Análisis rápido de aberraciones cromosómicas en linfocitos B de ratón por PNA-FISH

Resumen

Vías de reparación del ADN son esenciales para el mantenimiento de la integridad genómica y la prevención de la mutación y el cáncer. El objetivo de este protocolo es cuantificar la inestabilidad genómica mediante la observación directa de las aberraciones cromosómicas en metafase se propaga a partir de células B de ratón utilizando hibridación in situ fluorescente (FISH) para las repeticiones teloméricas de ADN.

Resumen

Reparación del ADN defectuoso provoca un aumento de la inestabilidad genómica, que es la causa raíz de las mutaciones que conducen a la tumorigénesis. Análisis de la frecuencia y tipo de aberraciones cromosómicas en diferentes tipos de células permite defectos en las vías de reparación del ADN no se ha dilucidado. Entender la biología de reparación del ADN de los mamíferos se ha ayudado en gran medida por la producción de ratones con nocauts en genes específicos. El objetivo de este protocolo es cuantificar la inestabilidad genómica en los linfocitos B de ratón. Etiquetado de los telómeros con sondas PNA-FISH (ácido nucleico peptídico - hibridación fluorescente in situ) facilita el análisis rápido de la inestabilidad genómica en las extensiones de cromosomas en metafase. Células B tienen ventajas específicas relativas a los fibroblastos, porque tienen la ploidía normal y un índice mitótico superior. Cultivo a corto plazo de las células B, por tanto, permite la medición precisa de la inestabilidad genómica en una población celular primaria que es probable que tenga mutación genética secundaria menoss de lo que se encuentra típicamente en fibroblastos transformados o líneas de células de pacientes.

Introducción

El cáncer es causado por la acumulación de mutaciones que afectan a genes que regulan el crecimiento celular normal. La mutación es una consecuencia de cambios en la estructura y la secuencia del genoma causado por el daño al ADN. Daño del ADN puede ocurrir a través de una variedad de procesos, incluyendo agentes exógenos tales como la radiación ionizante y, como un subproducto del metabolismo celular normal, tales como desaminación espontánea de bases de nucleótidos o daños que se producen por el contacto con especies reactivas de oxígeno ^1.

Aunque las células de mamíferos poseen una gama de actividades de reparación que puede revertir el daño de ADN o restaurar la secuencia en los sitios de ruptura, sin embargo, las mutaciones se acumulan durante toda la vida de una célula. Daño del ADN puede contribuir además a senescencia y pérdida de potencia de las células madre, dos procesos que están asociados con la enfermedad de envejecimiento asociado ^2. La comprensión de la reparación del daño en el ADN es, por tanto, de vital importancia en el tratamiento de dos signocuestiones ificant en la salud pública. La evidencia creciente sugiere que las vías de reparación del ADN de mamíferos pueden contribuir a la evolución del genoma de células de cáncer ^3,4, lo que hace aún más imprescindible para entender los procesos implicados en la supresión de la mutación a nivel molecular.

La visualización directa de las aberraciones cromosómicas es un potente y cuantitativos medio de determinar el grado de inestabilidad genómica en un tipo de célula particular. Cromosomas condensados ​​a partir de células en metafase se pueden aislar e inspeccionados usando luz o microscopía fluorescente. Tales enfoques citogenéticos han sido en la práctica desde hace varias décadas y se pueden utilizar para demostrar la aparición de translocaciones o tipos específicos de aberraciones cromosómicas asociadas con la pérdida de las actividades de reparación del ADN. El protocolo se presta a varias prórrogas posibles: los cromosomas se pueden marcar con sondas para cariotipo espectral (SKY) o fluorescente multicolor de hibridación in situ(MFISH) para identificar las translocaciones ^5,6. Estas técnicas permiten también la frecuencia de las translocaciones cromosómicas y la estructura de las translocaciones cromosómicas complejas por determinar, que proporciona información adicional más allá de lo que es posible con este protocolo. Alternativamente, las sondas específicas de secuencia pueden ser generados y utilizados para probar la frecuencia de rotura del ADN en sitios genómicos seleccionados ^7.

En este protocolo, se describe la preparación de los cromosomas en metafase se propaga a partir de linfocitos B. Se utiliza un ácido nucleico (PNA) péptido-sonda marcada con fluorescencia para las repeticiones teloméricas, que marca de manera eficiente los telómeros en el cromosoma en metafase se extiende Este protocolo tiene varias ventajas. Las células B pueden ser inducidas a crecer a alto índice mitótico de modo que los diferenciales de alta calidad consistentemente pueden ser producidos. Células B de ratones genéticamente modificados son también mucho menos probable que contenga mutaciones genéticas secundarias que pueden confundir el análisis de la contribuciónde genes específicos a la integridad genómica. El enfoque PNA-FISH se puede completar en un día, y permite anotar más precisa de roturas cromosómicas. Mediante el uso de este enfoque, sobre todo en combinación con el equipo específico que se describe en este protocolo, es posible producir, los diferenciales de alta calidad muy consistentes y analizar rápidamente la velocidad y el tipo de inestabilidad genómica.

Protocolo

Este procedimiento fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en Rutgers, la Universidad Estatal de Nueva Jersey. Los ratones fueron tratados de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los científicos deberían consultar a sus organizaciones animalistas nacionales e institucionales de las normas establecidas y aprobadas.

Antes de comenzar, preparar las soluciones enumeradas en la Tabla 1.

Aislamiento Celular 1 B y Activación

La eutanasia a un ratón utilizando CO ₂ seguido por dislocación cervical. Coloque el ratón para que el lado izquierdo del cuerpo está en marcha y rociar el ratón con etanol al 70% hasta que la piel está húmeda. Diseccionar el bazo y el lugar en un 35 mm placa de cultivo de tejidos con tampón de lavado 2 ml. En una campana de flujo laminar, romper suavemente el bazo en la placa de cultivo de tejidos utilizando el extremo plano de una jeringa de 5 ml.

1. Inserte una malla de nylon de 70 micras en un 50tubo ml y transferir la muestra de bazo en 2 ml de tampón de lavado al interior de la malla de nylon. Interrumpir suavemente el bazo en la malla utilizando el extremo plano de la jeringa.
2. Enjuague la parte posterior de la jeringa y la placa de 35 mm con 8 ml de tampón de lavado y filtrado a través de la malla de nylon 70 micras. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
3. Aspirar y desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 3 ml de tampón de lisis ACK. Pipetear hacia arriba y abajo para interrumpir brevemente montones e incubar durante 5 min. Añadir 10 ml de tampón de lavado y se centrifuga a 300 g durante 10 min a 4 ° C.
4. Aspirar y desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado tocando el fondo del tubo y luego con la pipeta en 1 ml de tampón de lavado. Añadir 50 l de anti-CD43 MACS micro-cuentas e incubar en hielo durante 30 min. Añadir 10 ml de tampón de lavado, mezclar suavemente y centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Añadir 10 ml de tampón de lavado, mezclar suavemente y centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
5. Establecer unColumna Mini-MACS mediante la colocación de una columna en el imán MACS. Coloque un tubo cónico de 15 ml etiquetados bajo la columna. Añadir 1 ml de tampón de lavado a la columna y dejar correr a través de al tubo de 15 ml.
6. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de tampón de lavado. Cargar la muestra en la columna después el tampón de lavado se ha ejecutado a través.
7. Después de que la muestra ha ejecutar a través de la columna, añadir 1 ml de tampón de lavado para lavar la columna. Añadir 7 ml de tampón de lavado directamente a la muestra recogida en el tubo de 15 ml.
8. Contar las células utilizando un hemocitómetro. Transferir el volumen requerido de células necesarias para 5.000.000 células / pocillo en un tubo de 50 ml. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Suplemento medio de células B con LPS 1: 500 y 1 IL4: 1000.
9. Aspirar el sobrenadante y añadir el volumen apropiado de medio de células B suplementado necesaria para la concentración final de 1.000.000 células / ml.
10. Células de la placa en placas de 6 pocillos con 5 ml de células a 1.000.000 de células / ml y colocar en un humidified incubadora de cultivo celular a 37 ° C, 5% de CO _2.

Fijación Cell 2 B

1. Añadir 50 l de colcemid al pozo que contiene 5 ml de las células B (para una concentración final de 100 ng / ml) y se incuba 1 hora a 37 ° C. Precalentar 75 mM KCl solución en un baño a 37 ° C. Transferencia de las células B a un tubo de 15 ml etiquetados. Cubra la etiqueta con cinta y centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
2. Aspirar el sobrenadante dejando 1 ml en el tubo y resuspender el pellet mediante pipeteo. Añadir 5 ml de la caída de KCl precalentado a gota mientras golpea o pulsante en un vórtice.
3. Añadir 10 ml de KCl y mezclar invirtiendo. Incubar en un 37 ° C baño de agua durante 15 min. Añadir 5 gotas de fijador fresco y mezcla por inversión. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante dejando 1 ml en el tubo y resuspender el pellet pipeteando arriba y abajo.
4. Añadir 5 ml de fijador fresco gota a gota mientras golpea o pulsante en un vortex. Añadir otros 10 ml de fijador y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente.
5. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante dejando 1 ml en tubo y resuspender con la pipeta. Añadir 14 ml de fijador fresco y centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
6. Repita el paso 2.7 en dos ocasiones más.
7. Añadir 14 ml de fijador. Selle los tapones con Parafilm y almacenar toda la noche a -20 ° C.

3 Preparación de las extensiones de cromosomas en metafase

1. Establezca una cámara ambiental regulada a 22,9 ° C y 52% de humedad.
2. Centrifugar las células B fijado a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar fijador dejando 70 l en el tubo y resuspender mediante pipeteo.
3. Coloque las diapositivas marcadas en la cámara de humedad en un ángulo de 35 °. Gota 35 l de las células B resuspendidas en un portaobjetos y soltar dos portaobjetos por muestra. Deje que los portaobjetos se sequen en la cámara de humedad durante 30 minutos y luego guardar las diapositivasen una caja de portaobjetos a 37 ° C.

4. telómeros PNA FISH

1. Preparación de la sonda
   1. Pre-caliente formamida desionizada a 37 ° C. Mezclar 2 l de sonda de APN de los telómeros con 7 l de formamida desionizada precalentada y se incuba a 37 ° C con agitación durante 1 hr.
   2. Pre-caliente mezcla maestra FISH a 37 ° C. Añadir 7 l precalentado mezcla maestra FISH a la mezcla del paso 4.1.1 y se incuba a 37 ° C durante 1-3 horas.
   3. Desnaturalizar la mezcla de la sonda durante 8 minutos a 80 ° C. Pre-hibridar la sonda durante 1 hora a 37 ° C.
2. Pretratamiento de portaobjetos cromosómicos
   1. Pre-calentar un tarro de cristal deslizable tinción que contiene 50 ml de HCl 0,01 M a 37 ° C en un baño de agua.
   2. Colocar los portaobjetos en un tarro de cristal deslizable tinción diferente que contiene 2x SSC durante 5 min a temperatura ambiente.
   3. Añadir 2 l de pepsina de stock al vidrio precalentado slide-tinción frasco y mezclar invirtiendo. Transferir las diapositivas a este sl vidriojar ide-tinción e incubar 90 segundos a 37 ° C.
   4. Lave las diapositivas 2x en un frasco de vidrio deslizable tinción diferente que contiene 1x PBS durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente, agitando. A continuación, lavar los portaobjetos durante 5 minutos en 1x PBS / _MgCl2 a temperatura ambiente, agitando.
   5. Transferir los portaobjetos a un tarro de cristal deslizante de tinción recién preparada que contenía 1% de formaldehído-/ 1x PBS / MgCl $ ₂ durante 10 min a temperatura ambiente.
   6. Lavar los portaobjetos durante 5 minutos en un frasco de vidrio deslizable tinción diferente que contiene 1x PBS a temperatura ambiente, agitando.
   7. Preparar una serie de deshidratación de etanol por tener vidrio separada frascos de deslizamiento de tinción que contienen 70%, 90% y 100% de etanol.
   8. Transferir los portaobjetos a cada frasco durante 3 min, empezando con etanol al 70%, luego 90% de etanol, y luego etanol al 100%. Coloque los tarros de etanol a -20 ° C cuando haya terminado.
   9. Permitir las diapositivas se sequen al aire tocando el exceso de etanol en una toalla de papel y apuntalar las diapositivas en un ángulo de 35 °. Una vez seco, mark un área de 18 x 18 mm para la hibridación en la parte posterior de las diapositivas utilizando una pluma de diamante.
3. La desnaturalización de las diapositivas para FISH
   1. Aplicar formamida 120 l 70% desionizada / 2X SSC a un cubreobjetos de 24 x 60 mm. Toca la diapositiva a la cubreobjetos. Desnaturalizar la diapositiva a 80 ° C en una placa caliente durante 90 segundos.
   2. Rápida y cuidadosamente deslice el cubreobjetos y colocar el portaobjetos en hielo frío etanol al 70% durante 3 min, seguido de etanol 90% y etanol al 100% durante 3 min cada uno. Permitir las diapositivas se sequen al aire.
   3. Preparar una cámara húmeda por el forro una caja de plástico con tapa hermética y un pañuelo de papel mojado. El papel debe estar húmedo, pero no saturado con agua.
   4. En una cámara húmeda, aplique la mezcla de sondas pre-recocido desde el paso 4.1.3 a la zona marcada en el portaobjetos, cubra con una tapa deslizante mm 18 x 18 y se incuba a 37 ° C durante 1 hora.
4. Los lavados post-incubación
   1. Pre-caliente 50% de formamida / SSC 2x, 1x SSC, y 4x SSC / 0,1% de Tween-20 en unos 45 °; C baño de agua.
   2. Retire con cuidado el cubreobjetos y lavar los portaobjetos en pre-calentado 50% formamida / 2 × SSC 3xfor 5 minutos cada uno en la oscuridad y temblando. Se lavan los portas en pre-calentado 1x SSC 3xfor 5 minutos cada uno, temblando. Finalmente, lavar los portaobjetos en pre-calentado 4x SSC / 0,1% de Tween-20 3xfor 5 min cada uno.
   3. Teñir las diapositivas durante 3 min en DAPI en una luz protegida vidrio deslizable tinción frasco.
   4. Lavar los portaobjetos durante 5 minutos en 2x SSC, temblando. Aplique 35 l de medio de montaje Mowiol, cubrir con 24 x 60 mm cubreobjetos y almacenar las diapositivas a 4 ° C.

5. microscópica Análisis de Cromosomas

1. Analizar las diapositivas en metafase utilizando un microscopio de epi-fluorescencia estándar. Utilice una plataforma de imágenes con una etapa automatizada como la plataforma MetaSystems Metafer para obtener mejores resultados. Para cada extensión metafase, recoger una imagen de fluorescencia DAPI para visualizar los cromosomas, y una imagen de la señal fluorescente del telómero pbata. (Por ejemplo, Cy3 otros compuestos fluorescentes están disponibles y funcionan igual de bien.)
2. Superposición de las imágenes con un programa de análisis de imagen y analizar.

Resultados

Los cromosomas en metafase de una célula derivados deben formar un clúster discreta que contiene 40 cromosomas (si usando células de ratón) (Figura 1A). Cada cromosoma tiene un centrómero en un extremo, que es visible como una esfera de color azul claro. En cromosomas normales, dos señales de los telómeros son vistos en el extremo de las cromátidas y dos señales por cada centrómero. Núcleos en interfase estarán presentes en la diapositiva también. Estos serán visibles como esferas azul, co...

Discusión

Mientras que los linfocitos B activados son particularmente adecuados para la preparación de extensiones de cromosomas mitóticos, también se pueden utilizar otros tipos de células. Linfocitos T compartir muchas de las ventajas de las células B, ya que pueden ser purificados a partir de los nodos de bazo o de los ganglios, y tienen un alto índice mitótico cuando son estimuladas por el crecimiento en medio que contiene mitógenos apropiados ^8. Las células madre embrionarias (células ES) también son ad...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
50% Dextran sulfate	Intergen	S4030
Deionized formamide	Ambion	9342
Pepsin (5 g)	Sigma	P 6887
FCS	Gemini	100-106
LPS (100 mg)	Sigma	L2630
IL-4 (5 μg)	Sigma	I1020
PNA Telomere Probe	PNA Bio Inc	F1002	(CCCTAACCCTAACCCTAA)
Colcemid	Roche	295892
Mowiol 4-88	Sigma	81381-50g
CD43 (ly-48_) micro-beads	Miltenyl Biotec.	130-049-801
DAPI	Sigma	32670-5MG
Eclipse E800	Nikon
AxioImager.Z2	Zeiss
CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber	Thermotron