PNA-FISH ile Fare B Lenfositlerindeki kromozom anormallikleri hızlı Analizi

Özet

DNA onarım yolları genomik bütünlüğünü korumak ve mutasyon ve kanser önlenmesi için gereklidir. Bu protokolün amacı, metafaz telomerik DNA tekrarlar in situ hibridizasyon (FISH) floresan kullanılarak fare B hücreleri yayılır içinde kromozom anormallikleri doğrudan gözlem ile genomik istikrarsızlık ölçümüdür.

Özet

Arızalı DNA onarım tümörigeneze yol mutasyonların kök nedenidir genomik istikrarsızlık, artan yol açar. Farklı hücre tiplerinde frekans ve kromozom anormallikleri türü analizi DNA onarım geçiş yollarında bazı kusurların araştırılmasına izin verir. Anlama memeli DNA tamir biyoloji büyük ölçüde spesifik gen knock-out ile farelerin üretimi ile yardımcı olmuştur. Bu protokolün amacı, fare B lenfositleri genomik istikrarsızlık ölçümüdür. PNA-BALIK sondaları (peptid nükleik asit - in situ hibridizasyon floresan) ile telomerlerin Etiketleme metafaz kromozom yayılır genomik istikrarsızlık hızlı analiz kolaylaştırır. Normal ploidi ve daha yüksek bir mitotik indeks çünkü B hücreleri, fibroblastlar göre spesifik avantajları vardır. B hücrelerinin kısa dönemli kültür bu nedenle daha az ikincil genetik mutasyona uğramış ihtimali olan bir birincil hücre popülasyonunda genomik instabilite hassas ölçüm sağlartipik olarak transforme edilmiş fibroblastlar veya hastanın hücre soylarında bulundu olandan s.

Giriş

Kanser, normal hücre gelişimini düzenleyen genlerin etkileyen mutasyonların birikmesine neden olur. Mutasyon DNA'ya hasar görmesinden kaynaklanır genomunun yapısı ve sekansına değişikliklerin bir sonucudur. DNA hasarı örneğin iyonize edici radyasyon gibi, ekzojen maddeler de dahil olmak üzere, çeşitli işlem vasıtasıyla ortaya çıkabilir ve reaktif oksijen türleri ¹ ile temas ile oluşan nükleotid baz veya hasar spontan deaminasyonu gibi normal hücresel metabolizma, bir yan ürün olarak.

Memeli hücrelerinin, DNA hasarı tersine veya mola yerlerinde sırası geri yükleyebilirsiniz onarım faaliyetleri bir dizi sahip olmasına rağmen, mutasyonların yine bir hücrenin ömrü boyunca birikir. DNA hasarı, ayrıca, yaşlanma ile ilişkili hastalık ² ile ilişkili iki işlem, yaşlılık ve kök hücre potens kaybı katkıda bulunabilir. İki işaret adresleme nedenle merkezi öneme DNA hasarının onarımı Anlamakamu sağlığı ificant konular. Artan kanıtlar memeli DNA onarım yolları daha da zorunlu moleküler düzeyde mutasyon bastırmakla alakası süreçleri anlamak için yapım, kanser hücre genomu ^3,4 evrimine katkıda düşündürmektedir.

Kromozom anormallikleri doğrudan görselleştirme özel bir hücre türü genomik instabilite ölçüde belirleyen güçlü ve kantitatif bir araçtır. Metafaz hücrelerinden özet kromozomları izole ve ışık veya floresan mikroskopi kullanılarak kontrol edilebilir. Bu tür yaklaşımlar, sitogenetik birkaç on yıl boyunca uygulamada olmuştur ve translokasyonları veya DNA tamir aktiviteleri kaybı ile ilgili kromozom anormallikleri belirli türleri görünümünü göstermek için kullanılabilir. Protokol birkaç potansiyel uzantıları kendisini ödünç: kromozomlar in situ hibridizasyon spektral karyotip (SKY) veya çok renkli floresan için sondalar ile etiketli olabilir(MFISH) translakosyon ^5,6 tanımlamak için. Bu teknikler aynı zamanda bu protokol ile mümkündür ötesinde ek bilgi sağlar kromozom translokasyonların sıklığını ve tespit edilecek kompleks kromozom translokasyonların yapısını, etkinleştirin. Seçenek olarak ise, diziye özgü problar olarak üretilir ve seçilen genomik DNA'sı sitelerinin ⁷ kopma frekansı test etmek için de kullanılabilir.

Bu protokol, biz metafaz kromozom hazırlanması B lenfositlerden yayılır açıklar. Telomerik tekrarlar için bir fluoresan olarak işaretlenmiş peptid nükleik asit (PNA) sistemi etkin metafaz kromozomda telomerlerin işaretleyen kullanılır Bu protokol, bir çok avantaja sahiptir yayılır. B hücreleri, yüksek kaliteli sürülen sürekli olarak üretilebilir ve böylece yüksek bir mitotik indeksli, büyümesi için teşvik edilebilir. Genetiği değiştirilmiş farelerde B hücreleri de çok daha az katkı analizini bulandırabilir sekonder genetik mutasyonlar içeren muhtemeldirgenomik bütünlük belirli genler. PNA-BALIK yaklaşım bir günde tamamlanmış ve kromozom kırılmaları daha doğru puanlama veriyor olabilir. Özellikle bu protokolde tarif edilen özel ekipmanla birlikte, bu yaklaşım kullanılarak, çok tutarlı, yüksek kaliteli sürülen ürünlerin üretilmesi ve hızlı oranı ve genomik instabilite tür analiz etmek mümkündür.

Protokol

Bu prosedür Rutgers Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu, New Jersey Eyalet Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Fareler Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı için NIH Kılavuzu'na uygun olarak tedavi edildi. Bilim adamları kurulan ve onaylanmış kılavuzlar için ulusal ve kurumsal hayvan kuruluşlara danışılması gerekir.

Başlamadan önce, Tablo 1'de listelenen çözümleri hazırlamak.

1. B Hücre İzolasyon ve Aktivasyon

Sonra servikal dislokasyon yapılmıştır _CO2 kullanılarak bir fare öldürülür. Vücudun sol tarafı yukarı yani fare yerleştirin ve kürk nemli olana kadar% 70 etanol ile fareyi sprey. 2 ml yıkama tamponu ile bir 35 mm doku kültürü çanağı içinde dalak ve yer ayır. Bir laminar akış başlığı içinde, yavaşça 5 ml şırıngaya yassı ucu kullanılarak doku kültürü çanağı içinde dalak kırmak.

1. 50 içine 70 mikron naylon örgü takınmi boru ve naylon örgü içine 2 ml yıkama tamponu içinde dalak örnek aktarmak. Yavaşça şırınga ucunu kullanarak düz örgü, dalak bozabilir.
2. Yıkama tamponu, 8 ml şırınga arka ve 35 mm plaka yıkayın ve 70 um naylon ağ filtre ediniz. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
3. Aspire süpernatant atmak ve ACK lizis tamponu 3 ml pelletini ve. Yığınları parçalamak ve 5 dakika boyunca inkübasyona aşağı kısa süreli olarak pipetle ve. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yıkama tamponu ve 10 ml ilave edilir.
4. Aspire süpernatan atılır ve yıkama tamponu ile 1 ml içinde pipetleme ile daha sonra, tüpün alt kısmını dokunarak pelletini ve. Anti-CD43 MACS mikro boncuklar 50 ul ilave edilir ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de, yıkama tamponu ile 10 ml ekleyin, yavaşça karıştırın ve santrifüj. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de, yıkama tamponu ile 10 ml ekleyin, yavaşça karıştırın ve santrifüj.
5. Kurulmuş birMACS mıknatıs üzerinde bir sütun koyarak Mini-MACS sütun. Kolonunun altında bir etiketli 15 ml konik tüp yerleştirin. Sütun yıkama tamponu 1 ml ilave edilir ve 15 ml'lik bir tüpe çalışmasına olanak sağlar.
6. Yıkama tamponu 1 ml süpernatan aspire ve tekrar süspansiyon. Yıkama tamponu ile çalıştırmak sonra sütununda örnek yükleyin.
7. Örnek, kolon içinden geçen sonra sütunu yıkamak için 1 ml yıkama tamponu ilave edin. Doğrudan 15 ml tüp içinde toplanan numuneye yıkama tamponu 7 ml ilave edilir.
8. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 50 ml'lik bir tüp içine / oyuk 5.000.000 hücreleri için gereken hücre gerekli hacmi aktarın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. LPS 1 ile Ek B hücreli orta: 500 ve 1 IL4: 1.000.
9. Süpernatan aspire ve 1,000,000 hücre / ml 'lik nihai konsantrasyon için gerekli olan takviye B hücre ortamının uygun hacimde ekleyin.
10. Bir nemlendirme 1.000.000 hücre / ml, bir yerde hücreler, 5 ml 6 yuvalı plakalar içinde plakası hücreleri37 ° C'de bir hücre kültürü yetiştirme baskı,% 5 _CO2.

2. B Hücre Sabitleme

1. De (100 ng / ml 'lik bir nihai konsantrasyon için) B hücre 5 ml ihtiva eden ve 37 °' de 1 saat inkübe C colcemid 50 ul ekle. Bir 37 ° C su banyosu içinde ön ısıtılması, 75 mM KCI çözeltisi. Etiketlenmiş bir 15 ml tüp B hücreleri aktarın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile bant ve etiket kapak.
2. Tüp içinde 1 ml bırakarak süpernatant aspire ve pipetleme pelletini. Dokunarak veya bir girdap darbe sırasında damla prewarmed KCl damla 5 ml ekleyin.
3. KCl 10 ml ekleyin ve tersini karıştırın. 15 dakika süre ile, 37 ° C su banyosu içinde inkübe edin. Tersini taze fiksatif ve karışımın 5 damla ekleyin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme tüp ve tekrar süspansiyon pelet 1 ml bırakarak süpernatant aspire.
4. Dokunarak veya vor üzerinde darbeli ise damla taze fiksatif damla 5 ml ekleyintex. Fiksatif ilave bir 10 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
5. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Pipetle tarafından tüp ve tekrar süspansiyon 1 ml bırakarak süpernatant aspire. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj taze sabitleştirici ve 14 ml ilave edilir.
6. Adımı tekrarlayın 2.7 kez daha fazla.
7. Taze fiksatif 14 ml ekleyin. Parafilm ile sızdırmaz şekilde kapatılır ve kapaklar -20 ° C de bir gece boyunca muhafaza ediniz.

Metafaz Kromozom Spread 3. hazırlanması

1. 22.9 ° C ve% 52 nem için düzenlenmiş çevresel odasını ayarlayın.
2. Santrifüj, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 xg'de B hücrelerinin sabit. Aspire pipetleme tüp ve tekrar süspansiyon 70 ul bırakarak sabitleştirici.
3. 35 ° açıyla nem odasında etiketli slaytlar yerleştirin. Bir slayt üzerine yeniden süspanse B hücrelerinin 35 ul damla ve numune başına iki slaytlar bırakın. 30 dakika sonra slaytları saklamak için slaytlar nem odasında kurumaya bırakın37 ° C'de bir slayt kutusu.

4. Telomer PNA BALIK

1. Probe hazırlanması
   1. 37 ° C önceden sıcak deiyonize formamiddir. 7 ul önceden ısıtılmış deiyonize formamid ile telomer PNA probu 2 ul karıştırın ve 1 saat boyunca çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin.
   2. 37 ° C önceden sıcak BALIK usta karışımı. Aşama 4.1.1 karışımına 7 ul önceden ısıtılmış BALIK ana karışımı ilave edin ve 1-3 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   3. 80 ° C'de 8 dakika boyunca prob karışımı denatüre. 37 ° C'de 1 saat boyunca prob önceden tavlanması.
2. Kromozom Slaytlar Tedavi öncesi
   1. Bir su banyosu içinde 37 ° C'de 0.01 M HCI 50 ml ihtiva eden bir cam slayt, boyama kavanoz önceden ısıtın.
   2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2 x SSC içeren farklı bir cam slayt boyama kavanoz Slaytları.
   3. Önceden ısıtılmış bir cam slayt-boyama kavanoz Pepsin stoklar 2 ul ve alt üst edilerek karıştırılır. Bu cam sl Transfer slaytlaride boyama kavanozu ve 37 ° C'de 90 saniye kuluçkaya.
   4. Slaytlar sallayarak, oda sıcaklığında 5 dakika her biri için 1x PBS içeren farklı bir cam slayt boyama kavanoz 2x yıkayın. Daha sonra çalkalama, oda sıcaklığında 1 x PBS / _MgCI2, 5 dakika için slaytlar yıkayın.
   5. Oda sıcaklığında 10 dakika için taze hazırlanmış% 1 formaldehid / 1x PBS / _MgCI2 ihtiva eden bir cam slayt, boyama kavanoza slaytlar aktarın.
   6. Çalkalanarak oda sıcaklığında 1 x PBS içeren farklı bir cam slayt, boyama kavanoz içinde 5 dakika boyunca slaytlar yıkayın.
   7. % 70,% 90 ve% 100 etanol ihtiva eden ayrı ayrı cam slayt, boyama kavanoz sahip olan bir etanol su kaybı geliştirilmesidir.
   8. Daha sonra% 70 etanol,% 90 etanol, ardından% 100 etanol ile başlanarak, 3 dakika boyunca her kavanoza slaytlar aktarın. Bittiğinde -20 ° C'de etanol kavanozları yerleştirin.
   9. Bir kağıt havlu üzerine aşırı etanol dokunarak ve 35 ° açıyla slaytlar yaslanır tarafından hava kurumaya slaytlar izin ver. Kuruduktan sonra, maBir elmas kalem kullanarak slaytlar arkasında melezleşme için bir 18 x 18 mm alanı çalış.
3. FISH için Slaytlar denatürasyonu
   1. 24 x 60 mm lamel 120 ul% 70 deiyonize formamid / 2X SSC uygulayın. Lamel slayt dokunun. 90 saniye için bir sıcak plaka üzerinde 80 ° C de slayt denatüre.
   2. Hızlı ve dikkatli bir şekilde lamel kaydırarak ve 3 dakika boyunca% 90 etanol, ardından 3 dakika,% 100 etanol ve her biri için buz soğuğu% 70 etanol içinde slayt yerleştirin. Kuru hava slaytlar izin ver.
   3. Sıkı bir kapak ve ıslak kağıt mendil ile bir plastik kutu astar ile nemli odasını hazırlayın. Kağıt nemli olabilir, ancak su ile doymuş olmamalıdır.
   4. Nemli bir oda içinde, sürgü üzerine işaretli bölgeye adım 4.1.3 de önceden tavlanmış prob karışımı geçerli bir 18 x 18 mm kapak slipi ile kapatın ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
4. Post-inkübasyon Yıkama
   1. Ön sıcak% 50 formamid / 2 x SSC, 1 x SSC ve 4x SSC /% 0.1 Tween-20, 45 ° 'deC su banyosu.
   2. Dikkatlice lamelleri çıkarın ve karanlık ve çalkalanarak önceden ısıtılmış% 50 formamid / 2 x SSC 3xfor 5 dakika ve her bir durumda slaytlar yıkayın. Çalkalama, 3xfor 5 dakika önceden ısıtılmış 1x SSC, her slaytlar yıkayın. Son olarak, önceden ısıtılmış 4x SSC slaytlar yıkama /% 0.1 Tween-20 3xfor her biri 5 dakika.
   3. Hafif bir korumalı cam slayt,-boyama kavanoz DAPI 3 dakika boyunca slaytlar Leke.
   4. Çalkalama, 2x SSC içinde 5 dakika boyunca slaytlar yıkayın. 60 x 24 mm kapak camı ile kapak, montaj orta Mowiol 35 ul uygulayın ve 4 ° C'de slaytlar saklayın.

Kromozomların 5. Mikroskobik Analizi

1. Standart bir epi-floresan mikroskop kullanılarak metafaz slaytlar analiz edin. En iyi sonuçları elde etmek için bu tür MetaSystems Metafer platform olarak otomatik bir sahne ile bir görüntüleme platformu kullanın. DAPI floresan kromozom görselleştirmek için her metafaz yayılması için, bir resim toplamak ve telomer p gelen floresan sinyali için bir resimbornoz. (Örneğin, Cy3- diğer Fluors mevcuttur ve iyi derecede çalışır.)
2. Bir görüntü analiz programı ile görüntüleri Yerleşimi ve analiz eder.

Sonuçlar

Bir hücreden türetilen metafaz kromozomlarda (Şekil 1A) (Fare hücreleri kullanılarak gerçekleştirilen varsa) 40 kromozom içeren ayrı bir küme oluşturmak gerekir. Her kromozom bir açık mavi küre gibi görünür bir ucunda, bir sentromer vardır. Normal kromozom olarak iki telomer sinyaller her bir sentromer ile kromatidlerin ve iki sinyalin sonunda görülür. Interfaz çekirdekleri de slaytta mevcut olacaktır. Bu kırmızı telomer sinyalleri ile mavi küreler, ama hiçbir yoğunlaşmış...

Tartışmalar

Aktifleşmiş B lenfositleri, özellikle mitotik kromozom sürülen hazırlamaya uygun olan ise, diğer hücre tipleri de kullanılabilir. T lenfositleri de dalak veya lemf nodlarından saflaştırılabilir gibi, B hücrelerinin avantajları çok paylaşan ve uygun mitojenler ⁸ ihtiva eden ortam içinde büyüme ile uyarıldıkları zaman, yüksek bir mitotik indeksli sahiptir. Embriyonik Kök hücreler (ES hücreleri) de metafaz kromozom analizi ⁹ için uygundur. Bu mevcut değilse, colcemid ile d...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
50% Dextran sulfate	Intergen	S4030
Deionized formamide	Ambion	9342
Pepsin (5 g)	Sigma	P 6887
FCS	Gemini	100-106
LPS (100 mg)	Sigma	L2630
IL-4 (5 μg)	Sigma	I1020
PNA Telomere Probe	PNA Bio Inc	F1002	(CCCTAACCCTAACCCTAA)
Colcemid	Roche	295892
Mowiol 4-88	Sigma	81381-50g
CD43 (ly-48_) micro-beads	Miltenyl Biotec.	130-049-801
DAPI	Sigma	32670-5MG
Eclipse E800	Nikon
AxioImager.Z2	Zeiss
CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber	Thermotron