JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Erratum Notice
  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Erratum
  • Перепечатки и разрешения

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Резюме

Восстановления повреждений ДНК имеют важное значение для поддержания геномной целостности и предотвращения мутации и рак. Цель этого протокола заключается в количественном нестабильность генома путем прямого наблюдения хромосомных аберраций в метафазных из В-клеток мыши, используя флуоресцентные в гибридизация (FISH) для повторов теломер ДНК.

Аннотация

Неисправный репарации ДНК приводит к увеличению нестабильности генома, которая является причиной мутаций, которые приводят к туморогенеза. Анализ частоты и типа хромосомных аберраций в клетках различных типов позволяет дефекты восстановления повреждений ДНК не выяснены. Понимание млекопитающих репарации ДНК биология была очень помог производства мышей с нокаутом в специфических генов. Цель этого протокола заключается в количественном геномной нестабильности в мышь-лимфоцитов. Маркировка теломер с использованием PNA-FISH зондов (пептид нуклеиновых кислот - флуоресцентные в гибридизация) способствует быстрому анализ геномной нестабильности в спредов метафазных хромосом. В-клетки имеют определенные преимущества по сравнению с фибробластами, потому что они имеют нормальную плоидности и более высокий митотический индекс. Краткосрочная культура клеток, следовательно, позволяет точное измерение геномной нестабильности в первичной клеточной популяции, которая, вероятно, имеют меньше вторичного генетическую мутациюс чем то, что, как правило, находится в трансформированных фибробластов линии клеток или пациента.

Введение

Рак вызывается к накоплению мутаций, влияющих на гены, которые регулируют нормальный рост клеток. Мутация является следствием изменений в структуре и последовательности генома, связанная с повреждением ДНК. Повреждение ДНК может происходить с помощью различных процессов, в том числе экзогенных агентов, таких как ионизирующее излучение, и в качестве побочного продукта нормального клеточного метаболизма, такие как спонтанного дезаминирования нуклеотидных оснований или повреждений, возникающих при контакте с активными формами кислорода 1.

Хотя клетки млекопитающих обладают ряд мероприятий по ремонту, которые могут повернуть вспять повреждение ДНК или восстановить последовательность в местах разрыва, мутации, тем не менее накапливаются в течение всей жизни клетки. Повреждение ДНК может, кроме того, способствуют старению и потере активности стволовых клеток, два процесса, которые связаны с старение-ассоциированных заболеваний 2. Понимание ремонт повреждения ДНК, таким образом, решающее значение в решении две знакificant вопросы в области общественного здравоохранения. Увеличение данные свидетельствуют о том, что млекопитающих пути репарации ДНК может способствовать эволюции раковых клеток геном 3,4, что делает его еще более важно для понимания процессов, участвующих в подавлении мутации на молекулярном уровне.

Прямая визуализация хромосомных аберраций является мощным и количественные средства определения степени геномной нестабильности в конкретном типе клеток. Сокращенные хромосомы клеток в метафазе, могут быть выделены и проверены с помощью света или флуоресцентной микроскопии. Такие подходы цитогенетических был на практике в течение нескольких десятилетий и может быть использован, чтобы продемонстрировать внешний вид транслокаций или конкретных видов хромосомных аберраций, связанных с потерей репарации ДНК деятельности. Протокол поддается нескольких потенциальных расширений: хромосомы могут быть помечены зондов для спектрального кариотипирование (SKY) или многоцветной флуоресцентной гибридизации на месте(MFISH) для выявления транслокации 5,6. Эти методы также позволяют частоту хромосомных транслокаций и структуры сложных хромосомных транслокаций, которые будут определены, что обеспечивает дополнительную информацию сверх того, что можно с этим протоколом. Кроме того, последовательность конкретных зонды могут быть получены и использованы для тестирования частоты разрыва ДНК в отдельных геномных сайтов 7.

В этом протоколе, мы опишем приготовление метафазных хромосом распространяется от В-лимфоцитов. Флуоресцентно-меченного пептида нуклеиновой кислоты (ПНК) зонд для теломерных повторов используется, которые эффективно отмечает теломеры в метафазе хромосомы распространяется Этот протокол имеет несколько преимуществ. В-клетки могут быть индуцированы расти при высокой митотический индекс, так что высококачественные спреды последовательно, может быть получено. В-клетки генетически модифицированных мышей, также гораздо реже содержат вторичные генетические мутации, которые могут посрамить анализ вкладаспецифических генов в геномной целостности. Подход PNA-FISH может быть завершена в течение одного дня, и позволяет более точно озвучивание разрывы хромосом. Используя этот подход, особенно в сочетании с конкретного оборудования, описанного в этом протоколе, можно производить очень последовательные, высококачественные спреды и быстро анализировать частоту и тип геномной нестабильности.

протокол

Эта процедура была утверждена уходу и использованию комитета Институциональная животных при университете Ратджерса, Государственного университета Нью-Джерси на. Мышей обрабатывали в соответствии с Руководством по NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Ученые должны консультироваться со своими национальными и институциональных организаций животных для установленных и утвержденных принципов.

Прежде чем начать, приготовления растворов, перечисленных в таблице 1.

1 B Выделение клеток и активация

Усыпить мышь, используя CO 2 с последующим смещением шейных позвонков. Поместите мышь так левая сторона тела и спрей мышь с 70% этанола, пока мех не сыро. Проанализируйте селезенку и место в 35 мм блюдо культуры ткани с 2 мл промывочного буфера. В ламинарном потоке, аккуратно разбить селезенки в тканевой культуральной чашке с помощью плоский конец 5 мл шприца.

  1. Вставьте нейлоновая сетка 70 мкм в 50мл тюбик и перенести образец селезенки в 2 мл промывочного буфера в нейлоновой сетке. Осторожно нарушить селезенки в сетке, используя плоский конец шприца.
  2. Промойте заднюю часть шприца и 35 мм пластины с 8 мл промывочного буфера и фильтровать через нейлоновую сетку 70 мкм. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  3. Аспирируйте и отбросить супернатант и ресуспендируют осадок в 3 мл ACK буфера для лизиса. Внесите вверх и вниз кратко сорвать комки и инкубировать 5 мин. Добавьте 10 мл промывочного буфера и центрифуге при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  4. Аспирируйте и отбросить супернатант и ресуспендируют осадок, нажав на дне пробирки затем с помощью пипетки в 1 мл промывочного буфера. Добавить 50 мкл анти-CD43 MACS микро-шариков и инкубируют на льду в течение 30 мин. Добавьте 10 мл промывочного буфера, аккуратно перемешать, и центрифуге при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Добавьте 10 мл промывочного буфера, аккуратно перемешать, и центрифуге при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
  5. НастройкаКолонка Мини-MACS, поместив столбец на MACS магнита. Расположите меченого 15 мл коническую трубку ниже колонки. Добавьте 1 мл промывочного буфера на колонку и дать ему поработать до 15 мл трубки.
  6. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют в 1 мл промывочного буфера. Загрузить образец в колонку после того, как буфер стирки проходит через.
  7. После того, как образец пропускали через колонку, добавьте 1 мл промывочного буфера для промывки колонки. Добавить 7 мл промывочного буфера непосредственно к собранной пробы в 15 мл пробирку.
  8. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Перенесите необходимый объем клеток, необходимых для 5000000 клеток / лунку в 50 мл трубки. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Дополнение среднего В-клеток с ЛПС 1: 500 и IL-4 1: 1000.
  9. Аспирируйте супернатант и добавить соответствующий объем среды, дополненной В-клеток, необходимых для конечной концентрации 1000000 клеток / мл.
  10. Пластина клеток в 6-луночных планшетах с 5 мл клеток в 1 млн клеток / мл и место в humidifiред инкубаторе для клеточных культур при 37 ° С, 5% СО 2.

2 B сотовый Фиксация

  1. Добавить 50 мкл колцемид в лунку, содержащую 5 мл В-клеток (за конечной концентрации 100 нг / мл) и инкубируют 1 ч при 37оС. Prewarm 75 мМ КСl решение в C водяной бане 37 °. Перенесите В-клеток с меченым 15 мл трубки. Обложка этикетку с ленты и центрифуге при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
  2. Аспирируйте супернатант, оставляя 1 мл в пробирку и вновь суспендируют таблетку с помощью пипетки. Добавить 5 мл в предварительно подогретую KCl по капле при нажатой или пульсирует на вихрь.
  3. Добавьте 10 мл KCl и взболтайте. Инкубировать в C водяной бане 37 ° С в течение 15 мин. Добавить 5 капель свежего фиксатора и взболтайте. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Аспирируйте супернатант, оставляя 1 мл в пробирку и ресуспендируют осадок с помощью пипетки вверх и вниз.
  4. Добавить 5 мл свежей закрепителя по капле при нажатой или пульсирует на VORтекс. Добавить еще 10 мл фиксатора и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
  5. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Аспирируйте супернатант, оставляя 1 мл в пробирку и ресуспендируют с помощью пипетки. Добавить 14 мл свежего фиксатора и центрифуге при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  6. Повторите шаг 2,7 раза больше.
  7. Добавить 14 мл свежей фиксатором. Уплотнение крышки парафильмом и хранить в течение ночи при температуре -20 ° C.

3 Получение метафазных хромосом Спреды

  1. Установите регулируемый окружающую камеру до 22,9 ° С и 52% влажности.
  2. Центрифуга фиксированной В-клеток при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Аспирируйте FIXATIVE оставляя 70 мкл в пробирки и ресуспендируют с помощью пипетки.
  3. Поместите меченные слайды в камере влажности под углом 35 °. Бросьте 35 мкл ресуспендированных В-клеток на слайд и поместите две горки на образец. Разрешить слайды сушить в камере влажности в течение 30 мин, то хранить слайдыв слайд-коробки при 37 ° С.

4 теломер ПНА FISH

  1. Подготовка зонда
    1. Предварительно теплой деионизированной формамид до 37 ° С. Смешайте 2 мкл теломер PNA зонда с 7 мкл деионизированной подогретого формамида и инкубируют при 37 ° С при встряхивании в течение 1 часа.
    2. Предварительно теплой мастер-FISH смесь до 37 ° С. Добавить 7 мкл подогретого мастер Fish Mix к смеси с шага 4.1.1 и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 1-3 часов.
    3. Денатурации смеси зонда в течение 8 мин при 80 ° С. Предварительно отжига зонда в течение 1 ч при 37 ° С.
  2. Предварительная обработка хромосомы Слайды
    1. Предварительно нагреть-предметное стекло-окрашивания банку, содержащую 50 мл 0,01 М HCl до 37 ° С на водяной бане.
    2. Место скользит в другом предметное стекло-окрашивающего сосуд, содержащий 2Х SSC в течение 5 мин при комнатной температуре.
    3. Добавить 2 мкл пепсина складе в предварительно нагретом стекло-окрашивания банку и взболтайте. Трансфер слайды в этом стеклянном SLIDE-окрашивание банку и инкубируют 90 сек при 37 ° С.
    4. Промыть слайды 2x в другом предметное стекло-окрашивающего сосуд, содержащий 1X PBS в течение 5 мин каждый при комнатной температуре, встряхивая. Затем промыть слайды в течение 5 мин в 1х PBS / MgCl 2 при комнатной температуре, встряхивая.
    5. Передача слайдов на предметное стекло-окрашивающего сосуд, содержащий свежеприготовленного 1% формальдегид / 1X PBS / MgCl 2 в течение 10 мин при комнатной температуре.
    6. Вымойте слайды в течение 5 мин в другом предметное стекло-окрашивания банку, содержащую 1x PBS при комнатной температуре, встряхивая.
    7. Подготовка обезвоживания серии этанола, имея отдельный стекло-окрашивания баночки с 70%, 90% и 100% этанола.
    8. Передача слайдов в каждую банку в течение 3 мин, начиная с 70% этанолом, затем 90% этанола, а затем 100% этанола. Поместите этанола банки при -20 ° С, когда закончите.
    9. Разрешить слайды высохнуть на воздухе, нажав избыток этанола на бумажное полотенце и подперев слайды под углом 35 °. После высыхания, Массачусетсгк на 18 х 18 мм область для гибридизации на задней слайдов с использованием алмазной ручку.
  3. Денатурация Слайды для FISH
    1. Применить 120 мкл 70% деионизированной формамид / 2 × SSC в 24 х 60 мм покровным. Прикоснитесь к слайд покровного стекла. Денатурации слайд на 80 ° С на горячей плите в течение 90 сек.
    2. Быстро и тщательно соскользнуть покровное и поместить слайд в ледяной 70% этанола в течение 3 мин, после чего 90% этанола, и 100% этанола каждого в течение 3 мин. Разрешить слайды высохнуть на воздухе.
    3. Подготовка влажной камере, выравнивая пластиковую коробку с плотной крышкой и папиросной бумаги мокрой. Бумага должна быть влажной, но не насыщен водой.
    4. В влажной камере, применить предварительно отжигают сочетание зонда с шага 4.1.3 к обозначенному месту на слайде, накрыть 18 х 18 мм крышки скольжения и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа.
  4. Сообщение-инкубации Моет
    1. Предварительно теплые 50% формамид / 2 x SSC, 1x SSC, и 4x SSC / 0,1% Tween-20 в 45 °; Водяной бане C.
    2. Осторожно снимите покровные и мыть слайды в подогретого 50% формамидном / 2x SSC 3xfor 5 мин каждый в темноте и встряхивая. Вымойте слайды в подогретого 1x SSC 3xfor 5 мин каждая, дрожит. Наконец, мыть слайды в подогретого 4x SSC / 0,1% Твин-20 3xfor 5 минут каждый.
    3. Пятно слайды в течение 3 мин в DAPI в защищенном от света стекло-окрашивания банку.
    4. Вымойте слайды в течение 5 мин в 2х SSC, дрожит. Применить 35 мкл Mowiol монтажной среды, накрыть 24 х 60 мм покровные и хранить слайды при 4 ° С.

5 Микроскопический анализ хромосом

  1. Проанализируйте метафазных слайды, используя стандартный эпи-флуоресцентного микроскопа. Используйте изображений платформу с автоматизированной стадии в платформе метасистем Metafer получить лучшие результаты. Для каждого разворота метафазной, собирать одну картинку для флуоресценции DAPI визуализировать хромосомы, и одно изображение для флуоресцентного сигнала от теломер рхалат. (Например, Cy3- другие Fluors доступны и работают одинаково хорошо.)
  2. Наложения на изображения с помощью программы анализа изображений и анализировать.

Результаты

Метафазных хромосом, полученных от одной клетки должны образуют дискретный кластер, содержащий 40 хромосом (при использовании клетки мыши) (Рисунок 1А). Каждая хромосома имеет центромеры на одном конце, которая видна в виде светло-голубой шар. В нормальных хромосом, две теломер ?...

Обсуждение

В то время как активированные лимфоциты особенно подходит для приготовления митотических хромосом спредов, другие типы клеток, также могут быть использованы. Т-лимфоциты имеют много преимуществ В-клеток, так как они могут быть очищены из селезенки или лимфатических узлов, а также имею...

Раскрытие информации

Авторы не имеют противоположные интересы.

Благодарности

Эта работа поддерживается NIH грант R00 CA160574 (SFB) и с помощью общения Программы Рутгерса биотехнологии подготовки (к SMM).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
50% Dextran sulfateIntergenS4030
Deionized formamideAmbion9342
Pepsin (5 g)SigmaP 6887 
FCSGemini100-106
LPS (100 mg)SigmaL2630
IL-4 (5 μg)SigmaI1020
PNA Telomere ProbePNA Bio IncF1002(CCCTAACCCTAACCCTAA)
ColcemidRoche295892
Mowiol 4-88Sigma81381-50g
CD43 (ly-48_) micro-beadsMiltenyl Biotec.130-049-801
DAPISigma32670-5MG
Eclipse E800Nikon
AxioImager.Z2Zeiss
CDS-5 Cytogenetic Drying ChamberThermotron

Ссылки

  1. Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
  2. Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer. Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).
  3. Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
  4. Bunting, S. F., et al. 53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks. Cell. 141 (2), 243-254 (2010).
  5. Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).
  6. Callen, E., et al. Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG. Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).
  7. Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70. Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).
  8. Benn, P., Delach, J. Human lymphocyte culture and chromosome analysis. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
  9. Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
  10. Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).
  11. Gilley, D., et al. DNA-PKcs is critical for telomere capping. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).
  12. Bolzan, A. D. Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences. Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).
  13. Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations. Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).
  14. Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).
  15. Morales, J. C., et al. 53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).
  16. Halaby, M. J., et al. Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis. PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH. Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:

SolutionReagentsCommentsStorage
B Cell Wash Buffer500 ml 1x Hanks Balanced Salt SolutionFilter through 0.22 μm stericup filtration unit4 °C
5 ml 50 °C heat inactivated FCS
5 ml 100x Pen/Strep
B Cell Medium418.5 ml RPMI-1640Filter through 0.22 μm stericup filtration unit4 °C
50 ml 50 °C heat inactivated FCS
5 ml 100x Pen/Strep
5 ml glutamine
5 ml nonessential amino acids
5 ml sodium pyruvate
1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol
5 ml 1M HEPES
Fixative3:1 v/v methanol/glacial acetic acidMake fresh
0.075 M KCl1.395 g KClRoom Temperature
250 ml distilled H2O
FISH Master Mix40 ml 50% Dextran sulfateVortex the solution and leave in a shaking platform overnightAliquot and store at -20 °C
20 ml 20x SSC
40 ml sterile distilled H2O
70% Formamide/2x SSC10 ml 20x SSCAdjust to pH 7 with 1M HClAliquot and store at -20 °C
20 ml distilled H2O
70 ml deionized formamide
0.01 M HCl1 ml 1M HClAdjust to pH 2.0Room Temperature
99 ml distilled H2O
1x PBS/MgCl250 ml 1M MgCl2Room Temperature
950 ml 1x PBS
50% Formamide/2x SSC20 ml 20x SSCAdjust to pH 7.25
Formamide used in this step does not have to be deionized.		Make fresh
80 ml distilled H2O
100 ml formamide
4x SSC/0.1% Tween2050 ml 20x SSCRoom Temperature
200 ml distilled H2O
250 μl Tween20
DAPI staining solution (80 ng/ml)40 μl 0.2mg/ml DAPI stock4 °C in light protected staining jar
100 ml 2x SSC
Mowiol Mounting Medium6 g glycerolIncubate at 50 °C with stirring for 2hrsAliquot and store at 4 °C
2.4 g Mowiol 4-88
6 ml distilled H2O
12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5
230 μl 1% Thimerosal (w/v in water)

Table 1. List of solutions. 

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

90FISH

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены