نموذج التعلم Lateralized الرائحة في الفئران حديثي الولادة لتشريح الدارات العصبية تعزيزالأساس تشكيل الذاكرة

Summary

This protocol introduces lateralized early odor preference learning in rats using acute single naris occlusion. Lateralized learning permits the examination of behavioral outcomes and underpinning biological mechanisms within the same animals, reducing variance induced by between-animal designs. This protocol can be used to investigate molecular mechanisms underpinning early odor learning.

Abstract

Rat pups during a critical postnatal period (≤ 10 days) readily form a preference for an odor that is associated with stimuli mimicking maternal care. Such a preference memory can last from hours, to days, even life-long, depending on training parameters. Early odor preference learning provides us with a model in which the critical changes for a natural form of learning occur in the olfactory circuitry. An additional feature that makes it a powerful tool for the analysis of memory processes is that early odor preference learning can be lateralized via single naris occlusion within the critical period. This is due to the lack of mature anterior commissural connections of the olfactory hemispheres at this early age. This work outlines behavioral protocols for lateralized odor learning using nose plugs. Acute, reversible naris occlusion minimizes tissue and neuronal damages associated with long-term occlusion and more aggressive methods such as cauterization. The lateralized odor learning model permits within-animal comparison, therefore greatly reducing variance compared to between-animal designs. This method has been used successfully to probe the circuit changes in the olfactory system produced by training. Future directions include exploring molecular underpinnings of odor memory using this lateralized learning model; and correlating physiological change with memory strength and durations.

Introduction

الشم هو الطريقة الحسية الأولية في القوارض، والتي بدونها لا تكون قادرة على التنقل بنجاح أو البقاء على قيد الحياة في بيئتهم. فمن الأهمية خاصة بالنسبة للالجراء حديثي الولادة، والتي يمكن أن لا ترى ولا تسمع خلال الأسبوع الأول بعد الولادة، لاستخدام الشم لتحديد موقع والدتهم لتغذية ^1. ونتيجة لذلك، الجراء الفئران حديثي الولادة يمكن مكيفة يفضلون الروائح مع التلاعب التجريبية بسيطة. وقد استخدمت مجموعة متنوعة من المنبهات مثل الحوافز غير المشروط (UCS) للحث على ردود مشروطة إلى الروائح رواية (التحفيز مكيفة، CS) في حديثي الولادة، بما في ذلك البيئة التعشيش ^2،3، حليب الرضاعة ^4-6، التمسيد أو التحفيز عن طريق اللمس ^{7- 12،} وذيل قرصة ^13، اللعاب الأمهات ^13، صدمة خفيفة القدم ^14-18، وتحفيز المخ داخل الجمجمة ^19. توظف هذه الدراسة رائحة مبكرة تفضيل نموذج راسخة فيه رائحة، في هذه الحالة النعناع، ​​طق جنبا إلى جنب مع التحفيز عن طريق اللمس من أجل إنتاج تفضيل النعناع 24 ساعة في وقت لاحق ^10،11،20. هذه الذكريات الروائح تعتمد على الدوائر حاسة الشم سليمة، بما في ذلك في المقام الأول المصابيح الشمية (OB) ^21-23 والقشرة الكمثرية الأمامية (APC) ^24،25.

عمقت التحقيقات التجريبية من أوائل التعلم تفضيل رائحة وتوسيع فهمنا للالأسس الجزيئية والفيزيولوجية للذاكرة الثدييات. هذا نموذج الثدييات ديها العديد من المزايا في دراسة آليات الذاكرة. أولا، تم تحديد مصادر العصبية للإشارة UCS. المحفزات المختلفة على النحو المذكور أعلاه موضع تحفز إطلاق coeruleus بافراز ^26، والذي بدوره ينشط adrenoceptors متعددة في OB وAPC، مما تسبب في الآثار الفسيولوجية والخلوية التي تدعم التعلم ^22،27،28. ثانيا، آليات دعم الذاكرة تجري في الهياكل العصبية الصفحي محددة جيدا. وبساطة الدوائر حاسة الشم في الفئران حديثي الولادة يوفر للباحثين الإطار المثالي الذي لكشف العمليات المعقدة المتعلقة اللدونة متشابك. الخلايا العصبية الحسية الشمية (OSN) في المشروع الظهارة الشمية على التاجي / خلايا معنقدة في OB وهذه التاجي / خلايا معنقدة في مشروع ipsilaterally بدوره إلى القشرة الكمثرية (PC) عبر المسالك الجانبية حاسة الشم (الكثير)، من بين غيرها من الهياكل ^29. وقد تم تحديد كل من نقاط الاشتباك العصبي OSN في OB ^30،31 والكثير ^24،25 نقاط الاشتباك العصبي في آسيا والمحيط الهادئ ومواضع الحرج لإجراء تغييرات متشابك التي تدعم التعلم والذاكرة. ثالثا، في سن مبكرة في الفئران، ويمكن بسهولة أن lateralized مدخلات الشمية. كل APC لديه حق الوصول إلى المعلومات رائحة الثنائية عبر الصوار الأمامي بمجرد تشكيل هذه المادة البيضاء بالكامل في يوم ما بعد الولادة 12 (PD12) ^32. قبل PD 12، ومدخلات رائحة يمكن أن تكون معزولة لipisilateral OB وAPC من خلال منخر واحد انسداد ^{24،25،31،33،34 <}/ سوب>. منخر واحد انسداد يسمح تشكيل الذاكرة رائحة من منخر مفتوحة، ويمنع نفس الذاكرة من منخر المغطي قبل PD 12 ^33. يتم عزل ذاكرة الرائحة إلى نصف الكرة المماثل بما في ذلك OB والجيش. وبالتالي، يمكن لكل الجرو الفئران يكون ايقاعه لتعلم وعلم وظائف الأعضاء التي تقوم عليها.

في هذه الدراسة، هو عرض رائحة مبكرة بروتوكول التعلم تفضيل lateralized. يخدم هذا الأسلوب كأداة قوية لدراسة الآليات العصبية التي يقوم عليها التعلم من خلال توفير رائحة عنصر تحكم داخل الحيوان ^24،25،31، وبالتالي خفض كل من عدد الحيوانات المطلوبة والتباين العام. منخر انسداد هو عكسها في أن الشحوم أو الأنف المكونات يمكن تطبيق وإزالتها مع الحد الأدنى من الإجهاد أو الضرر للحيوان. هنا، أولا، ووصف الإجراءات التفصيلية من رائحة تفضيل مبكرة التدريب والاختبار، مع التركيز على استخدام بروتوكول lateralized انسداد منخر واحد مع غالمكونات الإلكترونية. ثم يتم عرض النتائج للتدليل على فعالية انسداد منخر واحد في عزل المدخلات رائحة وإنتاج الذاكرة رائحة lateralized. وأخيرا، ناقش إمكانات استخدام هذا النموذج التعلم lateralized لدراسة التغيرات الفسيولوجية في النظام الشمي أن كلا توليد التعلم والذاكرة دعم التعبير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وتستخدم الفئران سبراغ داولي (تشارلز ريفر) الجراء من كلا الجنسين. يتم التخلص الفضلات إلى 12 في PD1 (الولادة يجري PD0). تتم المحافظة على السدود على ضوء 12 ساعة / دورة الظلام مع libitum الإعلانية الحصول على الغذاء والماء. وقد تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية لجنة رعاية الحيوان المؤسسية في جامعة ميموريال.

1. الأنف التوصيل البناء

ملاحظة: وقد تم تكييف هذا الإجراء وتعديلها من كامينغز وآخرون (1997) ^35.

1. Aquire الدائرة 20 أنابيب و3-0 موضوع خياطة الحرير.
2. قطع قطعة صغيرة من البولي ايثلين 20 الأنابيب إلى حوالي 0.8 مم.
3. موضوع خياطة الحرير من خلال أنابيب استعداد مثل أن هناك موضوع على جانبي الجزء من الأنبوب.
4. في واحدة من نهاية موضوع خارج المكونات، ربط عقدة في الموضوع.
5. سحب قسم من أنابيب أسفل على عقدة في الموضوع. عقدة يجب أن يقدموا داخل الأنبوب.
6. تقليم طرفي الخيط بحيث ~ 2 ملم من موضوع وجاحظ واحدة من نهاية الأنبوب (انظر الشكل 1A).

2. ناريس انسداد قبل التدريب

1. إزالة الجرو من السد ومكان في صحن آمن مغطاة الفراش منتظم.
2. استخدام تطبيق القطن تلميح إلى ربت هلام مخدر موضعي، 2٪ الزيلوكائين، على المنخر أن المغطي.
3. السماح الجرو للراحة في طبق لل~ 3 دقيقة.
4. عقد الجرو بلطف ولكن بشكل آمن في اليد غير المسيطرة.
5. باستخدام اليد المهيمنة، والتقاط المكونات الأنف وربت نفس المحلي هلام مخدر حول الطرف الذي الخيط لا جاحظ. وهذا العمل على حد سواء مخدر لأي الآلام الطفيفة المرتبطة المكونات الإدراج وسيكون بمثابة مواد التشحيم داخل المنخر. ملاحظة: تأثير الزيلوكائين يبدأ في غضون بضع دقائق ويستمر 20-30 دقيقة. الجراء في المعرض العام التسامح جيدة للسد الإدراج بعد تطبيق الزيلوكائين هلام (مinimum تكافح والنطق).
6. تضاف المكونات الأنف بلطف من خلال عقد بحزم الجرو ويدور ببطء المكونات مع دفعات لطيف جدا حتى يتم إدخال القابس بالكامل وفقط موضوع 2 مم وجاحظ من منخر (انظر الشكل 1B). يجب أن يكون هناك نزيف من أي منخر أثناء هذه العملية. يتم استبعاد الجراء مع نزيف الأنف خلال المكونات الإدراج، وعاد إلى السدود
7. السماح للحيوان للراحة في هذا الطبق لمدة 5 دقائق من أجل روض إلى المكونات.
8. إزالة الجرو من الطبق والبدء في التعود النموذج تكييف ^24.

الرقم 1. بناء سد الأنف. أ) الخطط تبين خطوات لجعل المكونات الأنف. يتم سحب خيط من خلال أنابيب البولي ايثيلين. يتم إجراء عقدة وPULأدى إلى منتصف الأنبوب لمنع ذلك. يتم قطع طرفي مع 2 ملم بقايا في واحدة من نهاية الأنبوب. B) الجبهة وجهة النظر الجانبي من الفئران مع المكونات الأنف في منخر واحد.

3. المعطرة الفراش إعداد

1. ارتداء قفازات جديدة وغطاء الدخان لمنع التلوث رائحة، ضع 500 مل من رقائق الخشب الفراش في كيس من البلاستيك.
2. استخدام حقنة لوضع 0.3 مل مستخلص النعناع، ​​ورذاذ على هذا الفراش في كيس من البلاستيك.
3. ربط حقيبة مغلقة، يهز الكيس بقوة، والسماح الفراش للراحة في كيس لمدة 5 دقائق.
4. وضع الفراش المعطرة في اضح، الضحلة، مربع الاكريليك التدريب (20 × 20 × 5 سم ^3، الشكل 2A) كشفت في غطاء الدخان لمدة 5 دقائق قبل الاستخدام. بعد الانتهاء من إعداد الفراش، تجاهل هذه القفازات، وعدم السماح لهذه القفازات تأتي في اتصال مع الحيوانات.
5. وضع الفراش نسكينتيد في مربع البلاستيك الشفاف متطابقة، و ENتأكد أنه لا تتلامس مع الفراش المعطرة أو القفازات المستخدمة.

4. رائحة تكييف النموذج (انظر الصورة في الشكل 2A)

الجراء إما الخضوع لجلسة تكييف واحدة، على PD 6، أو جلسات محاكمة متعددة (دورة واحدة في اليوم الواحد، PD 3-6).

1. وضع الجرو الذي تعود على الفراش المعطرة. للسيطرة على رائحة فقط (O / S ^-) الجراء، وترك هذه الجراء على الفراش لمدة 10 دقيقة، ثم انتقل إلى الخطوة 4.5. لتجريبية رائحة + السكتة الدماغية (O / S ⁺⁾ الجراء، تابع إلى الخطوات التالية في هذا القسم.
2. السكتة الدماغية الجرو لمدة 30 ثانية يستخدم الفرشاة الصغيرة. استخدام حركات دائرية سريعة في المقام الأول في جميع أنحاء المنطقة الخلفية من الجرو.
3. السماح الجرو للراحة لمدة 30 ثانية.
4. كرر الخطوات من 4.2 و 4.3 ليصبح المجموع 10 دقيقة (أي 10 أزواج من التمسيد + رائحة).
5. إزالة الجرو من المربع تكييف، وإزالة المكونات الأنف والعودة الجرو الى السد.

<ع الطبقة = "jove_title"> 5. Lateralized رائحة الأفضلية اختبار (انظر الصورة في الشكل 2B)

الاختبار يحدث في نقاط زمنية مختلفة (مثل 24 أو 48 ساعة) بعد الدورة التدريبية الأخيرة. ويتم الاختبار في اختبار الصلب غير القابل للصدأ وغرفة (30 × 20 × 18 سم ^3)، والتي يتم وضعها على قمة صناديق تدريبيتين (يوصف مربع التدريب في 3.4)، مفصولة 2 سم المنطقة المحايدة. يحتوي مربع واحد التدريب الفراش المعطرة النعناع بينما المربع الآخر يحتوي نظيفة، والفراش نسكينتيد. أرضية غرفة الاختبار شبكة معدنية، والتي يتم بعد ذلك تغطيها ورقة قابلة للإزالة شبكة من البلاستيك (الشكل 2B).

1. إعداد النعناع واحدة وفراش واحد نسكينتيد حسب القسم 3، ووضع كل مربع تحت طرفي نقيض في غرفة الاختبار، 2 سم عن بعضها البعض. وضع شبكة بلاستيكية في الطابق المعادن شبكة من غرفة الاختبار.
2. إزالة الجرو من السد ووضع لمسة الحازم عديم الرائحة سيليكون الشحوم على المنخرالتي المغطي أثناء التدريب. إعادة تطبيق الشحوم في جميع أنحاء إجراء الاختبار الأول حسب الحاجة. ملاحظة: عشوائية انسداد المنخر خلال التدريب والاختبار ويمكن اعتبار لتجنب التحيز.
3. وضع الجرو في المنطقة المحايدة للغرفة الاختبار.
4. السماح الجرو لاستكشاف الغرفة لمدة 1 دقيقة مسجلا متى الجرو قضى على الجانبين من الغرفة (أي أكثر من النعناع أو الفراش المعطرة محايد).
5. السماح الجرو للراحة لمدة 1 دقيقة في غرفة البلاستيك عقد مغطاة.
6. كرر الخطوات من 5.2 و 5.3 ليصبح المجموع 10 دقيقة (أي 5 تجارب اختبار مفصولة 5 تجارب بقية) تبديل التوجه الأولي من الجرو في الغرفة من أجل السيطرة على تفضيلات الاتجاه.
7. مباشرة بعد الاختبار، ويمحو الشحوم من المنخر.
8. إدراج noseplug البولي ايثيلين في المنخر الآخر حسب القسم 2 والسماح للحيوان للراحة لمدة 10 دقيقة.
9. اختبار الجرو مرة أخرى كما هو الحال في 5.3 -5.6، وإزالة المكونات، والعودة الجرو الى السد. إزالة وتنظيف شبكة بلاستيكية للغرفة الاختبار مع الايثانول 95٪ والسماح السائل لتتبخر. وضع شبكة اختبار مرة أخرى قبل الجرو المقبل.
   ملاحظة: تطبيق سيليكون الشحوم في أول انسداد المنخر خلال اختبار يمنع فرصة النزيف والإجهاد المرتبطة المكونات الأنف الإدراج.

الشكل 2. رائحة المبكر التدريب تفضيل والاختبار. A) رائحة المبكر التدريب تفضيل استخدام رائحة + التمسيد النموذج. B) اثنين اختيار رائحة اختبار تفضيل الفراش مع النعناع على جانب واحد، والسيطرة الفراش نسكينتيد على الجانب الآخر. يتم وضع 2 سم في المنطقة المحايدة بين.

6. اختبار فعالية واحدة انسداد ناريس

الإقليم الشمالي "> يتم تنفيذ هذه التجربة لتحديد ما إذا كان انسداد منخر واحد يؤدي إلى تفعيل lateralized النظام الشمي.

1. أداء انسداد المنخر جانب واحد على PD 6 أو 7 الجراء كما هو موضح في القسم 2.
2. ~ بعد 5 دقائق التعود، ضع الجرو في وعاء من البلاستيك مغطاة وتعريضها إلى 30 ميكرولتر زيت النعناع نقية غارقة في قطعة من الأنسجة لمدة 10 دقيقة.
3. مباشرة بعد التعرض رائحة النعناع، ​​حقن الجرو داخل الصفاق (IP) مع هيدرات كلورال (400 ملغ / كغ)، والتخدير العام، أو pentobarbitol، (150 ملغ / كلغ).
4. مرة واحدة تخدير بالكامل (يظهر أي رد على الذيل أو قرصة القدم)، يروي transcardially الجرو مع حلول الجليد الباردة من المياه المالحة (0.9٪) ل~ 1 دقيقة، تليها بارافورمالدهيد (4٪، وحلت في حل العازلة 0.1 M الفوسفات، PBS ).
5. بعد 10 دقيقة من امتصاص العرق نضح، وجمع الدماغ ووضعه في بارافورمالدهيد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، ثم عبرFER الدماغ إلى حل السكروز (20٪ في PBS) لمدة 24 ساعة إضافية.
6. قطع شرائح الدماغ الاكليلية في 30 سمك ميكرون مع ناظم البرد. جمع OB وPC شرائح وجبل على الشرائح المغلفة الجيلاتين، تليها تلطيخ المناعية القياسي لpCREB الأجسام المضادة ^21،25،30.

7. اختبار الانعكاسية واحدة من انسداد ناريس

هذه الاختبارات التجربة ما إذا كان تأثير حجب هو عكسها في 24 ساعة بعد إزالة المكونات الأنف.

1. أداء انسداد المنخر جانب واحد على PD 6 أو 7 الجراء كما هو موضح في القسم 2.
2. بعد 15 دقيقة (أي ما يعادل مدة انسداد المنخر أثناء التدريب - 5 دقائق التعود + 10 دقيقة التدريب)، وإزالة المكونات الأنف، والعودة الجرو الى السد.
3. بعد 24 ساعة، تعرض الجرو لرائحة النعناع في وعاء من البلاستيك مغطاة لمدة 10 دقيقة كما هو موضح في 6.2.
4. اتبع نفس الخطوات في الطائفةأيونات 6،3-6،6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

نحن هنا مراجعة بعض النتائج المحددة سابقا ²⁴ لإثبات فعالية انسداد المنخر في عزل المدخلات رائحة والتعلم إلى النصف واحد، والعودة إلى الوراء من هذا الأسلوب.

انسداد منخر واحد في أوائل التدريب تفضيل رائحة يؤدي إلى رائحة الذاكرة la...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تأسست التعلم والذاكرة رائحة نموذج lateralized في الفئران الوليدة ضمن إطار الوقت الحرج أول من هول والزملاء. في سلسلة من الدراسات ^33،34،36، فإنها أظهرت أن الذاكرة تفضيل رائحة يمكن lateralized من رائحة الحليب + حدودا لمنخر واحد على PD 6 في الفئران الوليدة. كانت الذاكرة تفضيل قوية...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polythylene 20 tubing	Intramedic	427406	Non-radiopaque, Non-toxic
3-0 Silk suture thread	Syneture	Sofsilk	Non-absorbent
Silicone grease	Warner Instrument	64-0378	Odorless
2% Xylocaine gel	AstraZeneca	Prod. No 061	Lidocaine hydrochloride jelly, purchased at local pharmacy
Paint brush	Dynasty	206R	Similar size/other brands work too
Peppermint extract	Sigma-Aldrich	W284807	Other brands should be okay too
Training box	Custom-made	N/A	Acrylic box (20 x 20 x 5 cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors
Testing chamber	Custom-made	N/A	Stainless steel (30 x 20 x 18 cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used
pCREB antibody	Cell Signaling	9198	Ser 133 (87G3) Rabbit mAb
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	C8383	N/A
Paraformaldehype	Sigma-Aldrich	P6148	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378	N/A