마우스 도파민 뉴런의 차 문화

요약

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

초록

도파민 뉴런은 뇌 신경 세포의 총 수의 1 % 미만을 나타낸다. 신경이 적은 양의은 모터 제어, 동기 부여, 및 작업 메모리 중요 뇌 기능을 조절한다. 흑질 선조체 도파민 뉴런 선택적 파킨슨 병 (PD)에 퇴화. 이 진보적 인 신경 세포의 손실은 명백하게 병리의 모터 증상 (운동 완만, 휴식 진전, 근육 강도)와 연결되어 있습니다. 도파민 신경 세포의 변성을 담당하는 주요 에이전트는 아직 알 수 없습니다. 그러나 이러한 신경 세포는 다양한 조건에서 매우 취약한 것으로 나타납니다. 차 문화는 속성과 도파민 신경 세포의 특성을 조사하기 위해 가장 중요한 모델 중 하나를 구성한다. 이러한 문화는 중지하거나 신경 세포의 변성을 느리게하기 위해 PD 병리를 모방 다양한 스트레스 에이전트 및 신경 보호 화합물을 제공 할 수 있습니다. GENER왔다 PD의 수많은 형질 전환 마우스 모델지난 10 년간 나타나는데 더 도파민 신경 세포 배양에 대한 연구자들의 관심이 증가했다. 여기서, 비디오 프로토콜은 배아 마우스 뇌의 섬세한 절개에 초점을 맞추고있다. 복부 중뇌의 정확한 절제 후속 연구를 할 수 있도록 도파민 세포에서 충분히 풍부한 신경의 문화를 얻기 위해 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 배아 형질 전환 마우스 실현 면역 형광 염색, 정량 PCR, 둘째 메신저 정량화, 또는 신경 세포의 죽음 / 생존 평가에 적합하다 할 수 있습니다.

서문

도파민, 필수적인 뇌의 신경 전달 물질 ^1,2 중 하나는, 주로 중뇌 도파민 (DA) 신경 세포에 의해 방출된다. DA 신경 세포의 대부분은 중뇌 ^2-6의 복부 부분에 상주. mesostriatal, mesolimbic 및 mesocortical 경로 ^2,5 : 도식적으로, 중뇌 DA 뉴런은 해부학 적 및 기능적으로 세에서 별개의 프로젝션 시스템을 나눌 수 있습니다. 전두엽 피질에 투사 도파민 경로는 ^인식이 연루되는 반면, 흑질 선조체 경로는 mesolimbic 경로 보강, 동기 부여, 학습에 중요한 역할을, 모터 동작에 참여하고있다.

DA 뉴런은 정신 분열증, 주의력 결핍, 하이퍼 활동 장애, 파킨슨 병 (PD) ^2,4 등 여러 가지 인간의 신경 질환에 참여하고 있습니다. PD는 흑질 접속 DA 신경 세포의 진행성 및 퇴행성 선택적 특징선조체에 갈 거예요의 compacta (SNC). PD의 운동 증상의 책임이있는 선조체 (striatum)에서 심각한 도파민 고갈에 nigro - 선조체 DA 뉴런 결과의 손실 (운동 완만, 휴식 진동, 강성) ^7. 특발성 PD의 초기 원인은 확립되지 않았으며, 현재 치료 선조체 도파민 수준을 복원하는 목표 만 증상이다. 대부분의 처방 약은 L-도파 (레보도파), 도파민의 자연 전구 물질이다. 레보도파의 투여가 일정 시간 동안 도파민 손실을 보상하지만, 모터 후 합병증 (운동 이상증의 온 / 오프 상태) 장기간 치료 ^8,9 일어난다.

도파민 뉴런과 PD에 대한 연구가 진행되어 일정 강렬한 노력은 세포 이식, 유전자 치료, 또는 신경 보호제 ^10,11에 기반 치료법을 개발하기 위해 이루어지고있다. 단, 중요한 문제가 아닌 해명 남아 극단적 vulnerab의 원인이 무엇DA 뉴런의 ility? 답변의 일부는 DA 신경의 활성에서 찾을 수있다. 전기적 활동 및 DA 신경 세포의 흥분성의 감소는 ^{12 퇴화하는} 그들의 성향을 확대 할 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, PD의 병인의 복잡성 DA에 관여하는 메커니즘 신경 세포가 ^{13 ~ 15} 변성을 식별하기 위해 추가 연구가 필요합니다.

차 문화는 DA 신경 세포의 특성 ^{16 ~ 19을} 공부하고 신경 보호제 ^20-24의 평가를 위해 다양한 스트레스에 이러한 뉴런에 도전 특히 적합하다. 쥐 배양 모델은 대부분 쥐 배아 중뇌의 박리가 용이​​ 한, 마우스와 비교하고, 뉴런의 더 많은 양이 쥐에서 얻을 수있다 사용된다. 그러나, 병 ^(25)의 형질 전환 마우스 모델의 생성은 마우스에서 ^26-29 차 배양 용 신경학 커뮤니티의 관심을 상당히 증가하고있다. 홍보 문화 있지만신생아 동물로부터 epared은 뉴런 분화하는 능력을 유지 한 경우, 포스트 - 유사 분열 단계 (중뇌 신경 용 E13.5)에서 배아을 준비하는 것이 좋다, 사용될 수있다. 다음 프로토콜은 준비하기가 가장 어려운 마우스 배아 (E13.5)에서 차 문화에 고립 된 중뇌의 신경 세포를 제공합니다. 특히, 우리는 더 나은 재현성 위해 무 혈청 배지를 사용하는 프로토콜을 제공한다. 배양 제제 (해부 및 기계적 해리)에 두 개의 가장 중요한 단계는 신중 연관된 비디오에 설명 될 것이다.

프로토콜

이 작품에 사용 된 마우스는 보살핌과 유럽 연합위원회의 가이드 라인을 실험 동물의 사용에 대한 (609분의 86 / EU)에 따라 처리 하였다.

필요 솔루션의 1 준비

1. 주식 솔루션
   1. 10 배 폴리-L 오르니 틴 (PLO) 해결책 : PLO 브롬화 수소 산염 10 ㎎을 무게 (분자량 = 30,000-70,000) 및 멸균 물 70 ㎖에 녹인다. -20 ° C에서 0.2 μm의 주사기 필터, 나누어지는 솔루션을 사용하고, 가게를 필터링합니다.
   2. 30 % 포도당 해결책 : 30 D (+)의 g을 달아 - 포도당을 100 ml의 총 부피에 멸균 물에 용해. 4 ° C에서 필터, 나누어지는 및 저장.
   3. 5X 둘 베코 변형 이글 배지에 (DMEM) / 영양 혼합물 햄 F-12 : DMEM / 햄 F-12 분말 6g를 달아, 100 ml의 총 부피를 멸균 수에 용해. 4 ° C에서 필터, 나누어지는 및 저장.
   4. 7.5 % 중탄산 나트륨 _(탄산 수소 나트륨) Soluti에 : _탄산 수소 나트륨 7.5 g을 계량하고 100 ㎖의 총 부피로 멸균 수에 용해. 4 ° C에서 필터, 나누어지는 및 저장.
   5. 1 M HEPES 용액 : HEPES 23.8 g을 달아 100 ml의 총 부피를 멸균 수에 용해. 4 ° C에서 필터, 나누어지는 및 저장.
   6. 70 % (v / v) 에탄올 : 멸균 수 30 ㎖의 무수 에탄올 70 ㎖에 희석.
2. 포도당과 항생제 (PBS-GAB)와 인산염 완충 생리 식염수 : 10 30 % 포도당의 수용액 및 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 500 mL에 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액 5 ㎖를 추가합니다. 4 ℃에서 보관하십시오.
3. 비활성화 된 소 태아 혈청 (IFBS가) : 4 ° C에서 하룻밤 소 혈청을 해동 30 분 동안 56 ° C에서 비활성화. -20 ° C에서 50 ML로 나누어지는 및 저장.
4. 문화 미디엄 : 멸균에서 5 배 DMEM / F12 햄의 연속 40 ML, 1 1 M HEPES ml의 2 ML 200 mm의 L-글루타민, 페니실린 - 스트렙토 마이신 (streptomycin) 2 ㎖, 4 ㎖의 30 %의 포도당을 혼합ND 180 ml의 최종 부피로 7.5 _%의 NaHCO3 3 ㎖. 필터 및 당일 사용.
5. 호르몬 믹스
   1. 문화 매체의 180 ML를 준비합니다. 이 매체에 아포 트랜스페린의 200 mg을 녹인다.
   2. 인슐린을 50mg 칭량하고, 0.1 M 염산 2 ㎖에 녹이고. 부드럽게 혼합하면서 멸균 물을 천천히 8 ML을 추가합니다. 배지에서이 솔루션을 희석.
   3. 퓨 트레 염산염 19.3 mg의 밖으로 달아 멸균 수 10ml에 용해. 호르몬 믹스로 10 ml의 솔루션을 추가합니다.
   4. 멸균 수에 3 mM의 아 셀렌 산 나트륨 용액 및 무수 에탄올에 2 mM의 프로게스테론 솔루션을 준비합니다. 호르몬 믹스 각 솔루션의 20 μl를 추가합니다.
   5. -20 ° C에서 호르몬 믹스, 나누어지는 10 ML에 저장을 필터링합니다.

문화 접시와 인스트루먼트의 2 준비

1. 문화 판의 FBS 코팅 : 해부 전에 날, 배지 180 ㎖의 준비를합니다. 10 ML을 추가배지 90 mL에 IFBS. 추가 300 μL / 웰의 배지 / 폴리-D-라이신 - 예비 코팅 된 24 웰 플레이트에 10 % IFBS. 37 ° C에서 밤새 품어. 4 ° C에서 (로와 IFBS없이) 남은 용지를 보관하십시오.
2. 악기와 파스퇴르 피펫을 소독. 클래스 II 층류 후드 및 CO ₂ 배양기뿐만 아니라 재료 표에 나열된 장비를 수집합니다.

마우스 중뇌의 3 해부

1. (제도적 지침에 따라) E13.5 임신 마우스를 희생. 70 % 에탄올로 마우스의 복부를 청소하고 복부 벽을 엽니 다. 섬세 가위를 사용하여 열, 자궁 뿔을 수집 자궁 뿔에서 각 배아를 해부하고, 양막을 제거합니다. 멸균 PBS-GAB를 포함하는 100mm 배양 접시에있는 배아를 놓고 집게를 사용하여 3 연속 동일 화장실에서 송금을 씻는다. 해부를 들어, 60mm 멸균 페트리 접시에 세에 의해 배아를 놓습니다.
2. mov 인실체 현미경을 이용하여 최종 페트리 접시를 전자. 배아를 참수하지 마십시오. Vannas 가위를 사용하여 뇌를 절제.
   1. 조심스럽게 제거하고 fore-와 후뇌 지역을 폐기합니다. 주동이의 측면으로, 지협 지역에서 꼬리 쪽 인하, 시상 지역에 가까운 잘라 우수한 둔덕을 제거합니다.
   2. 복부 중뇌가 분리되면, 신중 초 미세 집게를 사용하여 수막을 제거합니다. PBS-GAB 가득 멸균 13 ML 튜브에, 수막없이 해부 세그먼트를 수집합니다.
3. 70 % 에탄올로 철저하게 mesencephala를 포함하는 튜브를 청소하고 후드를 가져옵니다.

4 셀 해리

1. 세척은 멸균 PBS-GAB로 3 배 mesencephala. 뇌 조각이 각 세척 사이에 정착 조직을 방해하지 않도록 할 수 있습니다. 마지막 세척 후, 37 ° C에서 15 분 동안 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 3 ㎖에 뇌 세그먼트를 가능한 한 신중하게 많은 솔루션을 제거하고 배양_이 창업 보육 센터 CO.
2. 불 닦으 파스퇴르 피펫은 비 - 연마 된 유리 피펫의 끝과 같은 뉴런의 생존을 최대화하고 날카로운 해리 단계에서 세포에 손상을 줄 수있다. 그것을 불을 연마하는 동안 약간 선단 직경 파스퇴르 피펫 (0.5 mm)을 줄일 수 있습니다.
3. 조심스럽게 최대한 트립신 / EDTA 용액을 제거하고 배지 10 ml의 / 10 %를 추가 IFBS. 워시 뇌 세그먼트는 배양 배지 / 10 % IFBS와 배.
4. 불 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여, 배양 배지 / 10 % IFBS의 6 ㎖에 mesencephala의 분해를 시작합니다. 씹다 배 후 새로운 무균 13 ㎖의 튜브에서 매체를 수집 청크 정착 할 수 있도록, (기포를 방지).
5. , 배지 6 ㎖에 추가하면 이전 단계를 반복하고 13 ㎖의 동일 관에 해리 된 세포를 포함하는 배지를 수집한다.
6. 5 분 동안 160g에서 원심 분리기 세포. 뜨는을 취소하고 보충 된 배지에서 세포를 재현 탁10 % 호르몬 믹스.

5 셀 도금

1. Malassez 세포에 세포 현탁액을 카운트하고 600,000 세포 / ml의 농도로 매체의 볼륨을 조정한다. 약 1,700,000 세포는 하나의 마우스 중뇌에서 얻을 수 있습니다.
2. 24 웰 플레이트에서 코팅 매체를 FBS 함유를 제거하고 각 웰에 세포 현탁액 1 ㎖에 추가 할 (600,000 세포 / 웰, TH + 세포 2-4 %).
3. 37 ° C에서 접시를 품어 5 % CO _{95분의 2} % 대기. 어떤 매체 변화는 필요하지 않습니다. 도파민 신경 세포는 체외에서 약 5-7일 (도파민 수송의 일관성있는 표현) 후 성숙. 매체 교체없이 십오일에 문화까지 세포를 보관하십시오.

(6) 면역 형광 프로토콜

1. Coverslips는 청소
   1. 해부 전날, 페트리 접시에 1 M 염산 10 ㎖를 추가합니다. 액체 12-15 유리 커버 슬립의 표면에 올려 놓고 15 분을 기다립니다.
   2. 커버를 싱크액체로 미끄러 15 분 동안 기다립니다.
   3. 염산을 제거하고 물로 배를 씻는다.
   4. 한 번 순수 에탄올로 신속하게 된 커버를 세척 후 접시에 순수 에탄올을 추가하고 30 분 동안 기다립니다.
   5. 후드, 에탄올 세정 된 커버를 제거하고 멸균 집게를 사용하여 12 - 웰 세포 배양 접시에 한 웰당 커버 슬립을 추가한다.
   6. 세척 멸균 물 (1 ㎖ / 웰)로 두 번 된 커버. 그런 다음, 멸균 PBS로 한번 씻어.
2. Coverslips는의 코팅
   1. PBS를 제거하고 500 μL / 2 배 PLO의도 (PBS에 희석)를 추가합니다. CO ₂ 배양기에서 37 ° C에서 4 시간 동안 품어.
   2. PLO의 솔루션을 제거하고 멸균 PBS로 3 회 씻는다.
   3. PBS를 제거하고 500 μL / 웰의 20 % IFBS / 1g / ㎖ 라미닌을 추가합니다. CO ₂ 배양기에서 37 ° C에서 밤새 품어.
3. 면역 형광의 셀 도금
   1. 12 - 웰 플레이트에서 코팅 매체를 제거합니다.
   2. 900,0 추가00 세포 / 웰이 ml의 부피와 배양기에서 37 ° C에서 세포를 성장. 세포는 중간 교체없이 십오일에 문화까지 유지 될 수있다.
4. 면역 염색
   1. 12 - 웰 플레이트에서 매체를 제거하고 잘 DMEM이 37 ° C로 예열 / 500 ㎕를 씻어.
   2. / 잘 DMEM 500 ㎕를 37 ° C로 예열 추가, 부드럽게 160 μL / 웰 8 % 파라 포름 알데히드 (PFA, 2 % 최종 농도)를 추가하고 37 ° C에서 10 분 동안 배양한다.
   3. PFA를 제거하고 PBS로 3 배 세척 / 0.1 M 글리신을 10 분 동안.
   4. , PBS를 제거 300 μL / 웰의 PBS / 0.05 % 트리톤 X-100 / 20 % 염소 혈청을 추가하고, 실온에서 30 분 동안 배양한다.
   5. 매체를 제거 300 μL / 웰의 PBS에 희석 차 항체 / 0.05 % 트리톤 X-100 / 1 % 염소 혈청을 추가하고 실온에서 2 시간 동안 배양한다. 도파민 성 신경 세포 배양의 특성의 검출에 사용될 수있는 일차 항체 재료 표에 나타내었다. 유지일 잘 차 항체없이 다른 차 항체의 배경에 대해 평가합니다.
   6. 배지를 제거하고 PBS로 3 배 세척 / 0.2 % 젤라틴을 10 분 동안.
   7. 매체 분리 300 μL / 웰의 PBS에 희석 차 항체 / 0.05 % 트리톤 X-100 / 1 % 염소 혈청을 추가하고 어두운 곳에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 사용 된 차 항체는 재료 표에 표시됩니다.
   8. 배지를 제거하고 PBS로 3 배 세척 / 0.2 % 젤라틴을 10 분 동안.
   9. 매체 제거하고 PBS로 3 회 씻는다.
   10. 다운 VECTASHIELD의 드롭 유리 슬라이드 셀 측 커버 슬립을 장착. 다음 4 ℃에서 보관, 설치 매체 건조 수 있도록 실온에서 밤새 슬라이드를 유지합니다.
   11. 공 초점 현미경 표면 형광에 장착 된 위상차 현미경을 사용하여 이미지를 획득. 대표 이미지는 라이카 SP2 UV 공 초점 현미경으로 획득 하였다.

결과

중뇌 문화 단계의 그림 흐름도 그림 1에 나타나있다. 간단히, 임신 스위스 마우스에서 E13.5 배아를 수집 한 후, 복부 중뇌가 전체 배아 해부한다. 고립 된 뇌 조각이 연속적으로 소화 효소 및 기계적 분리에 제출됩니다. 해리 된 세포를 미리 코팅 된 12 - 또는 24 - 웰 플레이트에서 배양 배지에 재현 탁시키고, 도금, 원심 분리에 의해 펠렛 화한다. 세포는 중간 교체없이 십오일까지 유지?...

토론

이 프로토콜은 마우스 배아 도파민 성 신경 세포를 검출하는 면역 형광 절차에서 중간 뇌 신경 세포의 일차 배양을 준비하기 위해 필요한 절차 및 시약을 제공한다. 절차의 중요한 단계는 배아의 박리 및 회수 뇌 절편 기계적 해리이다. 고품질 해부 악기 해부 기술을 마스터하는 데 도움이됩니다. DA 뉴런 중뇌의 작은 부분을 구성한다. 따라서, 복부 중뇌의 오른쪽 부분을 수집하는 DA 뉴런 2-4 % 함?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine	Lonza	BE12-604F
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red	Life Technologies	25300-054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140122
L-Glutamine, 200 mM solution	Life Technologies	25030123
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma-Aldrich	D0547	Powder
Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl	Sigma-Aldrich	L2020
Poly-L-Ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P3655
Insulin from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	I5523
apo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	T1147
Putrescine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P5780
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783
Sodium selenite	Sigma-Aldrich	S5261
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126	Stock solution 1 M in water
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	Stock solution 2% (w/v) in water
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Paraformaldehyde 16% in water	Electron Microscopy Sciences	RT 15710-S
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck Millipore	106329
D(+)-Glucose, Monohydrate	Merck Millipore	4074-2
Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur	Merck Millipore	109057
Sterile water - Aqua B. Braun	Braun
Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent	VWR	20821.321
Sterile Petri dishes	VWR	82050-566
Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR.	VWR	612-2297
Counting chamber Malassez	VWR	631-0975
Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm	PALL Life science	4525
Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long	Fine Science Tools	14002-14	To open the abdominal wall
Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long	MORIA	4877A	To open the uterine wall
Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm	MORIA	2183	To manipulate embryos
Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades	MORIA	MC50	To take out the mesencephalon
Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long	MORIA	9987	To remove meninges
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates	BD Bioscience	356414
BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid	BD Bioscience	353043
SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º	MENZEL-GLÄSER	AG00008032E
Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø	MARIENFELD	117580
Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody	Chemicon Millipore	AB5622	1/200
Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2	Chemicon Millipore	MAB5406	1/400
Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt	Chemicon Millipore	MAB369	1/500
Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody			1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Goat Serum, New Zealand Origin	Life Technologies	16210-064
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-31556	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-11001	1/1,000
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-11007	1/1,000
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400
Stereomicroscope	Carl Zeiss microscopy	Stemi-2000C
Bunsen Burner FIREBOY	VWR	451-0136