Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
PNA-FISH ile Fare B Lenfositlerindeki kromozom anormallikleri hızlı Analizi
Bu Makalede
Erratum Notice
Özet
DNA onarım yolları genomik bütünlüğünü korumak ve mutasyon ve kanser önlenmesi için gereklidir. Bu protokolün amacı, metafaz telomerik DNA tekrarlar in situ hibridizasyon (FISH) floresan kullanılarak fare B hücreleri yayılır içinde kromozom anormallikleri doğrudan gözlem ile genomik istikrarsızlık ölçümüdür.
Özet
Arızalı DNA onarım tümörigeneze yol mutasyonların kök nedenidir genomik istikrarsızlık, artan yol açar. Farklı hücre tiplerinde frekans ve kromozom anormallikleri türü analizi DNA onarım geçiş yollarında bazı kusurların araştırılmasına izin verir. Anlama memeli DNA tamir biyoloji büyük ölçüde spesifik gen knock-out ile farelerin üretimi ile yardımcı olmuştur. Bu protokolün amacı, fare B lenfositleri genomik istikrarsızlık ölçümüdür. PNA-BALIK sondaları (peptid nükleik asit - in situ hibridizasyon floresan) ile telomerlerin Etiketleme metafaz kromozom yayılır genomik istikrarsızlık hızlı analiz kolaylaştırır. Normal ploidi ve daha yüksek bir mitotik indeks çünkü B hücreleri, fibroblastlar göre spesifik avantajları vardır. B hücrelerinin kısa dönemli kültür bu nedenle daha az ikincil genetik mutasyona uğramış ihtimali olan bir birincil hücre popülasyonunda genomik instabilite hassas ölçüm sağlartipik olarak transforme edilmiş fibroblastlar veya hastanın hücre soylarında bulundu olandan s.
Giriş
Kanser, normal hücre gelişimini düzenleyen genlerin etkileyen mutasyonların birikmesine neden olur. Mutasyon DNA'ya hasar görmesinden kaynaklanır genomunun yapısı ve sekansına değişikliklerin bir sonucudur. DNA hasarı örneğin iyonize edici radyasyon gibi, ekzojen maddeler de dahil olmak üzere, çeşitli işlem vasıtasıyla ortaya çıkabilir ve reaktif oksijen türleri 1 ile temas ile oluşan nükleotid baz veya hasar spontan deaminasyonu gibi normal hücresel metabolizma, bir yan ürün olarak.
Memeli hücrelerinin, DNA hasarı tersine veya mola yerlerinde sırası geri yükleyebilirsiniz onarım faaliyetleri bir dizi sahip olmasına rağmen,....
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Protokol
Bu prosedür Rutgers Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu, New Jersey Eyalet Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Fareler Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı için NIH Kılavuzu'na uygun olarak tedavi edildi. Bilim adamları kurulan ve onaylanmış kılavuzlar için ulusal ve kurumsal hayvan kuruluşlara danışılması gerekir.
Başlamadan önce, Tablo 1'de listelenen çözümleri hazırlamak.
1. B Hücre İzolasyon ve Aktivasyon
Sonra servikal dislokasyon yapılmıştır CO2 kullanılarak bir fare öldürülür. Vücudun sol tarafı yukarı yani fare yerleştirin ve ....
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Sonuçlar
Bir hücreden türetilen metafaz kromozomlarda (Şekil 1A) (Fare hücreleri kullanılarak gerçekleştirilen varsa) 40 kromozom içeren ayrı bir küme oluşturmak gerekir. Her kromozom bir açık mavi küre gibi görünür bir ucunda, bir sentromer vardır. Normal kromozom olarak iki telomer sinyaller her bir sentromer ile kromatidlerin ve iki sinyalin sonunda görülür. Interfaz çekirdekleri de slaytta mevcut olacaktır. Bu kırmızı telomer sinyalleri ile mavi küreler, ama hiçbir yoğunlaşmış.......
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Tartışmalar
Aktifleşmiş B lenfositleri, özellikle mitotik kromozom sürülen hazırlamaya uygun olan ise, diğer hücre tipleri de kullanılabilir. T lenfositleri de dalak veya lemf nodlarından saflaştırılabilir gibi, B hücrelerinin avantajları çok paylaşan ve uygun mitojenler 8 ihtiva eden ortam içinde büyüme ile uyarıldıkları zaman, yüksek bir mitotik indeksli sahiptir. Embriyonik Kök hücreler (ES hücreleri) de metafaz kromozom analizi 9 için uygundur. Bu mevcut değilse, colcemid ile d.......
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Açıklamalar
Yazarlar çatışan çıkarları var.
Teşekkürler
Bu çalışma NIH hibe R00 CA160574 (SFB) tarafından ve (SMM için) Rutgers Biyoteknoloji Eğitim Programı bursu ile desteklenmektedir.
....Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Malzemeler
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5 g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100 mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5 μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
Referanslar
- Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
- Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.....
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Erratum
Formal Correction: Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH. Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
| Solution | Reagents | Comments | Storage |
| B Cell Wash Buffer | 500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution | Filter through 0.22 μm stericup filtration unit | 4 °C |
| 5 ml 50 °C heat inactivated FCS | |||
| 5 ml 100x Pen/Strep | |||
| B Cell Medium | 418.5 ml RPMI-1640 | Filter through 0.22 μm stericup filtration unit | 4 °C |
| 50 ml 50 °C heat inactivated FCS | |||
| 5 ml 100x Pen/Strep | |||
| 5 ml glutamine | |||
| 5 ml nonessential amino acids | |||
| 5 ml sodium pyruvate | |||
| 1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol | |||
| 5 ml 1M HEPES | |||
| Fixative | 3:1 v/v methanol/glacial acetic acid | Make fresh | |
| 0.075 M KCl | 1.395 g KCl | Room Temperature | |
| 250 ml distilled H2O | |||
| FISH Master Mix | 40 ml 50% Dextran sulfate | Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight | Aliquot and store at -20 °C |
| 20 ml 20x SSC | |||
| 40 ml sterile distilled H2O | |||
| 70% Formamide/2x SSC | 10 ml 20x SSC | Adjust to pH 7 with 1M HCl | Aliquot and store at -20 °C |
| 20 ml distilled H2O | |||
| 70 ml deionized formamide | |||
| 0.01 M HCl | 1 ml 1M HCl | Adjust to pH 2.0 | Room Temperature |
| 99 ml distilled H2O | |||
| 1x PBS/MgCl2 | 50 ml 1M MgCl2 | Room Temperature | |
| 950 ml 1x PBS | |||
| 50% Formamide/2x SSC | 20 ml 20x SSC | Adjust to pH 7.25 Formamide used in this step does not have to be deionized. | Make fresh |
| 80 ml distilled H2O | |||
| 100 ml formamide | |||
| 4x SSC/0.1% Tween20 | 50 ml 20x SSC | Room Temperature | |
| 200 ml distilled H2O | |||
| 250 μl Tween20 | |||
| DAPI staining solution (80 ng/ml) | 40 μl 0.2mg/ml DAPI stock | 4 °C in light protected staining jar | |
| 100 ml 2x SSC | |||
| Mowiol Mounting Medium | 6 g glycerol | Incubate at 50 °C with stirring for 2hrs | Aliquot and store at 4 °C |
| 2.4 g Mowiol 4-88 | |||
| 6 ml distilled H2O | |||
| 12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5 | |||
| 230 μl 1% Thimerosal (w/v in water) |
Table 1. List of solutions.
Yeniden Basımlar ve İzinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiDaha Fazla Makale Keşfet
This article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır