Cultivo primario de ratón neuronas dopaminérgicas

Resumen

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Resumen

Las neuronas dopaminérgicas representan menos del 1% del número total de neuronas en el cerebro. Esta baja cantidad de neuronas regula importantes funciones cerebrales como el control motor, la motivación y la memoria de trabajo. Las neuronas dopaminérgicas nigroestriatal selectivamente degeneran en la enfermedad de Parkinson (PD). Esta pérdida neuronal progresiva está inequívocamente asociada con los síntomas motores de la patología (bradicinesia, temblor en reposo, rigidez muscular y). El principal agente responsable de la degeneración de neuronas dopaminérgicas es aún desconocido. Sin embargo, estas neuronas parecen ser muy vulnerables en diversas condiciones. Los cultivos primarios constituyen uno de los modelos más relevantes para investigar las propiedades y características de las neuronas dopaminérgicas. Estas culturas se pueden enviar a varios agentes de estrés que imitan patología PD y para compuestos neuroprotectores para detener o ralentizar la degeneración neuronal. Los numerosos modelos de ratones transgénicos de PD que han sido generATED durante la última década se incrementó aún más el interés de los investigadores por cultivos de neuronas dopaminérgicas. En este caso, el protocolo de vídeo se centra en la delicada disección de cerebro de ratón embrionarias. La escisión precisa del mesencéfalo ventral es crucial para obtener cultivos neuronales suficientemente ricos en células dopaminérgicas para permitir estudios posteriores. Este protocolo puede ser realizado con ratones transgénicos embrionarias y es adecuado para la tinción de inmunofluorescencia, PCR cuantitativa, la cuantificación segundo mensajero, o la evaluación de la muerte / supervivencia neuronal.

Introducción

La dopamina, uno de los neurotransmisores cerebrales esenciales ^1,2, se libera principalmente por dopaminérgicas del cerebro medio (DA), las neuronas. La mayoría de las neuronas DA residen en la parte ventral del mesencéfalo ^2-6. Esquemáticamente, las neuronas dopaminérgicas del cerebro medio se pueden dividir en tres anatómica y funcionalmente distintos sistemas de proyección: mesostriatal, mesolímbico y vías mesocorticales ^2,5. La vía nigroestriatal está implicado en el comportamiento motor, las vías mesolímbico juegan un papel importante en el refuerzo, la motivación y el aprendizaje, mientras que las vías dopaminérgicas que se proyectan hacia la corteza prefrontal están implicados en la cognición ^2.

Neuronas DA están implicados en varios trastornos neurológicos humanos tales como la esquizofrenia, déficit de atención, trastorno de hiperactividad, y la enfermedad de Parkinson (PD) ^2,4. PD se caracteriza por una degeneración progresiva y selectiva de las neuronas DA de conexión sustancia negrapars compacta (SNC) a el cuerpo estriado. La pérdida de nigro-estriatal neuronas DA resultados en grave agotamiento de la dopamina en el cuerpo estriado que es responsable de los síntomas motores de la EP (bradicinesia, temblor de reposo, y la rigidez) ^7. La causa inicial de la idiopática PD no se ha establecido y los tratamientos actuales sólo son sintomáticos, con el objetivo de restauración del nivel de dopamina en el cuerpo estriado. El fármaco más prescrito es la L-Dopa (Levodopa), el precursor natural de la dopamina. Aunque la administración de levodopa compensa la pérdida de dopamina durante un cierto tiempo, las complicaciones motoras se producen después de los tratamientos a largo plazo (discinesia y estados activado / desactivado) ^8,9.

La investigación sobre las neuronas dopaminérgicas y PD está en constante progresión y se están realizando intensos esfuerzos para desarrollar tratamientos basados ​​en el trasplante de células, la terapia génica, o agentes neuroprotectores ^10,11. Sin embargo, un problema importante sigue siendo no dilucidado: ¿cuál es la causa de la extrema Vulnerability de neuronas DA? Parte de la respuesta se puede encontrar en la actividad de las neuronas dopaminérgicas. Una reducción en la actividad eléctrica y de la excitabilidad de las neuronas DA parece aumentar su propensión a degenerar ^12. Sin embargo, la complejidad de la EP patogénesis requiere más estudios para identificar los mecanismos implicados en la degeneración de neuronas DA ^13-15.

Los cultivos primarios son especialmente relevantes para el estudio de las propiedades de las neuronas DA ^16-19 y el de impugnar estas neuronas a varios tipos de estrés para la evaluación de agentes neuroprotectores ^20-24. Se utilizan más a menudo modelos de cultivo de rata, como la disección de mesencéfalo de embriones de rata es más fácil, en comparación con el ratón, y cantidades más altas de las neuronas se pueden obtener en la rata. Sin embargo, la generación de modelos de ratones transgénicos de la enfermedad ²⁵ ha aumentado considerablemente el interés de la comunidad neurocientífica para cultivos primarios de ratón ^26-29. Aunque las culturas prepared de los animales recién nacidos puede ser utilizado, es mejor para prepararlos a partir de embriones en la etapa de post-mitótico (E13.5 para las neuronas de mesencéfalo), cuando las neuronas han conservado su capacidad de diferenciarse. El siguiente protocolo presenta mesencéfalo neuronas aisladas en cultivo primario a partir de embriones de ratón (E13.5), que son los más difíciles de preparar. En particular, se proporciona un protocolo de uso de medio de cultivo libre de suero para una mejor reproducibilidad. Los dos pasos más importantes en la preparación de la cultura (disección y disociación mecánica) se detallan cuidadosamente en el vídeo asociado.

Protocolo

Los ratones utilizados en este trabajo fueron atendidos y manejados de acuerdo con las directrices del Consejo de la Unión Europea (86/609 / UE) para el uso de animales de laboratorio.

1 Preparación de soluciones requeridas

1. Soluciones de archivo
   1. 10x poli-L-ornitina (OLP) Solución: Pesar 10 mg de bromhidrato de PLO (peso molecular = 30,000-70,000) y disolver en 70 ml de agua estéril. Se filtra la solución con 0,2 micras filtro de jeringa, alícuota, y se almacenan a -20 ° C.
   2. 30% solución de glucosa: pesar 30 g de D (+) - Glucosa y disolver en agua estéril hasta un volumen total de 100 ml. Filtro, alícuota y almacena a 4 º C.
   3. Medio de Eagle Modificado de 5x Dulbecco (DMEM) / mezcla de nutrientes F-12 de Ham: Pesar de 6 g de polvo de DMEM / F-12 de jamón y disolver en agua estéril hasta un volumen total de 100 ml. Filtro, alícuota y almacena a 4 º C.
   4. 7,5% de bicarbonato de sodio _(NaHCO3) Solutien: Pesar 7,5 g de _NaHCO3 y se disuelven en agua estéril hasta un volumen total de 100 ml. Filtro, alícuota y almacena a 4 º C.
   5. 1 M HEPES Solución: Pesar 23,8 g de HEPES y disolver en agua estéril hasta un volumen total de 100 ml. Filtro, alícuota y almacena a 4 º C.
   6. 70% (v / v) de etanol: Diluir 70 ml de etanol absoluto con 30 ml de agua estéril.
2. PBS con glucosa y antibióticos (PBS-GAB): añadir 10 ml de solución de glucosa al 30% y 5 ml de solución de penicilina-estreptomicina a 500 ml de fosfato de Dulbecco Buffered Saline. Almacenar a 4 ° C.
3. Fetal inactivado de suero bovino (IFB): Descongelar de suero bovino durante la noche a 4 ° C e inactivar a 56 ° C durante 30 min. Alícuota en 50 ml y se almacena a -20 ° C.
4. Medio de Cultivo: En agua estéril, se mezclan sucesivamente 40 ml de 5x DMEM / F12-Ham, 1 ml de HEPES 1 M, 2 ml de 200 mM de L-glutamina, 2 ml de penicilina-estreptomicina, 4 ml de 30% de glucosa unnd 3 ml de 7.5% de _NaHCO3 a un volumen final de 180 ml. Filtrar y utilizar el mismo día.
5. Hormona Mix
   1. Preparar 180 ml de medio de cultivo. Disolver 200 mg de apo-transferrina en este medio.
   2. Pesar 50 mg de insulina y disolver en 2 ml de HCl 0,1 M. Añadir lentamente 8 ml de agua estéril mientras se mezcla suavemente. Diluir esta solución en el medio de cultivo.
   3. Pesar 19,3 mg de dihidrocloruro de putrescina y disolver en 10 ml de agua estéril. Añadir la solución de 10 ml a la mezcla de la hormona.
   4. Preparar una solución de selenito de sodio 3 mM en agua estéril y una solución de progesterona 2 mM en etanol absoluto. Añadir 20 l de cada solución a la mezcla de la hormona.
   5. Se filtra la mezcla de hormonas, alícuota de 10 ml y se almacena a -20 ° C.

2 Preparación de las placas e instrumentos Cultura

1. FBS Recubrimiento de las placas de cultivo: El día antes de la disección, preparar 180 ml de medio de cultivo. Añadir 10 ml deIFB a 90 ml de medio de cultivo. Añadir 300 l / pocillo de medio de cultivo / 10% IFB en precubiertas placas de 24 pocillos de poli-D-lisina. Incubar toda la noche a 37 ° C. Almacenar los residuos de medios (con y sin OFI) a 4 ° C.
2. Esterilizar los instrumentos y pipetas Pasteur. Reúna el equipo listado en la tabla de materiales, así como una campana de flujo laminar clase II y una incubadora de CO _2.

3. Disección de Ratón Mesencéfalo

1. Sacrificar un ratón embarazada E13.5 (según las directrices institucionales). Limpiar el abdomen del ratón con etanol al 70% y abrir la pared del abdomen. Recoge los cuernos uterinos, abrirlas con unas tijeras delicadas, diseccionar cada embrión de los cuernos uterinos, y quitar las membranas amnióticas. Coloca los embriones en una placa de Petri de 100 mm que contiene PBS estéril-GAB y lavarlos por transferencia en 3 baños idénticos sucesivos utilizando pinzas. Para la disección, colocar los embriones en un 3 en un 60 mm placa de Petri estéril.
2. Move el plato final Petri bajo el microscopio estereoscópico. No decapitar a los embriones. Con unas tijeras Vannas, extirpar el cerebro.
   1. Retire con cuidado y deseche las regiones previsiones y cerebro posterior. Para el lado rostral, cortar cerca de la región talámica, a la corte lateral caudal en la región del istmo, retire el colículo superior.
   2. Una vez que el cerebro medio ventral está aislado, retire con cuidado meninges utilizando fórceps ultrafinas. Recoge los segmentos disecados, sin las meninges, en un tubo de 13 ml estéril llena de PBS-GAB.
3. Limpie el tubo que contiene la mesencephala a fondo con etanol al 70% y ponerla bajo el capó.

Disociación 4. Cell

1. Lave mesencephala 3x con PBS estéril-GAB. Permitir fragmentos cerebrales se asienten entre cada lavado y evitar la interrupción del tejido. Después del último lavado, eliminar cuidadosamente como cantidad posible de solución e incubar segmentos cerebrales en 3 ml de tripsina / EDTA durante 15 minutos a 37 ° C en unCO ₂ incubadora.
2. Fuego-pula las pipetas Pasteur para maximizar la supervivencia de las neuronas como el final de una pipeta de vidrio no pulida es fuerte y puede dañar las células durante las etapas de disociación. Ligeramente reducir el diámetro de la extremidad (hasta 0,5 mm) de la pipeta Pasteur, mientras que el fuego-pulirlo.
3. Retire con cuidado tanto / EDTA solución tripsina como sea posible y añadir 10 ml de medio de cultivo / 10% IFB. Segmentos cerebrales Lave 3 veces con medio de cultivo / 10% IFB.
4. Usando la pipeta Pasteur pulida al fuego, comience disociación de mesencephala en 6 ml de medio de cultivo / 10% IFB. Triturar 10x (evitar las burbujas de aire), permiten que los trozos se asienten, a continuación, recoger el medio en un nuevo tubo estéril 13 ml.
5. Añadir 6 ml de medio de cultivo, repita el paso anterior una vez y recoger el medio que contiene células disociadas en el mismo tubo de 13 ml.
6. Centrifugar las células a 160 g durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en medio de cultivo suplementado conMezcla de la hormona 10%.

5. Cell Plating

1. Contar las células en suspensión en una célula de Malassez y ajustar el volumen del medio a una concentración de 600.000 células / ml. Alrededor de 1,7 millones de células se pueden obtener de un mesencéfalo ratón.
2. Retire que contenía FBS medio de revestimiento de placas de 24 pocillos y añadir en cada pocillo 1 ml de la suspensión celular (600.000 células / pocillo, el 2-4% de las células TH +).
3. Incubar la placa a 37 ° C y 5% CO _2/95% de aire. No es necesario cambio de medio. Las neuronas dopaminérgicas son maduros después de unos 5-7 días in vitro (expresión coherente del transportador de dopamina). Mantener las células en cultivo hasta 15 días sin reemplazo medio.

Protocolo 6. inmunofluorescencia

1. Limpieza de las Cubreobjetos
   1. El día antes de la disección, agregar 10 ml de HCl 1 M en una placa de Petri. Coloque en la superficie de las 12-15 cubreobjetos de vidrio líquido y esperar 15 min.
   2. Hunde la cubiertacaer en el líquido y esperar 15 min.
   3. Retire HCl y lavar 3 veces con agua.
   4. Lavar los cubreobjetos con etanol puro rápidamente una vez, a continuación, añadir etanol puro al plato y esperar 30 min.
   5. Bajo el capó, retire cubreobjetos limpios a partir de etanol y añadir 1 cubreobjetos por pocillo de una placa de cultivo celular de 12 pocillos usando fórceps esterilizados.
   6. Lavado cubreobjetos dos veces con agua estéril (1 ml / pocillo). A continuación, lavar una vez con PBS estéril.
2. Recubrimiento de los cubreobjetos
   1. Retirar PBS y añadir 500 l / pocillo de 2x OLP (diluido en PBS). Incubar durante 4 horas a 37 ° C en la incubadora de CO _2.
   2. Eliminar la solución de la OLP y lavar 3 veces con PBS estéril.
   3. Retire PBS y añadir 500 l / pocillo de 20% IFB / 1 g / ml laminina. Incubar toda la noche a 37 ° C en la incubadora de CO _2.
3. Plating las células para inmunofluorescencia
   1. Retire medio de revestimiento de placas de 12 pocillos.
   2. Añadir 900,000 células / pocillo en 2 ml de volumen y hacer crecer las células a 37 ° C en la incubadora. Las células se pueden mantener en cultivo de hasta 15 días sin reemplazo medio.
4. La inmunotinción
   1. Retire medio de placas de 12 pocillos y lavar con 500 l / pocillo DMEM precalentado a 37 ° C.
   2. Añadir 500 l / pocillo de DMEM precalentado a 37 ° C, a continuación, añadir con cuidado 160 l / pocillo de 8% de paraformaldehído (PFA, concentración final del 2%) y se incuba durante 10 min a 37 ° C.
   3. Eliminar PFA y lavar 3 veces con PBS / 0,1 M de glicina durante 10 min.
   4. Retirar PBS, añadir 300 l / pocillo de PBS / 0,05% de Triton X-100/20% de suero de cabra y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente.
   5. Retire medio, añadir 300 l / pocillo de anticuerpo primario diluido en PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de suero de cabra y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios que se pueden utilizar para la detección de las neuronas dopaminérgicas y caracterización de la cultura se indican en la Tabla de Materiales. Mantenga1 bien sin anticuerpo primario para evaluar para el fondo de los diferentes anticuerpos secundarios.
   6. Retire medio y lavar 3 veces con PBS / 0,2% de gelatina durante 10 minutos.
   7. Retire medio, añadir 300 l / pocillo de anticuerpo secundario diluido en PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de suero de cabra y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente, en la oscuridad. Secundaria anticuerpos utilizados se indican en la tabla de Materiales.
   8. Retire medio y lavar 3 veces con PBS / 0,2% de gelatina durante 10 minutos.
   9. Retire medio y lavar 3 veces con PBS.
   10. Montar los cubreobjetos en el lado diapositivas celda de vidrio en una gota de VectaShield. Mantenga las diapositivas a temperatura ambiente durante la noche para permitir que el montaje medio seco, y luego almacenarlas a 4 ° C.
   11. Adquirir imágenes utilizando un microscopio confocal o un microscopio de contraste de fase equipado para epifluorescencia. Imágenes representativas fueron adquiridas con un microscopio confocal Leica SP2 UV.

Resultados

Un diagrama de flujo que ilustra los pasos de cultivo mesencéfalo se muestra en la Figura 1. Brevemente, después de la recolección de embriones E13.5 de un ratón suizo embarazada, mesencéfalo ventral se diseca de todo el embrión. Los fragmentos cerebrales aisladas se someten sucesivamente a la digestión enzimática y disociación mecánica. Las células disociadas se sedimentan por centrifugación, se resuspendieron en medio de cultivo y se sembraron en placas de 12 o 24 pocillos pre-revestido. L...

Discusión

Este protocolo presenta los procedimientos y reactivos necesarios para preparar un cultivo primario de neuronas mesencefálicas desde el ratón embrionario y el procedimiento de inmunofluorescencia para detectar las neuronas dopaminérgicas. Los pasos críticos del procedimiento son la disección de los embriones y la disociación mecánica de los fragmentos del cerebro recogidos. Instrumentos de disección de alta calidad ayuda a dominar la técnica de disección. Neuronas DA constituyen una pequeña proporción de mes...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine	Lonza	BE12-604F
0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red	Life Technologies	25300-054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140122
L-glutamine, 200 mM Solution	Life Technologies	25030123
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma-Aldrich	D0547	Powder
Laminin - 1 mg/mL in Tris buffered NaCl	Sigma-Aldrich	L2020
Poly-L-Ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P3655
Insulin from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	I5523
apo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	T1147
Putrescine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P5780
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783
Sodium selenite	Sigma-Aldrich	S5261
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126	Stock solution 1M in water
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	Stock solution 2% (w/v) in water
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Paraformaldehyde 16% in water	Electron Microscopy Sciences	RT 15710-S
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	Merck Millipore	106329
D(+)-Glucose, Monohydrate	Merck Millipore	4074-2
Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur	Merck Millipore	109057
Sterile water - Aqua B. Braun	Braun
Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent	VWR	20821.321
Sterile Petri Dishes	VWR	82050-566
Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR.	VWR	612-2297
Counting chamber Malassez	VWR	631-0975
Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm	PALL Life science	4525
Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long	Fine Science Tools	14002-14	To open the abdominal wall
Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long	MORIA	4877A	To open the uterine wall
Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm	MORIA	2183	To manipulate embryos
Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades	MORIA	MC50	To take out the mesencephalon
Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long	MORIA	9987	To remove meninges
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates	BD Bioscience	356414
BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid	BD Bioscience	353043
SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º	MENZEL-GLÄSER	AG00008032E
Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø	MARIENFELD	117580
Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody	Chemicon Millipore	AB5622	1/200
Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2	Chemicon Millipore	MAB5406	1/400
Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt	Chemicon Millipore	MAB369	1/500
Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody			1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Goat Serum, New Zealand Origin	Life Technologies	16210-064
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-31556	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-11001	1/1000
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-11007	1/1000
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400
Stereomicroscope	Carl Zeiss microscopy	Stemi-2000C
Bunsen Burner FIREBOY	VWR	451-0136