Analisi rapida di aberrazioni cromosomiche in linfociti B mouse da PNA-FISH

Riepilogo

Percorsi di riparazione del DNA sono essenziali per il mantenimento dell'integrità genomica e prevenire la mutazione e il cancro. L'obiettivo di questo protocollo è quello di quantificare l'instabilità genomica mediante l'osservazione diretta di aberrazioni cromosomiche in metafase si diffonde dalle cellule B del mouse utilizzando ibridazione in situ fluorescente (FISH) per ripetizioni telomeriche del DNA.

Abstract

Riparazione del DNA difettoso porta ad una maggiore instabilità genomica, che è la causa principale delle mutazioni che portano alla tumorigenesi. Analisi della frequenza e il tipo di aberrazioni cromosomiche in diversi tipi cellulari permette difetti nei percorsi di riparazione del DNA da chiarire. Comprensione mammiferi riparazione del DNA biologia è stato molto aiutato dalla produzione di topi con ko in geni specifici. L'obiettivo di questo protocollo è quello di quantificare l'instabilità genomica nei linfociti B del mouse. Etichettatura dei telomeri con sonde PNA-FISH (peptide di acido nucleico - ibridazione fluorescente in situ) facilita l'analisi rapida di instabilità genomica degli spread metafase cromosomiche. Cellule B hanno vantaggi specifici relativi ai fibroblasti, perché hanno ploidia normale e un indice mitotico superiore. Cultura a breve termine di cellule B consente quindi la misurazione precisa di instabilità genomica in una popolazione di cellule primarie, che rischia di avere mutazione genetica secondaria menos di quello che è tipicamente presenti nei fibroblasti trasformati o linee cellulari di pazienti.

Introduzione

Il cancro è causato da un accumulo di mutazioni che interessano i geni che regolano la crescita delle cellule normali. La mutazione è una conseguenza di modifiche alla struttura e la sequenza del genoma causato da danni al DNA. Danno al DNA può avvenire attraverso una varietà di processi, compresi gli agenti esogeni come radiazioni ionizzanti, e come un sottoprodotto del normale metabolismo cellulare, come deaminazione spontanea di basi nucleotidiche o danni che si verificano per contatto con le specie reattive dell'ossigeno ^1.

Anche se le cellule di mammifero in possesso di una serie di attività di riparazione che può invertire il danno del DNA o ripristinare la sequenza in siti rottura, le mutazioni si accumulano comunque per tutta la durata di una cella. Danno al DNA può contribuire inoltre alla senescenza e la perdita di efficacia delle cellule staminali, due processi che sono associati con la malattia associata all'invecchiamento ^2. Comprendere la riparazione dei danni al DNA è quindi di fondamentale importanza per affrontare due segnoquestioni ificant nella salute pubblica. Una crescente evidenza suggerisce che mammiferi percorsi di riparazione del DNA possono contribuire all'evoluzione del genoma delle cellule di cancro ^3,4, il che rende ancora più indispensabile per capire i processi coinvolti nella soppressione mutazione a livello molecolare.

Visualizzazione diretta di aberrazioni cromosomiche è un potente e quantitativi mezzi per determinare il grado di instabilità genomica in un particolare tipo di cellula. Cromosomi abbreviato da cellule in metafase possono essere isolate e ispezionati utilizzando la luce o la microscopia a fluorescenza. Tali approcci citogenetiche sono stati in pratica per diversi decenni e può essere utilizzato per dimostrare l'aspetto di traslocazioni o specifici tipi di aberrazioni cromosomiche associate alla perdita di attività di riparazione del DNA. Il protocollo si presta a diversi potenziali estensioni: i cromosomi possono essere etichettati con sonde per cariotipo spettrale (SKY) o multicolor fluorescente in situ ibridazione(MFISH) per identificare traslocazioni ^5,6. Queste tecniche permettono anche la frequenza di traslocazioni cromosomiche e la struttura di traslocazioni cromosomiche complesse da determinare, che fornisce informazioni aggiuntive di là di quanto è possibile con questo protocollo. In alternativa, sonde sequenza-specifiche possono essere generati e utilizzati per testare la frequenza di rottura del DNA in siti genomici selezionati ^7.

In questo protocollo, si descrive la preparazione del cromosoma metafase diffonde da linfociti B. Un peptide acido nucleico (PNA) sonda fluorescenza marcata per le ripetizioni telomeriche viene utilizzato, che segna in modo efficiente telomeri in metafase cromosoma si diffonde Questo protocollo ha diversi vantaggi. Cellule B possono essere indotte a crescere ad alto indice mitotico in modo che gli spread di alta qualità possono essere prodotti in modo coerente. Cellule B da topi geneticamente modificati sono anche molto meno probabile che contengono mutazioni genetiche secondarie che possono confondere l'analisi del contributodi geni specifici per l'integrità genomica. L'approccio PNA-FISH può essere completato in un giorno, e permette il punteggio più accurata delle rotture cromosomiche. Usando questo approccio, in particolare in combinazione con attrezzature specifiche descritte in questo protocollo, è possibile produrre molto consistenti, spread alta qualità e analizzare rapidamente la velocità e il tipo di instabilità genomica.

Protocollo

Questa procedura è stata approvata dal Comitato di cura e l'uso degli animali Istituzionale presso la Rutgers, l'Università statale del New Jersey. I topi sono stati trattati in conformità con la guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Gli scienziati dovrebbero consultare i loro organizzazioni nazionali ed istituzionali animali per linee guida stabilite e approvate.

Prima di iniziare, preparare le soluzioni elencate nella tabella 1.

1 B Isolamento cellulare e attivazione

Euthanize un mouse utilizzando CO ₂ seguita da dislocazione cervicale. Posizionare il mouse in modo che il lato sinistro del corpo è alto e spruzzare il mouse con etanolo al 70% fino a quando il pelo è umido. Sezionare la milza e posto in un piatto di coltura tissutale 35 mm con tampone di lavaggio 2 ml. In una cappa a flusso laminare, delicatamente rompere la milza nel piatto di coltura di tessuti utilizzando la parte piatta di una siringa da 5 ml.

1. Inserire una rete di nylon di 70 micron in un 50Tubo ml e trasferire il campione milza in 2 ml tampone di lavaggio nella rete di nylon. Interrompere delicatamente la milza nella rete utilizzando la parte piatta della siringa.
2. Risciacquare retro della siringa e la placca 35 mm, con 8 ml di tampone di lavaggio e filtrata attraverso la maglia di nylon 70 micron. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C.
3. Aspirare e scartare il surnatante e risospendere il pellet in 3 ml di tampone di lisi ACK. Pipettare su e giù brevemente per interrompere grumi e incubare per 5 min. Aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C.
4. Aspirare e scartare il surnatante e risospendere il pellet toccando il fondo della provetta poi pipettando in 1 ml di tampone di lavaggio. Aggiungere 50 ml di anti-CD43 MACS micro-perline e incubare in ghiaccio per 30 min. Aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio, mescolare delicatamente e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio, mescolare delicatamente e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C.
5. Impostare unMini-MACS colonna posizionando una colonna sul magnete MACS. Posizionare un marcato tubo da 15 ml di sotto della colonna. Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio alla colonna e lasciar correre attraverso il tubo da 15 ml.
6. Aspirare il surnatante e risospendere in 1 ml di tampone di lavaggio. Caricare il campione nella colonna dopo che il tampone di lavaggio è eseguito attraverso.
7. Dopo che il campione è percorrere la colonna, aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio per lavare la colonna. Aggiungere 7 ml di tampone di lavaggio direttamente al campione prelevato nella provetta da 15 ml.
8. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Trasferire il volume richiesto di cellule necessarie per 5.000.000 cellule / pozzetto in una provetta da 50 ml. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Supplemento medio delle cellule B con LPS 1: 500 e IL4 1: 1.000.
9. Aspirare il surnatante e aggiungere il volume appropriato di supporto integrato delle cellule B necessaria per la concentrazione finale di 1.000.000 cellule / ml.
10. Cellule piastra in piastre da 6 pozzetti con 5 ml di cellule a 1.000.000 cellule / ml e posto in un umidifiEd coltura cellulare incubatore a 37 ° C, 5% di CO _2.

2 B Cella di fissaggio

1. Aggiungere 50 ml di Colcemid al pozzo contenente 5 ml di cellule B (per una concentrazione finale di 100 ng / ml) e incubare 1 ora a 37 ° C. Preriscaldare soluzione KCl 75 mM in un bagno di 37 ° C Acque. Trasferire le cellule B ad una etichetta tubo 15 ml. Coprire l'etichetta con nastro e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C.
2. Aspirare il surnatante lasciando 1 ml nella provetta e risospendere il pellet pipettando. Aggiungere 5 ml della preriscaldata KCl goccia a goccia, mentre toccando o pulsare in un vortice.
3. Aggiungere 10 ml di KCl e mescolare capovolgendo. Incubare in un bagno d'acqua a 37 ° per 15 min. Aggiungere 5 gocce di fissativo fresco e mescolare capovolgendo. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Aspirare il surnatante lasciando 1 ml nella provetta e risospendere pellet pipettando su e giù.
4. Aggiungere 5 ml di fissativo fresco goccia a goccia, mentre toccando o pulsante su un VORtex. Aggiungere altri 10 ml di fissativo e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
5. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Aspirare il surnatante lasciando 1 ml in provetta e risospendere da pipettaggio. Aggiungere 14 ml di fissativo fresco e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C.
6. Ripetere il punto 2.7 altre due volte.
7. Aggiungere 14 ml di fissativo fresco. Sigillare i tappi con Parafilm e conservare una notte a -20 ° C.

3 Preparazione di metafase spread cromosomi

1. Impostare una camera ambientale regolata a 22,9 ° C e 52% di umidità.
2. Centrifugare le cellule B fissato a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Aspirare fissativo lasciando 70 microlitri nel tubo e risospendere da pipettaggio.
3. Posizionare i vetrini etichettati in camera umida con un angolo di 35 °. Goccia 35 ml di cellule B risospese su un vetrino e rilasciare due scivoli per campione. Lasciare i vetrini si asciughino in camera umida per 30 minuti poi memorizzare le diapositivein una scatola di diapositive a 37 ° C.

4. telomeri PNA FISH

1. Preparazione della sonda
   1. Pre-caldo formammide deionizzata a 37 ° C. Mescolare 2 ml di sonda PNA telomeri con 7 microlitri formammide deionizzata preriscaldata e incubare a 37 ° C con agitazione per 1 ora.
   2. Pre-caldo mix FISH maestro a 37 ° C. Aggiungere 7 ml di pre-riscaldato mix FISH maestro alla miscela dal punto 4.1.1 e incubare a 37 ° C per 1-3 ore.
   3. Denaturare la miscela sonda per 8 minuti a 80 ° C. Pre-temprare la sonda per 1 ora a 37 ° C.
2. Pretrattamento dei vetrini cromosomi
   1. Pre-riscaldare un barattolo di vetro scorrevole colorazione contenente 50 ml di HCl 0,01 M a 37 ° C in un bagno d'acqua.
   2. Collocare i vetrini in un altro vaso di vetro scorrevole-colorazione contenente 2x SSC per 5 minuti a temperatura ambiente.
   3. Aggiungere 2 ml di pepsina magazzino al vetro pre-riscaldato slide-colorazione barattolo e mescolare capovolgendo. Trasferire i vetrini di questo vetro sljar ide-colorazione e incubare 90 sec a 37 ° C.
   4. Lavare i vetrini 2x in un altro vaso di vetro scorrevole-colorazione contenente 1x PBS per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente, agitando. Quindi lavare i vetrini per 5 min in PBS 1x / MgCl ₂ a temperatura ambiente, agitando.
   5. Trasferire i vetrini in un vaso di vetro scorrevole-colorazione contenente appena preparato 1% di formaldeide / 1x PBS / MgCl ₂ per 10 minuti a temperatura ambiente.
   6. Lavare i vetrini per 5 min in un altro vaso di vetro scorrevole-colorazione contenente 1x PBS a temperatura ambiente, agitando.
   7. Preparare una serie di disidratazione di etanolo avendo in vetro separata vasetti di slide-colorazione contenenti il ​​70%, 90% e il 100% di etanolo.
   8. Trasferire i vetrini per ogni barattolo per 3 min, iniziando con etanolo al 70%, quindi il 90% di etanolo, e poi il 100% di etanolo. Posizionare vasetti etanolo a -20 ° C una volta terminato.
   9. Lasciare i vetrini all'aria secca toccando eccesso di etanolo su un tovagliolo di carta e puntellare le diapositive con un angolo di 35 °. Una volta asciutto, mark un'area 18 x 18 mm per ibridazione sul retro delle diapositive utilizzando una penna diamante.
3. Denaturazione delle diapositive per FISH
   1. Applicare 120 microlitri formammide 70% deionizzata / 2X SSC a un coprioggetto 24 x 60 mm. Toccare la diapositiva per il coprioggetto. Denaturare il vetrino a 80 ° C su una piastra calda per 90 sec.
   2. Far scorrere velocemente e con cura il vetrino e porre il vetrino in ghiaccio freddo etanolo al 70% per 3 minuti, seguito da 90% di etanolo, e il 100% di etanolo ciascuno per 3 min. Lasciare i vetrini all'aria secca.
   3. Preparare una camera umida allineando una scatola di plastica con un coperchio stretto e carta velina bagnata. La carta deve essere umido, ma non saturo d'acqua.
   4. In una camera umida, applicare la miscela pre-ricotto sonda dal passo 4.1.3 per l'area contrassegnata sul vetrino, coprire con un coperchio 18 x 18 mm, antiscivolo e incubare a 37 ° C per 1 ora.
4. Lavaggi post-incubazione
   1. Preriscaldare il 50% formammide / 2x SSC, SSC 1x, 4x e SSC / 0,1% Tween-20 in un 45 °; C bagnomaria.
   2. Rimuovere con attenzione il coprioggetto e lavare i vetrini in pre-riscaldato 50% formammide / 2x SSC 3xfor 5 minuti ciascuna nel buio e agitando. Lavare i vetrini in pre-riscaldato 1x SSC 3xfor 5 minuti ciascuno, tremante. Infine, lavare i vetrini in pre-riscaldato 4x SSC / 0,1% Tween-20 3xfor 5 minuti ciascuno.
   3. Colorare i vetrini per 3 min in DAPI in una luce protetta vetrino-colorazione vaso.
   4. Lavare i vetrini per 5 min in 2x SSC, tremante. Applicare 35 ml di mezzo di montaggio Mowiol, coprire con 24 x 60 mm coprioggetto e conservare le diapositive a 4 ° C.

5 Analisi microscopica di cromosomi

1. Analizzare le diapositive metafase utilizzando un microscopio a fluorescenza standard. Utilizzare una piattaforma di imaging con una fase automatizzata, ad esempio la piattaforma METASYSTEMS Metafer per ottenere migliori risultati. Per ogni spread metafase, raccogliere un'immagine per DAPI fluorescenza di visualizzare cromosomi, e un'immagine per il segnale fluorescente dal telomero probe. (Ad esempio, Cy3- altri fluors sono disponibili e funzionano altrettanto bene.)
2. Sovrapponete le immagini con un programma di analisi di immagine e analizzare.

Risultati

Cromosomi in metafase derivati ​​da una cella dovrebbe formare un cluster discreto contenente 40 cromosomi (se si utilizza cellule di topo) (Figura 1A). Ogni cromosoma ha un centromero ad una estremità, che è visibile come una sfera azzurro. In cromosomi normali, due segnali telomeri sono visti alla fine dei cromatidi e due segnali di ciascun centromero. Nuclei in interfase saranno presenti sul vetrino pure. Questi saranno visibili come sfere blu, con segnali telomeri rosse, ma non cromosomi conde...

Discussione

Considerando che i linfociti B attivati ​​sono particolarmente adatti alla preparazione degli spread cromosomi mitotici, possono essere utilizzati anche altri tipi di cellule. Linfociti T condividere molti dei vantaggi delle cellule B, in quanto possono essere purificati dai nodi milza o linfonodi, e hanno un elevato indice mitotico, quando stimolato dalla crescita in terreno contenente mitogeni appropriate ^8. Le cellule staminali embrionali (cellule ES) sono adatti anche per l'analisi della metafase ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
50% Dextran sulfate	Intergen	S4030
Deionized formamide	Ambion	9342
Pepsin (5 g)	Sigma	P 6887
FCS	Gemini	100-106
LPS (100 mg)	Sigma	L2630
IL-4 (5 μg)	Sigma	I1020
PNA Telomere Probe	PNA Bio Inc	F1002	(CCCTAACCCTAACCCTAA)
Colcemid	Roche	295892
Mowiol 4-88	Sigma	81381-50g
CD43 (ly-48_) micro-beads	Miltenyl Biotec.	130-049-801
DAPI	Sigma	32670-5MG
Eclipse E800	Nikon
AxioImager.Z2	Zeiss
CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber	Thermotron