Analyse rapide des aberrations chromosomiques dans les lymphocytes B de souris par PNA-FISH

Résumé

Voies de réparation d'ADN sont essentielles pour le maintien de l'intégrité du génome et la prévention de la mutation et le cancer. L'objectif de ce protocole est de quantifier l'instabilité génomique par l'observation directe des aberrations chromosomiques en métaphase se propage à partir de cellules B de souris en utilisant hybridation fluorescente in situ (FISH) pour les répétitions d'ADN télomérique dans.

Résumé

Réparation de l'ADN défectueux entraîne une augmentation de l'instabilité génomique, ce qui est la cause de mutations qui conduisent à la tumorigenèse. L'analyse de la fréquence et le type d'aberrations chromosomiques dans des types cellulaires différents permet défauts dans les voies de réparation d'ADN à être élucidés. Compréhension des mammifères réparation de l'ADN en biologie a été grandement aidé par la production de souris avec des coups de grâce dans les gènes spécifiques. L'objectif de ce protocole est de quantifier l'instabilité génomique dans les lymphocytes B de souris. Étiquetage des télomères en utilisant des sondes PNA-FISH (acide nucléique peptidique - hybridation fluorescente in situ) facilite l'analyse rapide de l'instabilité génomique des spreads métaphase chromosomiques. Les cellules B ont des avantages spécifiques par rapport à des fibroblastes, car ils ont une ploïdie normale et un indice mitotique élevé. Culture à court terme des cellules B permet donc une mesure précise de l'instabilité génomique dans une population de cellules primaires qui est susceptible d'avoir moins mutation génétique secondaires que ce que l'on trouve généralement dans les fibroblastes transformés ou des lignées cellulaires de patients.

Introduction

Le cancer est causé par l'accumulation de mutations affectant les gènes qui régulent la croissance cellulaire normale. Mutation est une conséquence de changements dans la structure et la séquence du génome causée par des dommages à l'ADN. lésions de l'ADN peut se faire par une variété de processus, y compris des agents exogènes tels que des rayonnements ionisants, et en tant que sous-produit du métabolisme cellulaire normal, comme la désamination spontanée de bases nucléotidiques ou des dommages survenus par contact avec des espèces réactives de l'oxygène ^1.

Bien que les cellules de mammifères possèdent une gamme d'activités de réparation qui peuvent inverser les dommages de l'ADN ou de rétablir l'ordre sur les sites de coupure, les mutations s'accumulent néanmoins tout au long de la durée de vie d'une cellule. dommage de l'ADN peut en outre contribuer à la sénescence et la perte d'activité de cellules souches, deux processus qui sont associées à la maladie de vieillissement associée à ^deux. Comprendre la réparation des lésions de l'ADN est donc d'une importance capitale dans la lutte contre deux signequestions ificant en matière de santé publique. Plus de preuves suggère que les mammifères voies de réparation d'ADN peuvent contribuer à l'évolution du génome des cellules cancéreuses ^3,4, ce qui rend encore plus impératif de comprendre les processus impliqués dans la répression de mutation au niveau moléculaire.

La visualisation directe des aberrations chromosomiques est un moyen puissant et quantitatifs de déterminer l'étendue de l'instabilité génomique dans un type cellulaire particulier. Chromosomes condensés à partir de cellules en métaphase peuvent être isolés et contrôlés en utilisant la microscopie à fluorescence ou la lumière. Ces approches cytogénétiques ont été dans la pratique depuis plusieurs décennies et peuvent être utilisés pour démontrer l'apparition des translocations spécifiques ou les types d'aberrations chromosomiques associées à la perte des activités de réparation d'ADN. Le protocole se prête à plusieurs extensions potentielles: les chromosomes peuvent être marquées avec des sondes pour caryotype spectral (SKY) ou multicolore fluorescent hybridation in situ(MFISH) pour identifier des translocations ^5,6. Ces techniques permettent également la fréquence des translocations chromosomiques et la structure de translocations chromosomiques complexes à déterminer, qui fournit des informations supplémentaires au-delà de ce qui est possible avec ce protocole. En variante, des sondes spécifiques des séquences peuvent être produites et utilisées pour tester la fréquence de cassure de l'ADN génomique dans les sites sélectionnés ^7.

Dans ce protocole, nous décrivons la préparation du chromosome métaphasique se propage à partir de lymphocytes B. Un acide nucléique peptidique (PNA) sonde marquée par fluorescence pour des répétitions télomériques est utilisé, qui marque de manière efficace les télomères se propage chromosome en métaphase Ce protocole présente plusieurs avantages. Les cellules B peuvent être amenés à se développer à l'index mitotique élevé de sorte que les écarts de haute qualité peuvent toujours être produites. Cellules B de souris génétiquement modifiées sont aussi beaucoup moins susceptibles de contenir des mutations génétiques secondaires qui peuvent fausser l'analyse de la contributionde gènes spécifiques à l'intégrité du génome. L'approche PNA-FISH peut être complété en une seule journée, et permet notation plus précise des cassures chromosomiques. En utilisant cette approche, en particulier en combinaison avec des équipements spécifiques décrites dans ce protocole, il est possible de produire de très cohérentes, les écarts de haute qualité et d'analyser rapidement le taux et le type d'instabilité génomique.

Protocole

Cette procédure a été approuvée par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'université Rutgers, l'Université d'État du New Jersey. Les souris ont été traitées en conformité avec le Guide NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Les scientifiques devraient consulter leurs organisations nationales et institutionnelles animaux de lignes directrices établis et approuvés.

Avant de commencer, préparer les solutions énumérées dans le tableau 1.

1. cellules B Isolement et activation

Euthanasier une souris à l'aide de CO ₂ suivie d'une dislocation cervicale. Placez la souris de sorte que le côté gauche du corps est en pulvériser la souris avec 70% d'éthanol jusqu'à ce que la fourrure est humide. On dissèque la rate et le placer dans une boîte de culture tissulaire de 35 mm avec un tampon de lavage 2 ml. Dans une hotte à flux laminaire, casser doucement la rate dans la boîte de culture tissulaire en utilisant l'extrémité plate d'une seringue de 5 ml.

1. Insérer un filet de nylon 70 um dans un 50ml tube et transférer l'échantillon de la rate dans 2 ml de tampon de lavage dans la maille de nylon. Perturber doucement la rate dans le maillage en utilisant la partie plate de la seringue.
2. Rincer à l'arrière de la seringue et la plaque de 35 mm avec 8 ml de tampon de lavage et filtrer à travers la maille 70 um de nylon. Centrifugeuse à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
3. Aspirer et jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 3 ml de tampon de lyse ACK. Introduire à la pipette de haut en bas brièvement perturber bouquets et incuber pendant 5 min. Ajouter 10 ml de tampon de lavage et centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C.
4. Aspirer et jeter le surnageant et remettre en suspension le culot en appuyant sur le fond du tube, puis par pipetage dans 1 ml de tampon de lavage. Ajouter 50 ul d'anticorps anti-CD43 microbilles MACS et laisser incuber sur de la glace pendant 30 min. Ajouter 10 ml de tampon de lavage, mélanger délicatement et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Ajouter 10 ml de tampon de lavage, mélanger délicatement et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
5. Mettre en place unMini-MACS colonne en plaçant une colonne sur l'aimant MACS. Placer un tube de 15 ml conique située sous la colonne. Ajouter 1 ml de tampon de lavage à colonne et le laisser courir à travers le tube de 15 ml.
6. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de tampon de lavage. Chargez l'échantillon dans la colonne après le tampon de lavage a parcouru.
7. Après que l'échantillon a parcourir la colonne, ajouter 1 ml de tampon de lavage pour laver la colonne. Ajouter 7 ml de tampon de lavage directement à l'échantillon prélevé dans le tube de 15 ml.
8. Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Transférer le volume requis de cellules nécessaires pour 5.000.000 cellules / puits dans un tube de 50 ml. Centrifugeuse à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Supplément milieu des cellules B avec des LPS à 1: 500 et IL4 1: 1000.
9. Aspirer le surnageant et ajouter le volume approprié de milieu de lymphocytes B supplémenté nécessaire à la concentration finale de 1.000.000 cellules / ml.
10. cellules de la plaque dans des plaques de 6 puits avec 5 ml de cellules à 1.000.000 cellules / ml et placer dans un humidified incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, 5% CO _2.

2 cellules B Fixation

1. Ajouter 50 ul de la colcémide pour le puits contenant 5 ml de cellules B (pour une concentration finale de 100 ng / ml) et incuber 1 h à 37 ° C. Préchauffer solution à 75 mM de KCl dans un bain-marie à 37 °. Transférer les cellules B à un 15 ml étiqueté tube. Couvrir l'étiquette avec un ruban et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
2. Aspirer le surnageant en laissant 1 ml dans le tube et remettre en suspension le culot par pipetage. Ajouter 5 ml de la baisse de KCl préchauffé à goutte tout en tapant ou pulsation sur un vortex.
3. Ajouter 10 ml de KCl et mélanger en inversant. Incuber dans un bain d'eau à 37 ° pendant 15 min. Ajouter 5 gouttes de fixateur frais et mélange par inversion. Centrifugeuse à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant en laissant 1 ml dans le tube et remettre le culot par aspiration et refoulement.
4. Ajouter 5 ml de baisse du fixateur frais à goutte tout en tapant ou pulsation sur une vortex. Ajouter 10 ml supplémentaires de fixateur et incuber pendant 30 min à température ambiante.
5. Centrifugeuse à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant en laissant 1 ml dans le tube et remettre en suspension par pipetage. Ajouter 14 ml de fixateur frais et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
6. Répétez l'étape 2.7 fois plus.
7. Ajouter 14 ml de fixateur frais. Sceller les bouchons avec du Parafilm et stocker la nuit à -20 ° C.

3 Préparation des étalements de chromosomes en métaphase

1. Définir une chambre environnementale régulée à 22,9 ° C et 52% d'humidité.
2. Centrifugeuse les cellules B fixé à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Aspirer fixateur laissant 70 pi dans le tube et remettre en suspension par pipetage.
3. Placer les lames marquées dans la chambre d'humidité à un angle de 35 °. Baisse de 35 pi des cellules B remises en suspension sur une lame et déposer deux diapositives par échantillon. Laisser sécher les lames dans la chambre humide pendant 30 min, puis stocker les diapositivesdans une boîte, à 37 ° C.

4. télomères PNA FISH

1. Préparation de la sonde
   1. Formamide désionisée pré-chaud à 37 ° C. Mélanger 2 pi de sonde de PNA avec des télomères formamide préchauffé 7 pi désionisée et incuber à 37 ° C sous agitation pendant 1 heure.
   2. Préchauffer maître FISH mélange à 37 ° C. Ajouter 7 pi préchauffé maître FISH mélange au mélange de l'étape 4.1.1 et incuber à 37 ° C pendant 1-3 heures.
   3. Dénaturer le mélange de la sonde pendant 8 min à 80 ° C. Pré-recuire la sonde pendant 1 heure à 37 ° C.
2. Le prétraitement des diapositives chromosomiques
   1. Pré-réchauffer un bocal en verre coulissante coloration contenant 50 ml de HCl 0,01 M à 37 ° C dans un bain d'eau.
   2. Placer les lames dans un pot différent lame de verre-coloration contenant 2x SSC pendant 5 min à température ambiante.
   3. Ajouter 2 ul de la pepsine actions pour le verre préchauffé pot coulissant coloration et mélanger en inversant. Placer les lames dans ce sl de verrepot ide-coloration et incuber 90 secondes à 37 ° C.
   4. Laver les lames 2x dans un bocal en verre coulissant différente coloration contient 1x PBS pendant 5 min de chaque à la température ambiante en agitant. Ensuite, laver les lames pendant 5 min dans du PBS 1X / MgCl ₂ à la température ambiante en agitant.
   5. Placer les lames dans un bocal en verre coulissante coloration fraîchement préparé contenant 1% de formaldéhyde / PBS 1x / MgCl ₂ pendant 10 min à température ambiante.
   6. Laver les lames pendant 5 min dans un bocal en verre coulissant différente coloration contient 1x PBS à température ambiante en agitant.
   7. Préparer une série de déshydratation de l'éthanol en avoir séparé les bocaux en verre coulissante coloration contenant 70%, 90% et 100% d'éthanol.
   8. Placer les lames dans chaque pot pendant 3 minutes, en commençant avec 70% d'éthanol, puis 90% d'éthanol, puis 100% d'éthanol. Placez les pots d'éthanol à -20 ° C lorsque vous avez terminé.
   9. Laisser les lames sécher à l'air en appuyant sur un excès d'éthanol sur une serviette en papier et étaiement diapositives à un angle de 35 °. Une fois sec, maRK une zone de 18 x 18 mm pour l'hybridation sur le dos des lames à l'aide d'un stylet en diamant.
3. La dénaturation des lames de FISH
   1. Appliquer formamide 120 ul 70% déminéralisée / 2X SSC à un 24 x 60 mm lamelle. Appuyez sur la diapositive à la lamelle. Dénaturer la lame à 80 ° C sur une plaque chaude pendant 90 secondes.
   2. Coulisser rapidement et soigneusement la lamelle couvre-objet et de placer la lame dans la glace froide éthanol à 70% pendant 3 min, suivie de 90% d'éthanol, et 100% d'éthanol pour chaque 3 min. Laisser les lames sécher à l'air.
   3. Préparer une chambre humide en alignant une boîte en plastique avec un couvercle étanche et papier de soie humide. Le papier doit être humide, mais pas saturé d'eau.
   4. Dans une chambre humide, appliquer le mélange de la sonde pré-recuit de l'étape 4.1.3 pour la zone marquée sur la lame, couvrir avec un couvercle de glissement mm 18 x 18 et incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
4. Lavage post-incubation
   1. Préchauffer 50% de formamide / SSC 2x, 1x SSC et 4x SSC / 0,1% de Tween-20 à 45 °; Bain d'eau.
   2. Retirez délicatement les lamelles et laver les lames dans préchauffé 50% de formamide / 2x SSC 3xfor 5 min chacun dans l'obscurité et la secousse. Laver les lames dans préchauffé 1x SSC 3xfor 5 min chacun, secouant. Enfin, laver les lames dans préchauffé 4x SSC / 0,1% de Tween-20 3xfor 5 min chacun.
   3. Colorer les lames pendant 3 min dans DAPI dans un bocal en verre coulissant de coloration lumière protégée.
   4. Laver les lames pendant 5 min dans du SSC 2x, secouant. Appliquer 35 pi de milieu de montage Mowiol, couvrir avec 24 x 60 mm lamelles et stocker les lames à 4 ° C.

5 L'analyse microscopique des chromosomes

1. Analyser les diapositives en métaphase l'aide d'un microscope à épifluorescence standard. Utilisez une plate-forme d'imagerie avec une étape automatisée telle que la plate-forme métasystèmes Metafer pour obtenir de meilleurs résultats. Pour chaque diffusion de la métaphase, de recueillir une image de fluorescence DAPI pour visualiser les chromosomes, et une image pour le signal fluorescent du télomère probe. (Par exemple, d'autres substances fluorescentes Cy3 sont disponibles et fonctionnent aussi bien.)
2. Superposition des images avec un programme d'analyse d'image et d'analyser.

Résultats

Chromosomes métaphasiques dérivés d'une cellule doivent former un ensemble discret contenant 40 chromosomes (si l'on utilise des cellules de souris) (figure 1A). Chaque chromosome a un centromère, à une extrémité, qui est visible comme une sphère de lumière bleue. Dans chromosomes normaux, deux signaux de télomères sont observés à la fin des chromatides et deux signaux de chaque centromère. Les noyaux en interphase seront présents sur la lame ainsi. Ceux-ci seront visibles comme d...

Discussion

Alors que les lymphocytes B activés sont particulièrement adaptés à la préparation des étalements de chromosomes mitotiques, d'autres types de cellules peuvent également être utilisés. Lymphocytes T part un grand nombre des avantages de cellules B, comme elles peuvent être purifiées à partir de ganglions lymphatiques ou de la rate, et ont un indice mitotique élevé lorsqu'ils sont stimulés par la croissance dans un milieu contenant des mitogenes appropriés ^8. Les cellules souches embryo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
50% Dextran sulfate	Intergen	S4030
Deionized formamide	Ambion	9342
Pepsin (5 g)	Sigma	P 6887
FCS	Gemini	100-106
LPS (100 mg)	Sigma	L2630
IL-4 (5 μg)	Sigma	I1020
PNA Telomere Probe	PNA Bio Inc	F1002	(CCCTAACCCTAACCCTAA)
Colcemid	Roche	295892
Mowiol 4-88	Sigma	81381-50g
CD43 (ly-48_) micro-beads	Miltenyl Biotec.	130-049-801
DAPI	Sigma	32670-5MG
Eclipse E800	Nikon
AxioImager.Z2	Zeiss
CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber	Thermotron