Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Abstract

נוירונים דופאמין מהווים פחות מ -1% מהמספר הכולל של תאי עצב במוח. סכום זה נמוך של תאי עצב מווסת את תפקודי מוח חשובים כגון שליטה מוטורית, מוטיבציה, וזיכרון עבודה. נוירונים דופאמין Nigrostriatal להידרדר באופן סלקטיבי במחלת פרקינסון (PD). איבוד עצבי מתקדם זה קשור באופן חד משמעי עם הסימפטומים מנועים של פתולוגיה (bradykinesia, רעד במנוחה, נוקשות שרירים ו). הסוכן העיקרי האחראי לניוון תא עצב דופאמין הוא עדיין לא ידוע. עם זאת, נוירונים אלה מופיעים להיות מאוד פגיעים בתנאים מגוונים. תרבויות עיקריות מהוות אחד המודלים הרלוונטיים ביותר לחקור תכונות ומאפיינים של נוירונים דופאמין. ניתן להגיש תרבויות אלה לסוכני מתח שונים המחקים פתולוגיה PD ותרכובות הגנה עצביות על מנת לעצור או להאט את הניוון עצבי. מודלים רבים מהונדסים העכבר של PD כי כבר generated בעשור האחרון גדל עוד יותר את האינטרס של חוקרים לתרבויות נוירון דופאמין. הנה, פרוטוקול הווידאו מתמקד בנתיחה העדינה של מוח עכבר העוברי. כריתה מדויקת של mesencephalon הגחון היא חיונית כדי להשיג תרבויות עצביות מספיק עשירות בתאי דופאמין כדי לאפשר מחקרים עוקבים. פרוטוקול זה יכול להתממש עם עכברים הטרנסגניים עובריים ומתאים לצביעת immunofluorescence, PCR כמותי, כימות שליח שני, או הערכת מוות / הישרדות עצבית.

Introduction

דופמין, אחד מהמוליכים העצביים במוח החיוני 1,2, בעיקר שפורסם על ידי דופאמין המוח התיכון הנוירונים (DA). רוב הנוירונים DA מתגוררים בחלק הגחוני של mesencephalon 2-6. סכמטי, ניתן לחלק את תאי עצב DA המוח התיכון בשלוש מבחינה אנטומית ותפקודי של מערכות שונות הקרנה: mesostriatal, mesolimbic, ומסלולי mesocortical 2,5. מסלול nigrostriatal מעורב במנוע התנהגות, מסלולי mesolimbic לשחק תפקיד חשוב בחיזוק, מוטיבציה, ולמידה, ואילו מסלולי דופאמין מקרינים לקליפת מוח הקדם חזיתית הם מעורבים בקוגניציה 2.

נוירונים DA מעורבים בכמה הפרעות נוירולוגיות אדם כמו סכיזופרניה, קשב וריכוז, הפרעת פעילות יתר, והמחלה (PD) פרקינסון 2,4. PD מתאפיין בניוון מתקדם וסלקטיבי של תאי עצב DA חיבור nigra substantiacompacta Pars (SNC) לסטריאטום. הפסד של תוצאות נוירונים DA Nigro-striatal בדלדול הדופמין החמור בסטריאטום, כי הוא אחראי לתסמינים המוטוריים של מחלת הפרקינסון (bradykinesia, רעד במנוחה, נוקשות) 7. הגורם הראשוני לPD אידיופטית לא הוקם והטיפולים הנוכחיים הם רק סימפטום, במטרה להחזיר את רמת הדופמין בסטריאטום. התרופה המומלצת ביותר היא L-דופא (Levodopa), המבשר הטבעי של דופמין. למרות שהממשל של Levodopa מפצה על האובדן של דופאמין למשך פרק זמן מסוים, סיבוכים מוטוריים להתרחש לאחר טיפולים ארוכי טווח (dyskinesia והפעלה / כיבוי מדינות) 8,9.

מחקר על נוירונים דופאמין ופ"ד הוא בהתקדמות מתמדת ומאמצים אינטנסיביים נעשים כדי לפתח טיפולים הבוסס על השתלת תאים, ריפוי גנטי, או סוכני הגנה עצביים 10,11. עם זאת, נושא מרכזי נשאר לא הובהר: מה הוא הגורם של vulnerab הקיצוניility של נוירונים DA? ניתן למצוא חלק מהתשובה בפעילות של תאי עצב DA. נראית ירידה בפעילות החשמלית ושל הרגישות של תאי עצב DA כדי להגדיל את נטייתם להידרדר 12. אף על פי כן, את המורכבות של הפתוגנזה פ"ד דורשים מחקרים נוספים על מנת לזהות את המנגנונים מעורבים בDA נוירונים ניוון 13-15.

תרבויות עיקריות רלוונטיות במיוחד ללמוד תכונות תא עצב DA 16-19 ולקרוא תיגר על הנוירונים האלה ללחצים שונים להערכה של סוכני הגנה עצביים 20-24. מודלים תרבות עכברוש משמשים בתדירות הגבוהה ביותר, כפי שהנתיחה של mesencephalon עובר עכברוש היא קלה יותר, בהשוואה לעכבר, וניתן לקבל כמויות גדולות יותר של תאי עצב בחולדות. עם זאת, דור של דגמי עכבר מהונדסים של המחלה 25 יש מידה ניכרת הגדיל את האינטרס של קהילת מדען המוח לתרבויות עיקריות מהעכבר 26-29. למרות שתרבויות יחסי ציבורepared מבעלי חיים שזה עתה נולדו יכול לשמש, עדיף להכין אותם מעוברים בשלב שלאחר mitotic (E13.5 לנוירונים mesencephalon), כאשר נוירונים שמרו היכולת שלהם להבחין. הפרוטוקול הבא מציג נוירונים mesencephalon מבודדים בתרבות העיקרית מעוברי עכברים (E13.5), שהם קשים ביותר להכנה. יש לציין, אנו מספקים פרוטוקול באמצעות מדיום סרום ללא תרבות לשחזור טוב יותר. שני השלבים הקריטיים ביותר בהכנת התרבות (לנתיחה וניתוק מכאני) שיפורטו בזהירות בווידאו קשור.

Protocol

העכברים המשמשים בעבודה זו טופלו ויטופלו בהתאם להנחיות של מועצת האיחוד האירופית (86/609 / איחוד אירופי) לשימוש בחיות מעבדה.

.1 הכנת פתרונות הנדרשים

  1. פתרונות מניות
    1. פתרון 10x פולי-L-ornithine (אש"ף): לשקול את 10 מ"ג hydrobromide אש"ף (משקל מולקולרי = 30,000-70,000) ולפזר ב70 מ"ל של מים סטריליים. סנן את הפתרון באמצעות 0.2 מיקרומטר מסנן מזרק, aliquot, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
    2. 30% פתרון גלוקוז: לשקול את 30 גרם של D (+) - גלוקוז ולהתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ"ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C..
    3. בינוני של 5x השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) / תערובת מזין F-12 חם: לשקול את 6 גרם של אבקת DMEM / F-12 חם ומתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ"ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C..
    4. 7.5% סודיום ביקרבונט (NaHCO 3) Solutiב: לשקול את 7.5 גרם של NaHCO 3 ולהתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ"ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C..
    5. 1 M HEPES פתרון: לשקול את 23.8 גרם של HEPES ולהתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ"ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C..
    6. אתנול 70% (v / v): לדלל 70 מ"ל של אתנול מוחלט עם 30 מ"ל של מים סטריליים.
  2. בופר פוספט עם גלוקוז ואנטיביוטיקה (PBS-GAB): להוסיף 10 מ"ל של 30% פתרון גלוקוז ו5 מ"ל של תמיסת פניצילין, סטרפטומיצין 500 מ"ל של בופר פוספט של Dulbecco. חנות ב 4 ° C..
  3. מומת בסרום שור עוברי (iFBS): להפשיר בסרום שור הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס ולהשבית ב56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. Aliquot לתוך 50 מ"ל ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
  4. תרבות בינונית: במים סטריליים, לערבב ברציפות 40 מ"ל של 5x DMEM / F12-שינקין, 1 מ"ל של 1 M HEPES, 2 מ"ל של 200 מ"מ L-גלוטמין, 2 מ"ל של פניצילין, סטרפטומיצין, 4 מ"ל של 30% גלוקוזnd 3 מ"ל של .7.5% NaHCO 3 עד נפח סופי של 180 מ"ל. לסנן ולהשתמש באותו היום.
  5. ההורמון Mix
    1. הכן 180 מ"ל של מדיום התרבות. לפזר 200 מ"ג של apo-transferrin במדיום זה.
    2. לשקול את 50 מ"ג של אינסולין ולהתמוסס ב2 מ"ל של 0.1 M HCl. לאט להוסיף 8 מ"ל של מים סטריליים תוך ערבוב בעדינות. לדלל את הפתרון הזה במדיום התרבות.
    3. לשקול את 19.3 מ"ג של Putrescine dihydrochloride ולהתמוסס ב10 מ"ל של מים סטריליים. מוסיף את הפתרון 10 מ"ל לתערובת ההורמון.
    4. הכן פתרון 3 מ"מ selenite נתרן במים סטריליים ופתרון פרוגסטרון 2 מ"מ באתנול מוחלט. הוסף 20 μl של כל פתרון לתערובת ההורמון.
    5. סנן את תערובת ההורמון, aliquot לתוך 10 מ"ל ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.

2 הכנת פלטות תרבות ומכשירים

  1. FBS ציפוי של צלחות התרבות: היום לפני הנתיחה, להכין 180 מ"ל של מדיום התרבות. הוסף 10 מ"ל שלiFBS 90 מ"ל של מדיום התרבות. הוסף 300 μl / גם של מדיום התרבות / 10 iFBS% ל24 גם צלחות Precoated פולי-D-ליזין. דגירה הלילה בשעה 37 C °. אחסן את המדיה שנותרה (עם ובלי iFBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס.
  2. לעקר את המכשירים וטפטפות פסטר. אסוף את הציוד מפורט בטבלת חומרים, כמו גם זרימה למינרית Class II וCO 2 באינקובטור.

.3 Dissection של העכבר mesencephalon

  1. להקריב את העכבר בהריון E13.5 (על פי הנחיות מוסדיות). נקה את הבטן של העכבר עם 70% אתנול ולפתוח את קיר הבטן. לאסוף את קרן הרחם, לפתוח אותם באמצעות מספריים עדינים, לנתח כל עובר מקרני הרחם, ולהסיר את הקרומים מי השפיר. מניחים את העוברים בצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה PBS-GAB סטרילי ולשטוף אותם על ידי העברה ב3 אמבטיות זהות רצופות באמצעות מלקחיים. לנתיחה, למקם את העוברים על ידי 3 בצלחת פטרי סטרילית 60 מ"מ.
  2. Movדואר צלחת פטרי הסופי תחת סטראו. אל לערוף את העוברים. בעזרת המספריים Vannas, תחתוך את המוח.
    1. מוציא בזהירות ולבטל את האזורים הקדמיים והמוח אחוריים. לצד מקורי, לחתוך קרוב לאזור התלמוס, לצד קיצוץ הזנב באזור המצר, להסיר את colliculus מעולה.
    2. ברגע שמוח תיכון הגחון מבודד, להסיר בזהירות קרומי המוח באמצעות מלקחיים יפים במיוחד. לאסוף קטעים גזורים, ללא קרומי המוח, בצינור 13 מ"ל סטרילי המלא PBS-GAB.
  3. נקה את הצינור המכיל mesencephala ביסודיות עם אתנול 70% ולהביא אותו מתחת למכסת המנוע.

דיסוציאציה .4 הסלולרי

  1. לשטוף mesencephala 3x עם PBS-GAB סטרילי. לאפשר שברי המוח ליישב בין כל שטיפה ולהימנע מלשבש את הרקמה. לאחר לשטוף האחרון, להסיר בזהירות רב כפתרון שאפשר לדגור מגזרי מוח ב 3 מ"ל של טריפסין / EDTA ל15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור.
  2. אש פולנית טפטפות פסטר על מנת למקסם את ההישרדות של תאי העצב כמו הסוף של pipet זכוכית שאינה מלוטשת היא חד ויכולה לגרום נזק לתאים במהלך שלבי הניתוק. מעט להפחית את קוטר הגפיים (עד 0.5 מ"מ) של פיפטה פסטר תוך אש וליטוש לזה.
  3. מוציא בזהירות כמה שפתרון / EDTA טריפסין ככל האפשר ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום התרבות / 10 iFBS%. מגזרי המוח לשטוף 3x עם iFBS מדיום התרבות / 10%.
  4. באמצעות פיפטה פסטר האש מלוטשת, מתחיל ניתוק של mesencephala ב6 מ"ל של מדיום התרבות / 10 iFBS%. Triturate 10x (למנוע בועות אוויר), לאפשר לנתחים להתיישב, ואז לאסוף את המדיום בצינור מ"ל 13 סטרילי חדש.
  5. להוסיף 6 מ"ל של מדיום התרבות, חזור על השלב הקודם פעם אחת ולאסוף את המדיום המכיל תאים ניתקו באותו הצינור 13 מ"ל.
  6. תאי צנטריפוגה ב160 גרם במשך 5 דקות. בטל supernatant ו resuspend התאים במדיום התרבות בתוספת10% תמהיל הורמון.

.5 נייד ציפוי

  1. ספירת תאים בתרחיף בתא Malassez ולהתאים את עוצמת הקול של מדיום לריכוז של 600,000 תאים / מ"ל. ניתן להשיג בסביבות 1,700,000 תאים מmesencephalon עכבר אחד.
  2. הסר FBS המכיל מדיום ציפוי מ24 גם צלחות ולהוסיף בכל טוב 1 מ"ל של השעיה תא (600,000 תאים / היטב, 2-4% מTH + תאים).
  3. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2/95% אוויר. אין שינוי מדיום הוא הכרחי. נוירונים דופאמין בשלים לאחר סביב 5-7 ימים במבחנה (ביטוי עקבי של טרנספורטר דופאמין). שמור את התאים בתרבית עד 15 ימים ללא החלפה בינונית.

פרוטוקול .6 Immunofluorescence

  1. ניקוי של Coverslips
    1. היום לפני הנתיחה, להוסיף 10 מ"ל של 1 M HCl לתוך צלחת פטרי. הנח על פני השטח של coverslips הזכוכית הנוזלי 12-15 ולחכות 15 דקות.
    2. לשקוע הכיסוילהחליק לתוך הנוזל והמתן 15 דקות.
    3. הסר HCl ולשטוף 3x עם מים.
    4. שטוף את coverslips במהירות עם אתנול טהור פעם אחת, ולאחר מכן להוסיף אתנול טהור למאכל ולחכות 30 דקות.
    5. מתחת למכסה המנוע, להסיר coverslips ניקה מאתנול ולהוסיף coverslip 1 לכל טוב של צלחת תרבית תאי 12 גם באמצעות מלקחיים מעוקרים.
    6. לשטוף coverslips פעמיים עם מים סטריליים (1 מ"ל / טוב). לאחר מכן, לשטוף אותם פעם עם PBS סטרילי.
  2. ציפוי של Coverslips
    1. הסר PBS ולהוסיף 500 μl / גם של 2x אש"ף (בדילול מלא PBS). דגירה של 4 שעות ב 37 ° C בחממת CO 2.
    2. הסר את פתרון אש"ף ולשטוף 3x עם PBS סטרילי.
    3. הסר PBS ולהוסיף 500 μl / גם של 20 iFBS% / 1 גר '/ מ"ל ​​Laminin. דגירה הלילה בשעה 37 ° C בחממת CO 2.
  3. ציפוי התאים לImmunofluorescence
    1. הסר בינוני ציפוי מ12 גם צלחות.
    2. הוספת 900,000 תאים / היטב ב2 מ"ל נפח ולגדל את התאים על 37 מעלות צלזיוס בחממה. יכולים להיות כל הזמן תאים בתרבית עד 15 ימים ללא החלפה בינונית.
  4. Immunostaining
    1. הסר בינוני מ12 גם צלחות ולשטוף עם 500 μl / גם DMEM שחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס.
    2. הוסף 500 μl / גם של DMEM שחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף paraformaldehyde עדינות 160 μl / גם של 8% (PFA, 2% ריכוז סופי) ודגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
    3. הסר PFA ולשטוף 3x עם PBS / 0.1 M גליצין עבור 10 דקות.
    4. הסר PBS, להוסיף / טוב של PBS / 0.05% טריטון X-100/20% בסרום עיזים 300 μl ודגירת 30 דקות בטמפרטורת חדר.
    5. הסר בינוני, להוסיף טריטון X-100/1% בסרום עיזים 300 μl / גם של נוגדן הראשוני מדולל PBS / 0.05% ודגירה של 2 שעות בטמפרטורת חדר. נוגדנים עיקריים שיכול לשמש לזיהוי של נוירונים דופאמין ואפיון של התרבות מצוינים בטבלת חומרים. שמור1 גם בלי נוגדן ראשוני על מנת להעריך לרקע של הנוגדנים משני השונים.
    6. הסר בינוני ולשטוף 3x עם PBS / 0.2% ג'לטין עבור 10 דקות.
    7. הסר בינוני, להוסיף טריטון X-100/1% בסרום עיזים 300 μl / גם של נוגדנים משני בדילול המלא PBS / 0.05% ודגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, בחושך. נוגדנים משני המשמשים מצוינים בטבלת חומרים.
    8. הסר בינוני ולשטוף 3x עם PBS / 0.2% ג'לטין עבור 10 דקות.
    9. הסר בינוני ולשטוף 3x עם PBS.
    10. הר coverslips בצד תא שקופיות זכוכית למטה בירידה של Vectashield. שמור את השקופיות בלילה טמפרטורת חדר כדי לתת לי בינונית יבש ההרכבה, לאחר מכן לאחסן אותם ב 4 ° C..
    11. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal או מיקרוסקופ שלב בניגוד מצויד לepifluorescence. נציג תמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ confocal לייקה SP2 UV.

תוצאות

תרשים זרימה מאוירת של צעדי תרבות mesencephalon מוצג באיור 1. בקצרה, לאחר איסוף עוברי E13.5 מעכבר שוויצרי בהריון, mesencephalon הגחון הוא גזור מכל העובר. שברי המוח המבודדים הם ברציפות שהוגשו לעיכול אנזימטי וניתוק מכאני. תאים ניתקים הם pelleted על ידי צנטריפוגה, resuspended במדיום התרב...

Discussion

פרוטוקול זה מציג את הנהלים וחומרים כימיים הדרושים כדי להכין את התרבות העיקרית של נוירונים mesencephalic מהעכבר העוברי והליך immunofluorescence לזהות נוירונים דופאמין. שלבים קריטיים של ההליך הם לנתיחה של העוברים והניתוק המכני של שברי המוח שנאספו. מכשירים לנתיחה באיכות גבוהים מסיי?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Fetal Bovine SerumLonza14-801F
DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamineLonzaBE12-604F
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol redLife Technologies25300-054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)Life Technologies15140122
L-Glutamine, 200 mM solutionLife Technologies25030123
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineSigma-Aldrich D8537
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 HamSigma-Aldrich D0547Powder
Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaClSigma-Aldrich L2020
Poly-L-Ornithine hydrobromideSigma-Aldrich P3655
Insulin from porcine pancreasSigma-Aldrich I5523
apo-Transferrin humanSigma-Aldrich T1147
Putrescine dihydrochlorideSigma-Aldrich P5780
ProgesteroneSigma-Aldrich P8783
Sodium seleniteSigma-Aldrich S5261
HEPESSigma-Aldrich H4034 
GlycineSigma-Aldrich G7126Stock solution 1 M in water
GelatinSigma-Aldrich G9391Stock solution 2% (w/v) in water
Triton X-100Sigma-Aldrich T8532
Paraformaldehyde 16% in waterElectron Microscopy SciencesRT 15710-S
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Merck Millipore106329
D(+)-Glucose, MonohydrateMerck Millipore4074-2
Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) TitripurMerck Millipore109057
Sterile water - Aqua B. BraunBraun
Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagentVWR20821.321
Sterile Petri dishesVWR82050-566
Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR.VWR612-2297
Counting chamber MalassezVWR631-0975
Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mmPALL Life science4525
Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm longFine Science Tools14002-14To open the abdominal wall
Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm longMORIA4877ATo open the uterine wall
Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mmMORIA2183To manipulate embryos
Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm bladesMORIAMC50To take out the mesencephalon
Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm longMORIA9987To remove meninges
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell PlatesBD Bioscience356414
BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lidBD Bioscience353043
SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90ºMENZEL-GLÄSERAG00008032E
Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm ØMARIENFELD117580
Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) AntibodyChemicon MilliporeAB56221/200
Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2Chemicon MilliporeMAB54061/400
Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt Chemicon MilliporeMAB3691/500
Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Goat Serum, New Zealand OriginLife Technologies16210-064
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AntibodyLife TechnologiesA-315561/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife TechnologiesA-110011/1,000
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) AntibodyLife TechnologiesA-110071/1,000
VECTASHIELD HardSet Mounting MediumVector LaboratoriesH-1400
StereomicroscopeCarl Zeiss microscopyStemi-2000C
Bunsen Burner FIREBOYVWR451-0136

References

  1. Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
  2. Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
  3. Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
  4. Chinta, S. J., Andersen, J. K. Dopaminergic neurons. Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).
  5. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  6. Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
  7. Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. Parkinson's disease. Lancet. 363, 1783-1793 (2004).
  8. Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
  9. Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
  10. Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
  11. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
  12. Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
  13. Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
  14. Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. e. r. k. e. r. i. a. n. -. Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
  15. Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. Pathogenesis of Parkinson's disease. Mov Disord. 28, 24-30 (2013).
  16. di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
  17. Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
  18. Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
  19. Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
  20. Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
  21. Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
  22. Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
  23. Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
  24. Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
  25. Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
  26. Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
  27. Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
  28. Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
  29. Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
  30. Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
  31. Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
  32. Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
  33. Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
  34. Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
  35. Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
  36. Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

91Musculus MusMesencephalonhydroxylase

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved