JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

מסלולי תיקון DNA חיוניים לתחזוקה של שלמות הגנום ומוטצית מניעה וסרטן. המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת חוסר יציבות גנומית על ידי תצפית ישירה של סטיות כרומוזום בmetaphase מתפשט מתאי B עכבר באמצעות ניאון הכלאה באתר (FISH) לחזרות דנ"א telomeric.

Abstract

תיקון DNA פגום מוביל לחוסר יציבות גנומית מוגבר, המהווה את סיבת השורש של מוטציות המובילות ליצירת גידולים. ניתוח של התדירות והסוג של סטיות כרומוזום בתאים מסוגים שונים מאפשר פגמים במסלולי תיקון DNA לא הובהרו. ביולוגיה תיקון דנ"א של יונקים הבנה כבר סייעה רב בייצור של עכברים עם knockouts בגנים מסוימים. המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת חוסר יציבות גנומית בB עכבר לימפוציטים. תיוג של הטלומרים באמצעות בדיקות PNA-FISH (חומצות גרעין פפטיד - ניאון הכלאה באתר) מאפשר ניתוח המהיר של חוסר יציבות גנומית במרווחי כרומוזום metaphase. יש לי תאי B יתרונות ספציפיים ביחס לפיברובלסטים, כי יש להם ploidy נורמלי ומדד המיטוטי גבוה יותר. תרבות לזמן הקצר של תאי B ולכן מאפשרת מדידה מדויקת של חוסר יציבות גנומית באוכלוסיית תא ראשונית שעשויה להיות מוטציה גנטית משנית פחותים יותר ממה שהוא נמצא בדרך כלל בfibroblasts הפך או שורות תאי חולה.

Introduction

הסרטן נגרמים על ידי ההצטברות של מוטציות המשפיעות על גנים המווסתים את גדילת תאים נורמלית. מוטציה היא תוצאה של שינויים במבנה וברצף של הגנום שנגרם נזק לדנ"א. נזק לדנ"א יכול להתרחש באמצעות מגוון רחב של תהליך, כולל סוכנים אקסוגניים כגון קרינה מייננת, וכתוצר לוואי של חילוף חומרים בתאים נורמלים, כגון deamination הספונטני של בסיסי נוקלאוטיד או נזק המתרחשים על ידי מגע עם מיני חמצן תגובתי 1.

למרות שתאי יונקים יש מגוון של פעילויות תיקון שיכול להפוך נזק לדנ"א או לשחזר את הרצף באתרי הפסקה, מוטציות בכל זאת לצבור לכל אורך חייו של תא. נזק לדנ"א יכול יתר על כן תורם להזדקנות ואובדן העוצמה של תאי גזע, שני תהליכים הקשורים למחלות הקשורות להזדקנות 2. הבנת התיקון של נזק לדנ"א לכן חשיבות מרכזית בהתמודדות שני סימןנושאי ificant בבריאות הציבור. ראיות מצביעות על כך שהגדלת מסלולי תיקון דנ"א של יונקים יכולים לתרום להתפתחות של הגנום של התאים הסרטניים 3,4, מה שהופך את זה אפילו יותר הכרחי כדי להבין את התהליכים מעורבים בדיכוי מוטציה ברמה המולקולרית.

להדמיה ישירה של סטיות כרומוזום היא אמצעי רב עוצמה וכמותי של קביעת ההיקף של חוסר יציבות גנומית בסוג תא מסוים. כרומוזומים תמצית מהתאים בmetaphase יכולים להיות מבודדים ובדקו באמצעות אור או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גישות ציטוגנטית כאלה כבר בפועל במשך כמה עשורים וניתן להשתמש בו כדי להדגים את המראה של טרנסלוקציות או סוגים מסוימים של סטיות כרומוזום קשורות לאובדן של פעילות תיקון DNA. הפרוטוקול משאיל את עצמו לכמה סיומות אפשריות: יכולים להיות מתויג כרומוזומים עם בדיקות לkaryotyping רפאים (SKY) או ניאון ססגוניות הכלאה באתר(MFISH) לזהות טרנסלוקציות 5,6. טכניקות אלו מאפשרות גם את התדירות של טרנסלוקציות כרומוזום והמבנה של טרנסלוקציות כרומוזום המורכבת שייקבע, אשר מספק מידע נוסף מעבר למה שאפשרי עם פרוטוקול זה. לחלופין, יכולות להיות שנוצרו בדיקות רצף ספציפי ומשמשות לבדיקת התדירות של שבירת הדנ"א באתרים הגנומי נבחרו 7.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים הכנה של כרומוזום metaphase מתפשטת מלימפוציטים מסוג B. בדיקה פפטיד fluorescently שכותרתו חומצות גרעין (PNA) לחזרות telomeric משמשת, אשר יעילות מסמנת הטלומרים בכרומוזום metaphase מתפשט פרוטוקול זה יש מספר יתרונות. יכולים להיגרם תאי B לצמוח במדד המיטוטי גבוה, כך שאופן עקבי ניתן להפיק מרווחים גבוהה באיכות. תאי B מעכברים גנטי שונה הם הרבה פחות סביר שיכילו מוטציות גנטיות משניים שיכול לבלבל את הניתוח של התרומה גםשל גנים ספציפיים לשלמות הגנום. גישת PNA-FISH ניתן להשלים ביום אחד, ומאפשרת ניקוד מדויק יותר של הפסקות כרומוזום. על ידי שימוש בגישה זו, במיוחד בשילוב עם ציוד ספציפי שתואר בפרוטוקול זה, ניתן לייצר מרווחים מאוד עקביים, באיכות גבוהה ובמהירות לנתח את השיעור והסוג של חוסר יציבות גנומית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

נוהל זה אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת רטגרס, אוניברסיטת ניו ג'רזי המדינה. טופלו עכברים בהתאם למדריך NIH לטיפול והשימוש בחי מעבדה. מדענים צריכים להתייעץ ארגוני בעלי החיים הלאומיים ומוסדיים שלהם להנחיות שנקבעו ואושרו.

לפני תחילת, להכין את הפתרונות מפורטים בטבלה 1.

בידוד תא 1 B והפעלה

להרדים עכבר באמצעות CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. מקם את העכבר כל כך בצד השמאל של הגוף הוא למעלה ולרסס את העכבר עם אתנול 70% עד הפרווה לחה. לנתח את הטחול ומניחים בצלחת תרבית רקמת 35 מ"מ עם חיץ לשטוף 2 מ"ל. בזרימה למינרית, בעדינות לשבור את הטחול בצלחת תרבית רקמה באמצעות הקצה השטוח של מזרק 5 מ"ל.

  1. הכנס רשת ניילון 70 מיקרומטר ל50צינור מ"ל ולהעביר את דגימת הטחול ב2 מ"ל חיץ לשטוף לרשת הניילון. בעדינות לשבש את הטחול ברשת באמצעות הקצה השטוח של המזרק.
  2. יש לשטוף את הגב של המזרק וצלחת 35 מ"מ עם 8 מ"ל של חיץ לשטוף ולסנן דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C..
  3. לשאוב ולזרוק supernatant וresuspend גלולה ב 3 מ"ל של חיץ תמוגה ACK. פיפטה למעלה ולמטה לזמן קצר לשבש גושים ודגירה של 5 דקות. הוסף 10 מ"ל של חיץ לשטוף ו צנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C..
  4. לשאוב ולזרוק supernatant ו resuspend את הכדור על ידי הקשה על החלק התחתון של הצינור ולאחר מכן על ידי pipetting ב 1 מ"ל של חיץ לשטוף. הוסף 50 μl של מיקרו חרוזים אנטי CD43 MACS ולדגור על קרח למשך 30 דקות. הוסף 10 מ"ל של חיץ לשטוף, מערבב בעדינות, וצנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. הוסף 10 מ"ל של חיץ לשטוף, מערבב בעדינות, וצנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C..
  5. הגדר אתMini-MACS טור על ידי הצבת עמודה על מגנט MACS. מקם צינור חרוטי 15 מ"ל שכותרת מתחת לעמודה. הוסף 1 מ"ל של חיץ לשטוף לעמודה ולאפשר לרוץ דרך צינור 15 מ"ל.
  6. לשאוב supernatant וגלול ב 1 מ"ל של חיץ לשטוף. טען את המדגם בעמודה לאחר לשטוף החיץ יש להפעיל דרך.
  7. אחרי המדגם לרוץ דרך העמודה, להוסיף למאגר לשטוף 1 מ"ל לשטוף את העמודה. הוסף 7 מ"ל של חיץ לשטוף ישירות למדגם שנאסף בצינור 15 מ"ל.
  8. ספירת התאים באמצעות hemocytometer. העבר את הנפח הנדרש של תאים דרושים ל5,000,000 תאים / היטב לתוך צינור 50 מ"ל. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. בינוני תא B מוסף עם 1 LPS: 500 וIL4 1: 1,000.
  9. לשאוב supernatant ולהוסיף הנפח המתאים של מדיום תא B בתוספת הדרושה לריכוז סופי של 1,000,000 תאים / מ"ל.
  10. פלייט תאים ב6 צלחות גם עם 5 מ"ל של תאים ב1,000,000 תא / מ"ל ​​והמקום בhumidifiתרבית תאי חממת ed על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.

קיבוע תא .2 B

  1. הוסף 50 μl של colcemid לC גם מכיל 5 מ"ל של תאי B (לריכוז סופי של 100 ng / ml) ו דגירה שעה 1 ב37 מעלות. 75 פתרון מ"מ KCl Prewarm באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. העבר את תאי B לצינור 15 מ"ל שכותרת. כסה את התווית עם קלטת ו צנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C..
  2. לשאוב supernatant עוזב 1 מ"ל בצינור וresuspend גלולה ידי pipetting. הוסף 5 מ"ל של ירידת KCl prewarmed על ידי ירידה בזמן הקשה או פועם במערבולת.
  3. הוסף 10 מ"ל של KCl ומערבבים על ידי היפוך. דגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הוסף 5 טיפות של מקבע ותערובת טריות על ידי היפוך. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. לשאוב supernatant עוזב 1 מ"ל בצינור וresuspend גלולה ידי pipetting למעלה ולמטה.
  4. הוסף 5 מ"ל של טיפה מקבע טרי על ידי ירידה בזמן הקשה או פועם בvorטקס. הוספה נוסף 10 מ"ל של מקבע ודגירת 30 דקות בטמפרטורת חדר.
  5. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. לשאוב supernatant עוזב 1 מ"ל בצינור וגלול על ידי pipetting. הוספת 14 מ"ל של מקבע ו צנטריפוגות הטריים XG 300 10 דקות ב 4 ° C..
  6. חזור על שלב 2.7 עוד פעמיים.
  7. הוספת 14 מ"ל של מקבע טרי. חותם את הכובעים עם Parafilm ולאחסן לילה בשעה -20 מעלות צלזיוס.

.3 הכנת ממרחי כרומוזום Metaphase

  1. להגדיר תא סביבתי מוסדר ל22.9 ° C ו52% לחות.
  2. צנטריפוגה קבועה תאי B XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. לשאוב מקבע עוזב 70 μl בצינור והגלול על ידי pipetting.
  3. הנח שקופיות שכותרתו בתא לחות בזווית 35 °. זרוק 35 μl של תאי B resuspended לשקופית ושחרר שתי שקופיות לדגימה. אפשר השקופיות לייבוש בתא לחות למשך 30 דקות לאחר מכן לאחסן את השקופיותבתיבת שקופיות על 37 C °.

FISH .4 הטלומרים הרשות הפלסטינית

  1. הכנת Probe
    1. פוראמיד deionized טרום חם ל37 מעלות צלזיוס. לערבב 2 μl של בדיקה הרשות הפלסטינית הטלומרים עם פוראמיד מראש חימם 7 μl deionized ולדגור על 37 ° C עם רעד במשך שעה 1.
    2. תערובת אב FISH טרום חמה ל37 מעלות צלזיוס. להוסיף 7 μl תערובת אב FISH מראש חיממה לתערובת משלב 4.1.1 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1-3 שעות.
    3. לפגל תערובת הבדיקה במשך 8 דקות על 80 מעלות צלזיוס. טרום לחשל את החללית לשעה 1 ב37 מעלות צלזיוס.
  2. טיפול מקדים של שקופיות כרומוזום
    1. טרום חם צנצנת שקופית מכתימה זכוכית המכילה 50 מ"ל של 0.01 M HCl ל37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
    2. מגלשות מקום בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית שונה המכילה 2x SSC למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
    3. הוסף 2 μl של מניית פפסין לצנצנת שקופית המכתימה הזכוכית מחוממת מראש ומערבבים על ידי היפוך. העברת שקופיות sl זכוכית זהצנצנת ide-מכתים ודגירה 90 שניות על 37 מעלות צלזיוס.
    4. שטוף את השקופיות 2x בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית שונה המכילה 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד בטמפרטורת חדר, רועדת. לאחר מכן לשטוף את השקופיות עבור 5 דקות ב1x PBS / MgCl 2 בטמפרטורת חדר, רועד.
    5. העברת השקופיות לצנצנת שקופית מכתימה זכוכית המכילה פורמלדהיד 1% המוכנים טרי / 1x PBS / MgCl 2 ל10 דקות בטמפרטורת חדר.
    6. שטוף את השקופיות עבור 5 דקות בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית שונה המכילה 1x PBS בטמפרטורת חדר, רועד.
    7. הכן סדרת התייבשות אתנול על ידי בעל צנצנות שקופית מכתימה זכוכית נפרדת המכילות 70%, 90%, ו100% אתנול.
    8. העברת השקופיות לכל צנצנת במשך 3 דקות, מתחילה עם 70% אתנול, ולאחר מכן 90% אתנול, ולאחר מכן 100% אתנול. מניחים צנצנות אתנול ב -20 מעלות צלזיוס, כאשר סיימו.
    9. אפשר שקופיות לייבוש באוויר על ידי הקשה אתנול עודף על מגבת נייר והשעין שקופיות בזווית 35 °. ברגע שיבש, maRK אזור 18 x 18 מ"מ להכלאה על הגב של השקופיות באמצעות עט יהלומים.
  3. Denaturation של שקופיות לדגים
    1. החל פוראמיד 120 μl 70% deionized / 2X SSC לcoverslip 24 x 60 מ"מ. לגעת בשקופיות לcoverslip. לפגל שקופיות על 80 מעלות צלזיוס על פלטה חשמלית ל90 שניות.
    2. במהירות ובזהירות להחליק את coverslip ולמקם את השקופית באתנול 70% קרים כקרח במשך 3 דקות, ואחריו 90% אתנול, ו100 אתנול% כל אחד במשך 3 דקות. אפשר שקופיות לייבוש באוויר.
    3. הכן תא לח על ידי המצפה קופסא פלסטיק עם מכסה הדוק ונייר טישו רטוב. הנייר צריך להיות לח, אבל לא רווי במים.
    4. בתא לח, להחיל את תערובת בדיקה-מרותק מראש מצעד 4.1.3 לאזור המסומן בשקופית, מכסה בכיסוי מ"מ תלוש 18 x 18 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  4. רוחצת הודעה דגירה
    1. פוראמיד 50% טרום חם / 2x SSC, 1x SSC, ו4x SSC / 0.1% Tween-20 ב45 °; C אמבט מים.
    2. מוציא בזהירות את coverslips ולשטוף את השקופיות ב50% פוראמיד דקות 3xfor 5 / 2x SSC מראש חימם כל אחד בחושך ורועד. שטוף את השקופיות בSSC 1x מראש חימם 3xfor 5 דקות כל אחד, רועדים. לבסוף, לשטוף את השקופיות במחוממים מראש 4x SSC / 0.1% דקות Tween-20 3xfor 5 כל אחד.
    3. כתם השקופיות עבור 3 דקות בDAPI בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית אור מוגנת.
    4. שטוף את השקופיות עבור 5 דקות ב2x SSC, רועדים. החל 35 μl של הרכבה בינונית Mowiol, מכסה ב24 x 60 coverslips מ"מ ולאחסן את השקופיות ב 4 ° C..

.5 ניתוח מיקרוסקופי של כרומוזומים

  1. לנתח את שקופיות metaphase באמצעות מיקרוסקופ עלית הקרינה סטנדרטי. השתמש בפלטפורמת הדמיה עם שלב אוטומטי כגון פלטפורמת MetaSystems Metafer כדי להשיג תוצאות הטובות ביותר. לכל התפשטות metaphase, לאסוף תמונה אחת לקרינת DAPI לדמיין כרומוזומים, ותמונה אחת לאות הניאון מp הטלומריםגלימה. (לדוגמא, fluors האחר Cy3- זמין ולעבוד באותה מידה גם.)
  2. כיסוי התמונות עם תכנית ניתוח תמונה ולנתח.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כרומוזומים Metaphase נגזרים מתא אחד צריכים ליצור אשכול דיסקרטי המכיל 40 הכרומוזומים (אם שימוש בתאי עכבר) (איור 1 א). לכל כרומוזום centromere בקצה אחד, שהוא נראה כמו כדור אור כחול. בכרומוזומים רגילים, שני אותות הטלומרים נראים בסוף chromatids ושני אותות על ידי כל אחד centromere. גרעי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ואילו לימפוציטים מסוג B מופעלים מתאימים במיוחד להכנת ממרחי כרומוזום mitotic, יכולים לשמש גם סוגי תאים אחרים. לימפוציטים מסוג T חולקים הרבה מהיתרונות של תאי B, כפי שהם יכולים להיות מטוהרים מבלוטות הטחול או לימפה, ויש לי מדד גבוה המיטוטי כאשר מגורה על ידי צמיחה במדיום המכיל ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

אי לנו אינטרסים מנוגדים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NIH המענק R00 CA160574 (SFB) ועל ידי מענק של תכנית רטגרס ביוטכנולוגיה ההדרכה (לSMM).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
50% Dextran sulfateIntergenS4030
Deionized formamideAmbion9342
Pepsin (5 g)SigmaP 6887 
FCSGemini100-106
LPS (100 mg)SigmaL2630
IL-4 (5 μg)SigmaI1020
PNA Telomere ProbePNA Bio IncF1002(CCCTAACCCTAACCCTAA)
ColcemidRoche295892
Mowiol 4-88Sigma81381-50g
CD43 (ly-48_) micro-beadsMiltenyl Biotec.130-049-801
DAPISigma32670-5MG
Eclipse E800Nikon
AxioImager.Z2Zeiss
CDS-5 Cytogenetic Drying ChamberThermotron

References

  1. Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
  2. Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer. Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).
  3. Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
  4. Bunting, S. F., et al. 53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks. Cell. 141 (2), 243-254 (2010).
  5. Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).
  6. Callen, E., et al. Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG. Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).
  7. Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70. Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).
  8. Benn, P., Delach, J. Human lymphocyte culture and chromosome analysis. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
  9. Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
  10. Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, Curr Protoc Hum Genet. (2001).
  11. Gilley, D., et al. DNA-PKcs is critical for telomere capping. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).
  12. Bolzan, A. D. Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences. Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).
  13. Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations. Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).
  14. Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, Curr Protoc Cell Biol. (2001).
  15. Morales, J. C., et al. 53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).
  16. Halaby, M. J., et al. Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis. PLoS Genet. 9 (1), e1003259(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Erratum


Formal Correction: Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH. Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:

SolutionReagentsCommentsStorage
B Cell Wash Buffer500 ml 1x Hanks Balanced Salt SolutionFilter through 0.22 μm stericup filtration unit4 °C
5 ml 50 °C heat inactivated FCS
5 ml 100x Pen/Strep
B Cell Medium418.5 ml RPMI-1640Filter through 0.22 μm stericup filtration unit4 °C
50 ml 50 °C heat inactivated FCS
5 ml 100x Pen/Strep
5 ml glutamine
5 ml nonessential amino acids
5 ml sodium pyruvate
1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol
5 ml 1M HEPES
Fixative3:1 v/v methanol/glacial acetic acidMake fresh
0.075 M KCl1.395 g KClRoom Temperature
250 ml distilled H2O
FISH Master Mix40 ml 50% Dextran sulfateVortex the solution and leave in a shaking platform overnightAliquot and store at -20 °C
20 ml 20x SSC
40 ml sterile distilled H2O
70% Formamide/2x SSC10 ml 20x SSCAdjust to pH 7 with 1M HClAliquot and store at -20 °C
20 ml distilled H2O
70 ml deionized formamide
0.01 M HCl1 ml 1M HClAdjust to pH 2.0Room Temperature
99 ml distilled H2O
1x PBS/MgCl250 ml 1M MgCl2Room Temperature
950 ml 1x PBS
50% Formamide/2x SSC20 ml 20x SSCAdjust to pH 7.25
Formamide used in this step does not have to be deionized.		Make fresh
80 ml distilled H2O
100 ml formamide
4x SSC/0.1% Tween2050 ml 20x SSCRoom Temperature
200 ml distilled H2O
250 μl Tween20
DAPI staining solution (80 ng/ml)40 μl 0.2mg/ml DAPI stock4 °C in light protected staining jar
100 ml 2x SSC
Mowiol Mounting Medium6 g glycerolIncubate at 50 °C with stirring for 2hrsAliquot and store at 4 °C
2.4 g Mowiol 4-88
6 ml distilled H2O
12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5
230 μl 1% Thimerosal (w/v in water)

Table 1. List of solutions. 

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

90DNAmetaphaseFISH

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved