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Method Article
Schnelle Analyse von Chromosomenaberrationen in Maus-B-Lymphozyten durch PNA-FISH
In diesem Artikel
Erratum Notice
Zusammenfassung
DNA-Reparaturwege sind wichtig für die Erhaltung der genomischen Integrität und Mutation verhindert und Krebs. Das Ziel des Protokolls ist es, genomische Instabilität durch direkte Beobachtung von Chromosomenaberrationen in Metaphase-Spreads Quantifizierung von Maus-B-Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) für Telomer-DNA-Wiederholungen.
Zusammenfassung
Defekten DNA-Reparatur zu genomischer Instabilität, die die Ursache für Mutationen, die zu Tumorentstehung führen wird erhöht. Analyse der Häufigkeit und Art der Chromosomenaberrationen in verschiedenen Zelltypen ermöglicht Defekte in DNA-Reparaturwege aufgeklärt werden. Verständnis Säugetierbiologie DNA-Reparatur hat sich stark durch die Produktion von Mäusen mit Knockouts in bestimmten Genen geholfen. Das Ziel des Protokolls ist es, genomische Instabilität in Maus-B-Lymphozyten zu quantifizieren. Kennzeichnung der Telomere mit PNA-FISH-Sonden (Peptid-Nukleinsäure - Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) ermöglicht die schnelle Analyse von genomischen Instabilität in Metaphasechromosom Spreads. B-Zellen haben spezifische Vorteile gegenüber Fibroblasten, weil sie normale Ploidie und eine höhere mitotische Index haben. Kurzzeitkultur von B-Zellen ermöglicht daher eine genaue Messung der genomischen Instabilität in einer primären Zellpopulation, die voraussichtlich weniger Neben genetische Mutation ists als das, was in der Regel in transformierten Fibroblasten oder Patientenzelllinien gefunden.
Einleitung
Krebs wird durch die Akkumulation von Mutationen, die Gene, die die normale Zellwachstum regulieren verursacht. Mutation ist eine Folge von Änderungen in der Struktur und Sequenz des Genoms von DNA-Schäden verursacht. DNA-Schädigungen können durch eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich exogener Agenzien wie ionisierende Strahlung auftritt, und als ein Nebenprodukt des normalen Zellstoffwechsels, wie zum Beispiel spontane Desaminierung von Nukleotidbasen oder Beschädigung durch Kontakt mit reaktiven Sauerstoffspezies 1 auftritt.
Obwohl Säugetierzellen besitzen eine Reihe von Aktivitäten, die Reparatur von DNA-Schäden rückgä....
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Protokoll
Dieses Verfahren wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Rutgers, der State University of New Jersey genehmigt. Die Mäuse wurden in Übereinstimmung mit der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren behandelt. Wissenschaftler sollten ihre nationalen und institutionellen Tierorganisationen für etablierte und genehmigten Richtlinien konsultieren.
Bevor Sie beginnen, bereiten die in Tabelle 1 aufgeführten Lösungen.
1. B-Zell-Isolierung und Aktivierung
Euthanize eine Maus mit CO 2, gefolgt durch zervikale Dislokation. ....
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Ergebnisse
Metaphase-Chromosomen aus einer Zelle stamm eine diskrete Cluster, die 40 Chromosomen (bei Verwendung von Mauszellen) (1A) zu bilden. Jedes Chromosom hat einen Zentromer an einem Ende, die als Licht blaue Kugel sichtbar ist. Im normalen Chromosomen sind zwei Telomer Signale am Ende der Chromatiden und zwei Signale, die von jedem Romer gesehen. Interphase-Kernen auf der Folie zugegen sein. Diese werden als blaue Kugeln, mit rotem Telomer-Signale, aber keine kondensierten Chromosomen (siehe zum Beis.......
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Diskussion
Wohingegen aktivierte B-Lymphozyten sind besonders zur Herstellung von mitotischen Chromosomen-Spreads geeignet, können andere Zelltypen verwendet werden. T-Lymphozyten zu teilen viele der Vorteile von B-Zellen, wie sie aus der Milz oder den Lymphknoten gereinigt werden, und haben einen hohen mitotischen Index, wenn durch das Wachstum in Medium mit geeigneter Mitogene 8 stimuliert. Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind auch für Metaphasechromosom Analyse 9 geeignet. Wenn diese nicht vorhanden s.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine widerstreitenden Interessen.
Danksagungen
Diese Arbeit wird von NIH R00 CA160574 (SFB) und durch eine Gemeinschaft der Rutgers Biotechnologie Training Program (SMM) unterstützt.
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Materialien
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5 g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100 mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5 μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
Referenzen
- Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
- Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.....
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Erratum
Formal Correction: Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH. Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
| Solution | Reagents | Comments | Storage |
| B Cell Wash Buffer | 500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution | Filter through 0.22 μm stericup filtration unit | 4 °C |
| 5 ml 50 °C heat inactivated FCS | |||
| 5 ml 100x Pen/Strep | |||
| B Cell Medium | 418.5 ml RPMI-1640 | Filter through 0.22 μm stericup filtration unit | 4 °C |
| 50 ml 50 °C heat inactivated FCS | |||
| 5 ml 100x Pen/Strep | |||
| 5 ml glutamine | |||
| 5 ml nonessential amino acids | |||
| 5 ml sodium pyruvate | |||
| 1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol | |||
| 5 ml 1M HEPES | |||
| Fixative | 3:1 v/v methanol/glacial acetic acid | Make fresh | |
| 0.075 M KCl | 1.395 g KCl | Room Temperature | |
| 250 ml distilled H2O | |||
| FISH Master Mix | 40 ml 50% Dextran sulfate | Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight | Aliquot and store at -20 °C |
| 20 ml 20x SSC | |||
| 40 ml sterile distilled H2O | |||
| 70% Formamide/2x SSC | 10 ml 20x SSC | Adjust to pH 7 with 1M HCl | Aliquot and store at -20 °C |
| 20 ml distilled H2O | |||
| 70 ml deionized formamide | |||
| 0.01 M HCl | 1 ml 1M HCl | Adjust to pH 2.0 | Room Temperature |
| 99 ml distilled H2O | |||
| 1x PBS/MgCl2 | 50 ml 1M MgCl2 | Room Temperature | |
| 950 ml 1x PBS | |||
| 50% Formamide/2x SSC | 20 ml 20x SSC | Adjust to pH 7.25 Formamide used in this step does not have to be deionized. | Make fresh |
| 80 ml distilled H2O | |||
| 100 ml formamide | |||
| 4x SSC/0.1% Tween20 | 50 ml 20x SSC | Room Temperature | |
| 200 ml distilled H2O | |||
| 250 μl Tween20 | |||
| DAPI staining solution (80 ng/ml) | 40 μl 0.2mg/ml DAPI stock | 4 °C in light protected staining jar | |
| 100 ml 2x SSC | |||
| Mowiol Mounting Medium | 6 g glycerol | Incubate at 50 °C with stirring for 2hrs | Aliquot and store at 4 °C |
| 2.4 g Mowiol 4-88 | |||
| 6 ml distilled H2O | |||
| 12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5 | |||
| 230 μl 1% Thimerosal (w/v in water) |
Table 1. List of solutions.
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