A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
تحليل السريع للشذوذ الكروموسومات في الخلايا الليمفاوية B الماوس بواسطة PNA-FISH
In This Article
Erratum Notice
Summary
مسارات إصلاح الحمض النووي ضرورية لصيانة سلامة الجينوم ومنع الطفرات والسرطان. الهدف من هذا البروتوكول هو لقياس عدم الاستقرار الجيني عن طريق الملاحظة المباشرة للانحرافات في الكروموسومات الطورية ينتشر من خلايا B الماوس باستخدام الفلورسنت الموقع التهجين (FISH) ليكرر DNA الكروموسومات في.
Abstract
إصلاح خلل الحمض النووي يؤدي إلى زيادة عدم الاستقرار الجيني، والذي هو السبب الجذري للطفرات التي تؤدي إلى تكون الأورام. تحليل وتيرة ونوع من الانحرافات الصبغية في أنواع مختلفة من الخلايا يسمح عيوب في مسارات إصلاح الحمض النووي ليتم توضيح. وقد ساعد فهم الثدييات إصلاح الحمض النووي البيولوجيا كثيرا من إنتاج فئران مصابة بالضربة القاضية في جينات معينة. الهدف من هذا البروتوكول هو لقياس عدم الاستقرار الجيني في الخلايا الليمفاوية B الماوس. وضع العلامات على التيلوميرات باستخدام تحقيقات PNA-FISH (ببتيد الحمض النووي - فلوري في الموقع التهجين) يسهل تحليل سريع من عدم الاستقرار الجيني في كروموزوم ينتشر الطورية. خلايا B لديها مزايا نسبية محددة على الخلايا الليفية، لأن لديهم الصيغة الصبغية الطبيعي ومؤشر الإنقسامية العالي. وبالتالي الثقافة على المدى القصير من خلايا B يمكن قياس دقيق من عدم الاستقرار الجيني في السكان الخلية الأساسي الذي من المرجح أن يكون أقل طفرة جينية الثانويةق مما هو عادة موجودة في الخلايا الليفية تتحول أو خطوط الخلايا المرضى.
Introduction
ويتسبب السرطان عن طريق تراكم الطفرات التي تؤثر على الجينات التي تنظم نمو الخلايا العادية. الطفرة هي نتيجة للتغيرات في هيكل وتسلسل الجينوم الناجمة عن الأضرار التي لحقت الحمض النووي. يمكن أن يحدث التلف في الحمض النووي من خلال مجموعة متنوعة من العملية، بما في ذلك العوامل خارجية مثل الإشعاع المؤين، وكناتج نتاج الأيض الخلوي العادي، مثل نزع الأمين التلقائي للقواعد النوكليوتيدات أو ضرر يحدث عن طريق الاتصال مع أنواع الاكسجين التفاعلية 1.
على الرغم من أن خلايا الثدييات تمتلك مجموعة من الأنشطة التي يمكن أن إصلاح الحمض النووي من التلف أو عكس استعادة تسلسل في م....
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Protocol
وقد وافق هذا الإجراء من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدم في روتجرز، جامعة ولاية نيو جيرسي. عولجت فئران وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. يجب استشارة العلماء المنظمات الوطنية والمؤسسية للحيوان المبادئ التوجيهية الموضوعة والمعتمدة.
قبل البدء، وإعداد الحلول المدرجة في الجدول 1.
1. B عزل الخليوي والتنشيط
الموت ببطء باستخدام الماوس CO 2 تليها خلع عنق الرحم. ضع....
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
النتائج
يجب الكروموسومات الطورية المشتقة من خلية واحدة تشكل مجموعة منفصلة تحتوي على 40 صبغيا (إذا باستخدام خلايا فأر) (الشكل 1A). كل كروموسوم يحتوي على السنترومير في نهاية واحدة، وهو أمر واضح باعتباره المجال الأزرق الفاتح. في الصبغيات العادية، وينظر إشارتين التيلومير.......
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Discussion
بينما هي مناسبة خاصة الخلايا الليمفاوية B المنشط لإعداد ينتشر كروموسوم الإنقسامية، أنواع الخلايا الأخرى يمكن أن تستخدم أيضا. الخلايا اللمفية تي تشترك العديد من مزايا خلايا B، حيث يمكن تنقيته من الطحال أو الغدد الليمفاوية، ولها مؤشر الإنقسامية عالية عندما حفز النمو ?.......
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم المصالح المتضاربة.
Acknowledgements
ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R00 CA160574 (SFB) وزمالة من برنامج التدريب التكنولوجيا الحيوية روتجرز (إلى SMM).
....Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5 g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100 mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5 μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
- Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
- Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.....
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Erratum
Formal Correction: Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH. Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
| Solution | Reagents | Comments | Storage |
| B Cell Wash Buffer | 500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution | Filter through 0.22 μm stericup filtration unit | 4 °C |
| 5 ml 50 °C heat inactivated FCS | |||
| 5 ml 100x Pen/Strep | |||
| B Cell Medium | 418.5 ml RPMI-1640 | Filter through 0.22 μm stericup filtration unit | 4 °C |
| 50 ml 50 °C heat inactivated FCS | |||
| 5 ml 100x Pen/Strep | |||
| 5 ml glutamine | |||
| 5 ml nonessential amino acids | |||
| 5 ml sodium pyruvate | |||
| 1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol | |||
| 5 ml 1M HEPES | |||
| Fixative | 3:1 v/v methanol/glacial acetic acid | Make fresh | |
| 0.075 M KCl | 1.395 g KCl | Room Temperature | |
| 250 ml distilled H2O | |||
| FISH Master Mix | 40 ml 50% Dextran sulfate | Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight | Aliquot and store at -20 °C |
| 20 ml 20x SSC | |||
| 40 ml sterile distilled H2O | |||
| 70% Formamide/2x SSC | 10 ml 20x SSC | Adjust to pH 7 with 1M HCl | Aliquot and store at -20 °C |
| 20 ml distilled H2O | |||
| 70 ml deionized formamide | |||
| 0.01 M HCl | 1 ml 1M HCl | Adjust to pH 2.0 | Room Temperature |
| 99 ml distilled H2O | |||
| 1x PBS/MgCl2 | 50 ml 1M MgCl2 | Room Temperature | |
| 950 ml 1x PBS | |||
| 50% Formamide/2x SSC | 20 ml 20x SSC | Adjust to pH 7.25 Formamide used in this step does not have to be deionized. | Make fresh |
| 80 ml distilled H2O | |||
| 100 ml formamide | |||
| 4x SSC/0.1% Tween20 | 50 ml 20x SSC | Room Temperature | |
| 200 ml distilled H2O | |||
| 250 μl Tween20 | |||
| DAPI staining solution (80 ng/ml) | 40 μl 0.2mg/ml DAPI stock | 4 °C in light protected staining jar | |
| 100 ml 2x SSC | |||
| Mowiol Mounting Medium | 6 g glycerol | Incubate at 50 °C with stirring for 2hrs | Aliquot and store at 4 °C |
| 2.4 g Mowiol 4-88 | |||
| 6 ml distilled H2O | |||
| 12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5 | |||
| 230 μl 1% Thimerosal (w/v in water) |
Table 1. List of solutions.
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved