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Erratum Notice

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요약

DNA 수리 경로는 게놈 무결성의 유지 보수 및 예방 돌연변이 및 암 필수적이다. 이 프로토콜의 목적은 중기는 텔로미어 DNA 반복위한 원위치 혼성화 (FISH)에 형광체를 사용하여 마우스 B 세포로부터 확산에 염색체 이상을 직접 관찰하여 게놈 불안정성을 정량화하는 것이다.

초록

결함 DNA 수리 종양 이어질 돌연변이의 근본 원인 인 게놈 불안정성을 증가하도록 이끈다. 상이한 세포 유형에서 주파수 및 염색체 이상 유형의 분석은 DNA 복구 경로의 결함은 해명 할 수있다. 이해 포유 동물 DNA 수리 생물학이 크게 특정 유전자 녹아웃 생쥐의 생산에 도움이되고있다. 이 프로토콜의 목적은 마우스 B 림프구에서 게놈의 불안정성을 정량화하는 것이다. PNA-FISH 프로브 (펩티드 핵산 - 시츄 혼성화 형광)을 사용 텔로미어의 레이블링은 중기 염색체 스프레드 게놈 불안정성의 신속한 분석을 용이하게한다. 그들은 정상 배수성과 높은 유사 분열 인덱스를 가지고 있기 때문에 B 세포는 섬유 아세포에 비해 특정 장점을 가지고있다. B 세포의 단기 문화 따라서 적은 보조 유전자 변이를 가질 가능성이 차 세포​​ 인구에 게놈 불안정성의 정확한 측정을 가능하게일반적으로 형질 전환 된 섬유 아세포 또는 환자의 세포 라인에있는 것보다의.

서문

암은 정상 세포의 성장을 조절하는 유전자에 영향을 미치는 돌연변이의 축적에 의해 발생합니다. 돌연변이 DNA의 손상에 의해 야기 게놈의 구조 및 서열에 대한 변경의 결과이다. DNA 손상 등의 전리 방사선 등 외인성 제제를 포함한 프로세스의 다양한 등을 통해 발생할 수있는 등의 활성 산소 종 (1)과 접촉하여 발생하는 뉴클레오티드 염기 또는 손상의 자발적인 탈 아미 노화 정상적인 세포 대사의 부산물로서.

포유 동물 세포가 DNA 손상 또는 역방향 브레이크 사이트의 시퀀스를 복원 할 수있는 보수 활동의 범위를 갖고 있지만, 그럼에도 불구하고 돌연변이 세포의 수명에 걸쳐 축적. DNA 손상은 또한 노화 - 관련 질환과 연관된 2 개의 프로세스를 노화 및 줄기 세포의 효능의 손실에 기여할 수있다. 이 응답을 어드레스에 따라서 중앙 중요성 DNA 손상의 복구된다 이해공중 보건 ificant 문제. 증거가 증가 포유류의 DNA 복구 경로가 더욱 필수적 돌연변이 분자 수준에서의 억제에 관여하는 과정을 이해하는 데있어 암세포 3,4 게놈의 발전에 기여할 수 있음을 시사한다.

염색체 이상을 직접 시각화는 특정 세포 유형에서 게놈의 불안정성의 정도를 판정하는 강력한 양적 수단이다. 중기에서 세포로부터 연유 염색체 분리 및 광 또는 형광 현미경을 사용하여 검사 될 수있다. 이러한 유전 학적 접근은 수십 년 동안 실제로 왔고 전좌 또는 DNA 복구 활동의 손실과 관련된 염색체 이상 특정 유형의 모양을 보여주기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 몇 가지 잠재적 인 확장에 빌려 준다 : 염색체가 현장 하이브리드의 스펙트럼 핵형 (SKY) 또는 여러 가지 빛깔의 형광에 대한 프로브를 표시 할 수(mFISH)는 전좌 5,6를 식별합니다. 이러한 기술은 또한이 프로토콜 가능합니다 것 이상으로 추가 정보를 제공 염색체 전좌의 빈도와 결정 복잡한 염색체 전좌의 구조를 가능하게한다. 대안 적으로, 특정 프로브 시퀀스가 생성되고 선택된 사이트 7 게놈 DNA에서 파손의 주파수를 테스트하는데 사용될 수있다.

이 프로토콜에서는, 우리는 중기 염색체의 준비가 B 림프구에서 확산에 대해 설명합니다. 텔로미어 반복하는 형광 표지 된 펩티드 핵산 (PNA) 프로브를 효율적으로 중기 염색체에 텔로미어를 표시하는 데 사용되는이 프로토콜은 몇 가지 장점이 펼쳐집니다. B 세포는 높은 품질의 퍼짐 일관 제조 할 수 있도록 높은 유사 분열 지수 성장하도록 유도 될 수있다. 유전자 변형 마우스의 B 세포도 훨씬 덜 기여의 분석을 혼동 할 수 있습니다 차 유전 변이를 포함 할 가능성이있다게놈 무결성의 특정 유전자. PNA-FISH 방법은 하루에 완료하고, 염색체 휴식의보다 정확한 득점을 허용 할 수 있습니다. 특히 이런 프로토콜에 기재된 특정 장비와 함께,이 방법을 사용함으로써, 매우 일관된 고품질의 퍼짐을 생성하고 신속 레이트 및 게놈 불안정성의 유형을 분석 할 수있다.

프로토콜

이 절차는 럿 거스에서 기관 동물 관리 및 사용위원회, 뉴저지 주립 대학에 의해 승인되었습니다. 마우스는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 처리 하였다. 과학자들은 설립 승인 지침은 자신의 국가 및 기관 동물 조직을 문의해야합니다.

시작하기 전에 표 1에 나와있는 솔루션을 준비합니다.

1 B 세포의 분리 및 활성화

경추 탈구이어서 CO 2를 사용하여 마우스를 안락사. 몸의 왼쪽면이 위로 오도록 마우스를 위치시키고 모피에 습기가 될 때까지 70 % 에탄올로 마우스를 스프레이. 2 ML 세척 버퍼를 가지는 35mm 조직 배양 접시에 비장과 장소를 해부하다. 층류 후드에서 조심스럽게 5 ㎖ 주사기의 평평한 단부를 이용하여 조직 배양 접시에 비장을 분쇄.

  1. 50에 70 μm의 나일론 메쉬 삽입ML 튜브 및 나일론 메쉬로 2 ml의 세척 완충액에서 비장 샘플을 전송. 조심스럽게 주사기의 평평한 끝 부분을 사용하여 메쉬에서 비장을 방해.
  2. 세척 버퍼의 8 mL를 주사기의 뒷면 35mm 판을 씻어 70 μm의 나일론 메쉬를 필터링 할 수 있습니다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기.
  3. 기음은 상층 액을 제거하고 ACK 용해 버퍼의 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁합니다. 대단히 짧은 시간을 방해하고 5 분 동안 배양 아래로 간단히를 피펫. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세척 버퍼와 원심 분리기 10 ML을 추가합니다.
  4. 대기음 상층 액을 제거하고 세척 완충액 1 ㎖에 피펫 팅 한 후 튜브의 바닥을 터치하여 펠렛을 재현 탁하고. 항-CD43 MACS 마이크로 비즈의 50 μl를 추가하고 30 분 동안 얼음에 품어. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에, 세척 버퍼의 10 ML을 추가 부드럽게 섞어 원심 분리기. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에, 세척 버퍼의 10 ML을 추가 부드럽게 섞어 원심 분리기.
  5. 설정MACS 자석에 열을 배치하여 미니-MACS 열입니다. 열 아래 표시된 15 ML 원뿔 튜브를 배치합니다. 열 세척 버퍼의 1 ML을 추가하고 15 ML 튜브를 통해 실행할 수 있습니다.
  6. 세척 완충액 1 ㎖에 재현 탁하고 상등액을 기음. 세척 버퍼를 통해 실행 후 열에서 샘플을로드합니다.
  7. 샘플이 칼럼을 통해 실행 된 후, 열을 씻어 1 ML 세척 버퍼를 추가합니다. 직접 15 ML 튜브에 수집 된 샘플에 세척 버퍼의 7 ML을 추가합니다.
  8. 혈구를 사용하여 세포를 카운트. 50 ㎖의 튜브에 / 웰 5,000,000 세포에 필요한 세포의 필요한 양을 전송. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. LPS 1과 부록 B 세포 배지 : 500 IL4 일 : 1000.
  9. 상등액을 흡인하고 백만 세포 / ml의 최종 농도에 필요한 보충 된 B 세포 배지의 양을 적절한 추가.
  10. humidifi 1,000,000 세포 / ㎖과 장소에서 세포 5 ㎖를 6 - 웰 플레이트에서 플레이트 세포37 ° C에서 에드 세포 배양 인큐베이터, 5 % CO 2.

2 B 세포 고정

  1. 잘 (100 NG / ㎖의 최종 농도) B 세포의 5 mL를 함유하고 37 ℃에서 1 시간 배양 C에 colcemid의 50 μl를 추가합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 Prewarm 75 밀리미터의 KCl 솔루션입니다. 레이블이 15 ML 튜브로 B 세포를 전송합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 테이프와 원심 분리기와 레이블을 커버.
  2. 튜브에 1 ㎖에 떠나는 뜨는을 기음과 피펫으로 펠렛을 재현 탁. 누르거나 소용돌이에 펄스 동안 드롭에 의해 데워진의 KCl 드롭의 5 ML을 추가합니다.
  3. KCl을 10 ㎖를 추가하고 반전 섞는다. 15 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 품어. 반전 신선한 정착과 혼합 5 방울을 추가합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 로 pipetting 아래로 튜브에 resuspend 펠렛 1 ML을 떠나 뜨는을 대기음.
  4. 누르거나 보르에 펄스 동안 드롭으로 신선한 정착액 드롭의 5 ML을 추가텍스. 정착액의 추가 10 mL를 넣고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
  5. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 피펫 팅 튜브에 resuspend 1 ML을 떠나 뜨는을 대기음. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 신선한 정착 원심 분리기의 14 ML을 추가합니다.
  6. 단계를 반복 2.7 두 번 더.
  7. 신선한 정착액의 14 ML을 추가합니다. 파라 필름으로 뚜껑을 밀봉 및 -20 ° C에서 하룻밤 저장합니다.

중기 염색체 스프레드의 3 준비

  1. 22.9 ° C 및 52 % 습도로 조절 된 환경 챔버를 설정합니다.
  2. 원심 분리기는 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에서 B 세포를 고정. 대기음은 피펫 팅 튜브와에 resuspend 70 μl를 떠나 정착액.
  3. 35 ° 각도로 습도 챔버에 표시된 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드에 재현 탁 B 세포의 35 μl를 삭제하고 샘플 당이 슬라이드를 놓습니다. 30 분 후 슬라이드를 저장하기위한 슬라이드 습도 챔버에서 건조하도록 허용37 ° C에서 슬라이드 상자에.

4 텔로미어 (telomere) PNA의 FISH

  1. 프로브의 제조
    1. 37 ° C에 대한 사전 따뜻한 탈 포름 아미드. 7 ㎕의 탈 미리 예열 포름 아미드와 텔로미어 (telomere)의 PNA 프로브의 2 μl를 혼합하고 1 시간 동안 진탕 37 ° C에서 배양한다.
    2. 37 ° C에 대한 사전 따뜻한 FISH 마스터 믹스. 4.1.1 단계에서 혼합물에 7 ㎕를 미리 예열 FISH 마스터 믹스를 추가하고 1-3 시간 동안 37 ° C에서 배양한다.
    3. 80 ° C에서 8 분 동안 프로브 혼합물을 변성. 37 ° C에서 1 시간 동안 프로브를 사전 어닐링.
  2. 염색체 슬라이드의 전처리
    1. 수조에서 37 ° C로 0.01 M 염산 50 ㎖를 포함하는 유리 슬라이드 염색 항아리를 미리 따뜻하게.
    2. 실온에서 5 분 동안 2X SSC를 포함하는 다른 유리 슬라이드 오염성 항아리에 도시 슬라이드.
    3. 예열 유리 슬라이드 염색 항아리에 펩신 주식의 2 μl를 추가하고 반전 섞는다. 이 유리 SL에 슬라이드로 이동IDE-염색 항아리와 37 ° C에서 90 초를 배양.
    4. 슬라이드 떨고, 실온에서 5 분마다 1X PBS를 포함하는 다른 유리 슬라이드 염색 항아리에 배 씻으십시오. 그런 다음 떨고, 실온에서 1X PBS / MgCl2를 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오.
    5. 실온에서 10 분 동안 갓 제조 한 1 % 포름 알데히드 / PBS 1X / MgCl2를 함유 유리 슬라이드 오염성 항아리에 슬라이드를 이동.
    6. 떨고, 실온에서 1X PBS를 포함하는 다른 유리 슬라이드 염색 항아리에 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오.
    7. 70 %, 90 %, 및 100 % 에탄올을 함유하는 별도의 유리 슬라이드 염색 단지를 구비하여 탈수 에탄올 시리즈를 준비한다.
    8. 다음, 70 % 에탄올, 90 % 에탄올을 100 % 에탄올로 시작하여 3 분 동안 각 항아리에 슬라이드를 이동. 완료되면 -20 ° C에서 에탄올 항아리를 놓습니다.
    9. 종이 타월로 여분의 에탄올을 눌러과 35 ° 각도로 슬라이드를 지탱하여 건조 공기 슬라이드를 허용합니다. 일단 건조, mA다이아몬드 펜을 사용하여 슬라이드의 뒷면에 혼성화 18 X 18mm 영역 애먹.
  3. 물고기를 슬라이드의 변성
    1. 24 X 60mm coverslip에 120 ㎕의 70 % 탈 포름 아미드 / 2X SSC를 적용합니다. 커버 슬립에 슬라이드를 터치합니다. 90 초 동안 핫 플레이트에서 80 ° C에서 슬라이드를 변성.
    2. 신속하고 신중하게 커버 슬립을 밀어 넣고 3 분 동안 90 % 에탄올 다음 3 분, 100 % 에탄올 각 얼음 차가운 70 % 에탄올에 슬라이드를 배치합니다. 건조 공기 슬라이드를 허용합니다.
    3. 꽉 뚜껑 젖은 휴지와 플라스틱 상자를 안감으로 습기 챔버를 준비합니다. 용지에 습기가 될 수 있지만 물과 포화 안된다.
    4. 습기 챔버에서 슬라이드에 표시된 부분에 단계 4.1.3에서 사전 열처리 프로브 믹스를 적용 18 X 18mm 커버 슬립 커버와 1 시간 동안 37 ° C에서 배양한다.
  4. 후 배양 세척
    1. 사전 따뜻한 50 % 포름 아미드 / 2X SSC, 1X SSC, 그리고 4 배 SSC / 0.1 % 트윈 20 45 °에서; C 물 목욕.
    2. 조심스럽게 된 커버를 제거하고 어둠과 흔들림에 미리 예열 50 % 포름 아미드 / 2 배 SSC 3xfor 5 분에 각각의 슬라이드를 씻으십시오. 떨고 3xfor 5 분 미리 예열 1X SSC에 각각 슬라이드를 씻으십시오. 마지막으로, 예열 배 SSC에서 슬라이드를 씻어 / 0.1 % 트윈 20 3xfor 5 분 각을.
    3. 빛 보호 유리 슬라이드 염색 항아리에 DAPI에서 3 분 동안 슬라이드를 얼룩.
    4. 흔들리는 배 SSC에서 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오. 24 X 60mm의 커버 슬립 커버, Mowiol 장착 매체의 35 μl를 적용하고 4 ° C에서 슬라이드를 저장합니다.

염색체의 5 현미경 분석

  1. 표준 에피 형광 현미경을 사용하여 중기 슬라이드를 분석한다. 최상의 결과를 얻기 위해 이러한 MetaSystems Metafer 플랫폼으로 자동 스테이지 이미징 플랫폼을 사용한다. DAPI 형광이 염색체를 시각화하기 위해 각각의 중기 스프레드를 들어, 하나의 이미지를 수집하고, 텔로미어 (P)으로부터 형광 신호에 대한 하나의 이미지가운. (예를 들어, Cy3- 다른 루어를 사용할 수 있으며 잘 동일하게 작동합니다.)
  2. 이미지 분석 프로그램과 영상을 오버레이 분석.

결과

하나의 셀로부터 유도 중기 염색체 (도 1a)를 (마우스의 세포를 사용하는 경우)를 함유하는 염색체 40 이산 클러스터를 형성한다. 각각의 염색체는 밝은 파란색 영역으로 표시 한 끝에서 중심 소체가 있습니다. 보통 염색체에서 텔로미어이 신호는 각 동원체 의해 염색 분체와 두 신호의 끝에서 볼 수있다. 간기 핵뿐만 아니라 슬라이드에 존재합니다. 다음은 빨간색 텔로미어 (telomere)의 ...

토론

활성화 된 B 림프구, 특히 유사 분열 염색체 스프레드의 제조에 적합한 반면, 다른 세포 유형 또한 사용될 수있다. T 림프구가 이들이 비장 또는 림프절로부터 정제 될 수있는, B 세포의 많은 장점을 공유 할 수 있으며, 적절한 8 분열 촉진 물질을 함유하는 배지에서의 성장에 의해 자극 될 때 높은 유사 분열 지수가 있습니다. 배아 줄기 세포 (ES 세포)도 중기 염색체 분석 구에

공개

저자는 충돌하는 이해 관계가 없습니다.

감사의 말

이 작품은 NIH 보조금 R00 CA160574 (SFB)으로하고 (SMM에) 럿 거스 생명 공학 교육 프로그램의 교제에 의해 지원됩니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
50% Dextran sulfateIntergenS4030
Deionized formamideAmbion9342
Pepsin (5 g)SigmaP 6887 
FCSGemini100-106
LPS (100 mg)SigmaL2630
IL-4 (5 μg)SigmaI1020
PNA Telomere ProbePNA Bio IncF1002(CCCTAACCCTAACCCTAA)
ColcemidRoche295892
Mowiol 4-88Sigma81381-50g
CD43 (ly-48_) micro-beadsMiltenyl Biotec.130-049-801
DAPISigma32670-5MG
Eclipse E800Nikon
AxioImager.Z2Zeiss
CDS-5 Cytogenetic Drying ChamberThermotron

참고문헌

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  10. Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).
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Erratum


Formal Correction: Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH. Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:

SolutionReagentsCommentsStorage
B Cell Wash Buffer500 ml 1x Hanks Balanced Salt SolutionFilter through 0.22 μm stericup filtration unit4 °C
5 ml 50 °C heat inactivated FCS
5 ml 100x Pen/Strep
B Cell Medium418.5 ml RPMI-1640Filter through 0.22 μm stericup filtration unit4 °C
50 ml 50 °C heat inactivated FCS
5 ml 100x Pen/Strep
5 ml glutamine
5 ml nonessential amino acids
5 ml sodium pyruvate
1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol
5 ml 1M HEPES
Fixative3:1 v/v methanol/glacial acetic acidMake fresh
0.075 M KCl1.395 g KClRoom Temperature
250 ml distilled H2O
FISH Master Mix40 ml 50% Dextran sulfateVortex the solution and leave in a shaking platform overnightAliquot and store at -20 °C
20 ml 20x SSC
40 ml sterile distilled H2O
70% Formamide/2x SSC10 ml 20x SSCAdjust to pH 7 with 1M HClAliquot and store at -20 °C
20 ml distilled H2O
70 ml deionized formamide
0.01 M HCl1 ml 1M HClAdjust to pH 2.0Room Temperature
99 ml distilled H2O
1x PBS/MgCl250 ml 1M MgCl2Room Temperature
950 ml 1x PBS
50% Formamide/2x SSC20 ml 20x SSCAdjust to pH 7.25
Formamide used in this step does not have to be deionized.		Make fresh
80 ml distilled H2O
100 ml formamide
4x SSC/0.1% Tween2050 ml 20x SSCRoom Temperature
200 ml distilled H2O
250 μl Tween20
DAPI staining solution (80 ng/ml)40 μl 0.2mg/ml DAPI stock4 °C in light protected staining jar
100 ml 2x SSC
Mowiol Mounting Medium6 g glycerolIncubate at 50 °C with stirring for 2hrsAliquot and store at 4 °C
2.4 g Mowiol 4-88
6 ml distilled H2O
12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5
230 μl 1% Thimerosal (w/v in water)

Table 1. List of solutions. 

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