tubo de 13 ml.
6. Centrifugar células a 160 g por 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura suplementado com10% de mistura de hormônio.

5. celular chapeamento

1. Contar as células em suspensão numa célula de Malassez e ajustar o volume do meio a uma concentração de 600.000 células / ml. Cerca de 1,7 milhões de células podem ser obtidas a partir de um mesencéfalo do rato.
2. Remover FBS contendo meio de revestimento de placas de 24 cavidades e adicionar a cada cavidade 1 ml da suspensão de células (600.000 células / poço, 2-4% das células TH +).
3. Incubar a placa a 37 ° C e 5% de CO _2/95% ar. Nenhuma mudança de meio é necessário. Neurônios dopaminérgicos estão maduros depois de cerca de 5-7 dias in vitro (expressão consistente do transportador de dopamina). Manter as células em cultura até 15 dias sem substituição médio.

6. Imunofluorescência Protocolo

1. A limpeza das Lamelas
   1. O dia antes da dissecação, adicionar 10 ml de HCl 1 M em uma placa de Petri. Colocar a superfície dos líquidos 12-15 lamelas de vidro e esperar 15 minutos.
   2. Afundar a tampaescorregar para o líquido e esperar 15 min.
   3. Remover HCl e lavar 3x com água.
   4. Lavam-se as lamelas com etanol puro rapidamente uma vez, em seguida, adicionar etanol puro para o prato e para aguardar 30 minutos.
   5. Sob o capô, remova lamelas limpas a partir de etanol e adicionar uma lamela por poço de 12 poços da placa de cultura de células usando uma pinça esterilizada.
   6. Lavar lamelas duas vezes com água estéril (1 ml / poço). Em seguida, lavá-los uma vez com PBS estéril.
2. Revestimento das Lamelas
   1. Remover PBS e adicionar 500 uL / ​​poço de 2x PLO (diluído em PBS). Incuba-se durante 4 horas a 37 ° C na incubadora de CO _2.
   2. Remover a solução de PLO e lavar 3x com PBS estéril.
   3. Remover PBS e adicionar 500 uL / ​​poço de 20% ifbs / 1 g / ml de laminina. Incubar durante a noite a 37 ° C na incubadora de CO _2.
3. Plaqueamento das células de Imunofluorescência
   1. Remover o meio de revestimento a partir de placas de 12 poços.
   2. Adicionar 900,000 células / cavidade em 2 ml de volume e crescer as células a 37 ° C na incubadora. As células podem ser mantidas em cultura 15 dias sem substituição médio.
4. Imunocoloração
   1. Remover o meio de placas de 12 poços e lava-se com 500 ul / poço de DMEM pré-aquecido a 37 ° C.
   2. Adicione 500 ^ l / poço de DMEM pré-aquecido a 37 ° C, em seguida, adicionar cuidadosamente 160 ul / poço de 8% de paraformaldeído (PFA, 2% de concentração final) e incubar durante 10 min a 37 ° C.
   3. Remover PFA e lavar 3x com PBS / 0,1 M de glicina durante 10 min.
   4. Remover PBS, adicionam-se 300 ul / poço de PBS / 0,05% de Triton X-100/20% de soro de cabra e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
   5. Remover o meio, adicionam-se 300 ul / poço de anticorpo primário diluído em PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de soro de cabra e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Os anticorpos primários que podem ser utilizados para a detecção de neurónios dopaminérgicos e caracterização da cultura estão indicados na tabela Materiais. Mantenha1 bem sem anticorpo primário para avaliar a base dos diferentes anticorpos secundários.
   6. Remover o meio e lava-se 3x com PBS / 0,2% de gelatina durante 10 minutos.
   7. Remover o meio, adicionam-se 300 ul / poço de anticorpo secundário diluído em PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de soro de cabra e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente, no escuro. Anticorpos secundários utilizados são indicados na tabela de Materiais.
   8. Remover o meio e lava-se 3x com PBS / 0,2% de gelatina durante 10 minutos.
   9. Remover o meio e lava-se 3x com PBS.
   10. Montar as lamelas do lado vidro desliza célula para baixo em uma gota de Vectashield. Mantenha as lâminas à temperatura ambiente durante a noite para deixar a montagem meio seco, em seguida, armazená-los, a 4 ° C.
   11. Adquirir imagens usando um microscópio confocal ou um microscópio de contraste de fase equipado para epifluorescência. Imagens representativas foram adquiridos com um microscópio confocal Leica SP2 UV.

Resultados

Um fluxograma que ilustra os passos de cultura de mesencéfalo é mostrado na Figura 1. Resumidamente, após a recolha de embriões a partir de um rato E13.5 Swiss grávida, mesencéfalo ventral é dissecado a partir de todo o embrião. Os fragmentos isolados do cérebro são submetidos sucessivamente a digestão enzimática e dissociação mecânica. As células dissociadas foram sedimentadas por centrifugação, ressuspensas em meio de cultura e semeados em placas de 12 ou de 24 poços pré-revestidos...

Discussão

Este protocolo apresenta os procedimentos e reagentes necessários para a preparação de uma cultura primária de neurónios do mesencéfalo do rato embrionário e o procedimento para a detecção de imunofluorescência neurónios dopaminérgicos. As etapas críticas do processo são a dissecção dos embriões ea dissociação mecânica dos fragmentos cerebrais coletados. Instrumentos de dissecção de alta qualidade ajuda a dominar a técnica de dissecação. Neurónios DA constituem uma pequena percentagem do mesenc...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine	Lonza	BE12-604F
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red	Life Technologies	25300-054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140122
L-Glutamine, 200 mM solution	Life Technologies	25030123
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma-Aldrich	D0547	Powder
Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl	Sigma-Aldrich	L2020
Poly-L-Ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P3655
Insulin from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	I5523
apo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	T1147
Putrescine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P5780
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783
Sodium selenite	Sigma-Aldrich	S5261
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126	Stock solution 1 M in water
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	Stock solution 2% (w/v) in water
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Paraformaldehyde 16% in water	Electron Microscopy Sciences	RT 15710-S
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck Millipore	106329
D(+)-Glucose, Monohydrate	Merck Millipore	4074-2
Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur	Merck Millipore	109057
Sterile water - Aqua B. Braun	Braun
Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent	VWR	20821.321
Sterile Petri dishes	VWR	82050-566
Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR.	VWR	612-2297
Counting chamber Malassez	VWR	631-0975
Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm	PALL Life science	4525
Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long	Fine Science Tools	14002-14	To open the abdominal wall
Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long	MORIA	4877A	To open the uterine wall
Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm	MORIA	2183	To manipulate embryos
Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades	MORIA	MC50	To take out the mesencephalon
Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long	MORIA	9987	To remove meninges
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates	BD Bioscience	356414
BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid	BD Bioscience	353043
SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º	MENZEL-GLÄSER	AG00008032E
Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø	MARIENFELD	117580
Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody	Chemicon Millipore	AB5622	1/200
Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2	Chemicon Millipore	MAB5406	1/400
Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt	Chemicon Millipore	MAB369	1/500
Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody			1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Goat Serum, New Zealand Origin	Life Technologies	16210-064
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-31556	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-11001	1/1,000
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-11007	1/1,000
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400
Stereomicroscope	Carl Zeiss microscopy	Stemi-2000C
Bunsen Burner FIREBOY	VWR	451-0136