Um Modelo de Aprendizagem lateralizados Odor em ratos recém-nascidos para Dissecando Formação Neural dos circuitos Consolidação da Memória

Resumo

This protocol introduces lateralized early odor preference learning in rats using acute single naris occlusion. Lateralized learning permits the examination of behavioral outcomes and underpinning biological mechanisms within the same animals, reducing variance induced by between-animal designs. This protocol can be used to investigate molecular mechanisms underpinning early odor learning.

Resumo

Rat pups during a critical postnatal period (≤ 10 days) readily form a preference for an odor that is associated with stimuli mimicking maternal care. Such a preference memory can last from hours, to days, even life-long, depending on training parameters. Early odor preference learning provides us with a model in which the critical changes for a natural form of learning occur in the olfactory circuitry. An additional feature that makes it a powerful tool for the analysis of memory processes is that early odor preference learning can be lateralized via single naris occlusion within the critical period. This is due to the lack of mature anterior commissural connections of the olfactory hemispheres at this early age. This work outlines behavioral protocols for lateralized odor learning using nose plugs. Acute, reversible naris occlusion minimizes tissue and neuronal damages associated with long-term occlusion and more aggressive methods such as cauterization. The lateralized odor learning model permits within-animal comparison, therefore greatly reducing variance compared to between-animal designs. This method has been used successfully to probe the circuit changes in the olfactory system produced by training. Future directions include exploring molecular underpinnings of odor memory using this lateralized learning model; and correlating physiological change with memory strength and durations.

Introdução

O olfato é a modalidade sensorial primário em roedores, sem o que não seria capaz de navegar ou sobreviver em seu ambiente com sucesso. É especialmente importante para os filhotes recém-nascidos, que nem podem ver, nem ouvir, durante a primeira semana pós-natal, para usar o olfato para localizar a sua mãe para alimentar ^1. Como resultado, os filhotes de ratos recém-nascidos pode ser condicionado a preferir odores com manipulações experimentais simples. Uma variedade de estímulos têm sido usados ​​como estímulo incondicionado (UCS) para induzir respostas condicionadas a novos odores (estímulo condicionado, CS) em recém-nascidos, incluindo o ambiente de nidificação ^2,3, sugando leite ^4-6, acariciando ou estimulação tátil ^{7 12, 13} de aperto da cauda, ​​saliva materna ^{13, 14-18} leve choque nas patas, intracraniana e a estimulação do cérebro ^19. O presente estudo emprega um odor precoce preferência paradigma bem estabelecido, em que o odor, neste caso, de hortelã-pimenta, is combinados com a estimulação táctil de modo a produzir uma preferência para hortelã-pimenta 24 horas mais tarde ^10,11,20. Estas memórias odores são dependentes de circuitos olfativa intacta, incluindo principalmente o bulbo olfatório (OB) ^21-23 eo córtex piriforme anterior (APC) ^24,25.

Investigações experimentais do início do aprendizado preferência odor aprofundaram e ampliaram nossa compreensão das bases moleculares e fisiológicos de uma memória dos mamíferos. Este modelo de mamíferos tem várias vantagens em estudar mecanismos de memória. Em primeiro lugar, as fontes neurais do sinal UCS foram identificados. Vários estímulos, como mencionado acima estimular lócus coeruleus liberação de noradrenalina ^26, que por sua vez ativa vários receptores adrenérgicos na OB e APC, causando efeitos celulares e fisiológicos que sustentam o aprendizado ^22,27,28. Em segundo lugar, os mecanismos de memória de apoio ter lugar em estruturas neurais laminares bem definidas. Asimplicidade do circuito olfativo em ratos recém-nascidos fornece aos pesquisadores do quadro ideal com o qual a desvendar os intrincados processos relacionados com a plasticidade sináptica. Neurônios olfativos sensoriais (OSN) no projeto epitélio olfativo Onto mitral / células tufados no OB e estes mitral / células tufados, por sua vez projeto ipsi para córtex piriforme (PC) via lateral trato olfatório (LOT), entre outras estruturas ^29. Ambas as sinapses OSN no OB ^30,31 ea LOT sinapses ^24,25 na APC foram identificados como loci crítico para mudanças sinápticas que apoiar a aprendizagem ea memória. Em terceiro lugar, em uma idade precoce em ratos, insumos olfativos podem ser facilmente lateralizada. Cada A APC tem acesso à informação odor bilateral através da comissura anterior uma vez que esta substância branca está completamente formado no pós-natal dia 12 (PD12) ^32. Antes PD 12, entrada de odor pode ser isolado para ipisilateral OB e APC através único oclusão naris ^{24,25,31,33,34 <}/ Sup>. Oclusão naris Único permite a formação de memória odor do naris aberto, e impede a mesma memória das narinas ocluídas anteriores para PD 12 ^33. Memória Odor é isolado para o hemisfério ipsilateral incluindo tanto OB e APC. Portanto, cada filhote de rato pode ser seu próprio controle para o aprendizado e subjacente a fisiologia.

No presente estudo, o odor cedo protocolo aprendizagem preferência lateralizada é introduzido. Este método serve como uma ferramenta poderosa para o estudo dos mecanismos neurais subjacentes aprendizagem odor, proporcionando um controlo intra-animais ^24,25,31, reduzindo assim tanto o número de animais necessários e a variação geral. Oclusão naris é reversível em que o bujão de gordura ou nariz pode ser aplicado e removido com o stress ou dano para o animal mínimo. Aqui, em primeiro lugar, os procedimentos detalhados de treinamento preferência odor cedo e testes são descritos, com foco no protocolo lateralizado usando oclusão naris único com um nsae tampão. Em seguida, os resultados são apresentados para demonstrar a eficácia de oclusão naris único no isolamento de entrada odor e produzindo odor lateralizado memória. Por fim, são discutidas as potencialidades da utilização deste modelo de aprendizagem lateralizado para estudar mudanças fisiológicas no sistema olfativo que ambos geram aprendizado e memória apoio expressão.

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Protocolo

Sprague Dawley (Charles River) filhotes de ambos os sexos são usados. As ninhadas são abatidos para 12 no PD1 (nascimento sendo PD0). Os reservatórios são mantidos num ciclo claro / escuro de 12 horas de luz, com acesso ad libitum a comida e água. Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional da Universidade Memorial.

1. Nose plug Construção

NOTA:. Este procedimento foi adaptado e modificado a partir de Cummings et al (1997) ^35.

1. Aquire tubulação de polietileno de 20 e 3-0 fio de sutura de seda.
2. Corte um pequeno pedaço de polietileno de 20 tubos de aproximadamente 0,8 mm.
3. Fio de sutura de seda através do tubo preparado de tal modo que existe rosca de cada lado da secção de tubo.
4. Em uma extremidade do fio fora da tomada, dê um nó no fio.
5. Puxe a seção de tubulação para baixo sobre o nó no fio. O nó deve apresentar dentro da tubulação.
6. Aparar as duas extremidades do fio de tal modo que ~ 2 mm de segmento está saliente a partir de uma extremidade do tubo (ver figura 1A).

2. Naris Oclusão antes do treino

1. Remover filhote de barragem e coloque em um prato seguro coberto por uma cama regular.
2. Use um aplicativo de ponta de algodão para enxugar uma geléia anestésico local, xilocaína 2%, sobre as naris a ser fechado.
3. Permitir que o filhote para descansar no prato para ~ 3 min.
4. Segure o filhote com cuidado, mas com firmeza na mão não-dominante.
5. Usando a mão dominante, pegar uma ficha nariz e bata na mesma geléia anestésico local em torno da ponta da qual o segmento não está saliente. Isto irá agir como um anestésico para todas as dores menores associadas com plug de inserção e irá funcionar como um lubrificante no interior do naris. NOTA: O efeito da xilocaína começa dentro de alguns minutos e dura 20-30 min. Filhotes em geral mostram boa tolerância para plugue de inserção após a aplicação de xilocaína geléia (mMÍNIMO lutando e vocalização).
6. Insira cuidadosamente a ficha nariz segurando firmemente o filhote e girando lentamente a ficha com empurrões muito suaves até que o plugue está totalmente inserido e só o fio 2 mm de largura que se projeta da naris (ver Figura 1B). Não deve haver sangramento de qualquer naris durante este processo. Filhotes com sangramento durante a tomada nariz de inserção são excluídos e voltou para barragens
7. Permitir que o animal para descansar neste prato durante 5 min, de modo a habituar-se o tampão.
8. Retirar o filhote do prato habituação e começar o paradigma condicionado ^24.

Figura 1 construção de uma vela de nariz. A) Esquema mostrando os passos de fazer um encaixe do nariz. A linha é puxada através de tubos de polietileno; um nó é feito e pullevado para o centro do tubo para bloqueá-lo; duas extremidades são cortadas com um resíduo de 2 mm de uma extremidade para fora do tubo. B) frontal e lateral de um rato com um tampão no nariz uma narinas.

3. Perfumado cama Preparação

1. Vestindo luvas novas e em um exaustor para evitar a contaminação odor, coloque 500 ml de cama de lascas de madeira em um saco plástico.
2. Use uma seringa para elaborar 0,3 ml extrato de hortelã, e pulverizar este sobre a cama no saco plástico.
3. Amarre o saco fechado, sacuda o saco vigorosamente, e permitir que a roupa de cama para descansar no saco por 5 min.
4. Coloque a roupa de cama perfumada em uma caixa clara, rasa, acrílico treinamento (20 x 20 x 5 cm ^3, Figura 2A) descoberto em um exaustor por 5 minutos antes de usar. Uma vez que a roupa de cama é preparada, descarte as luvas, e não permitir que essas luvas para entrar em contato com os animais.
5. Coloque a cama sem cheiro em uma caixa de plástico idêntico claro, e enCertifique-se de que não entram em contato com a roupa de cama perfumada ou luvas usadas.

4. Odor Condicionado Paradigm (ver imagem na Figura 2A)

Os filhotes passam por uma única sessão condicionado, em PD 6 ou múltiplas sessões de julgamento (uma sessão por dia, PD 3-6).

1. Coloque o filhote habituado a cama perfumada. Para odor controle só (O / S ^-) filhotes, deixe estes filhotes de cachorro na cama por 10 min, em seguida, vá para o passo 4.5. Para experimental odor + curso (O / S ⁺⁾ filhotes, continue com os seguintes passos nesta seção.
2. Curso o filhote durante 30 segundos usando um pincel pequeno. Use rápidos movimentos circulares principalmente em torno da região posterior do filhote.
3. Permitir que o filhote para descansar por 30 seg.
4. Repita os passos 4.2 e 4.3 para um total de 10 min (ou seja, 10 pares de afago + odor).
5. Remover filhote da caixa de condicionamento, retire a ficha nariz e devolver o cachorro para a represa.

5. Lateralizado Odor Preferências Testing (ver imagem na Figura 2B)

O teste ocorre em vários pontos temporais (por exemplo, 24 ou 48 h) a seguir à sessão de treino final. O teste é realizado numa câmara de teste de aço inoxidável (30 x 20 x 18 cm ^3), que é colocada em cima de duas caixas de formação (caixa de formação é descrita no ponto 3.4), separadas por uma zona neutra 2 cm. Uma caixa de treinamento contém cama com aroma de hortelã-pimenta, enquanto a outra caixa contém limpo, roupa de cama sem cheiro. O chão da câmara de teste é uma grade de metal, que é então coberto por uma folha removível de malha de plástico (Figura 2B).

1. Prepare uma hortelã-pimenta e uma cama sem cheiro como por secção 3, e colocar cada caixa em lados opostos da câmara de teste de 2 cm de distância. Coloque a malha de plástico sobre o chão de metal da grade da câmara de teste.
2. Retirar o filhote da barragem e coloque um dab empresa de graxa de silicone inodoro nas narisque está ocluído durante o treinamento. Voltar a aplicar o lubrificante ao longo do procedimento de teste como primeiro necessário. NOTA: oclusão naris aleatória durante o treinamento e teste podem ser considerados para evitar viés.
3. Coloque cachorro na zona neutra da câmara de teste.
4. Permitir que o filhote para explorar a câmara por 1 min, registrando quanto tempo o cachorro passou ao longo dos dois lados da câmara (ou seja, mais de hortelã-pimenta ou roupa de cama neutra-perfumada).
5. Permitir que o filhote para descansar por 1 min em uma câmara de retenção de plástico coberto.
6. Repita os passos 5.2 e 5.3 para um total de 10 min (ou seja, 5 ensaios de teste, separados por 5 ensaios de descanso) mudar a orientação inicial de que o filhote na câmara, a fim de controlar as preferências de direção.
7. Imediatamente após o teste, limpe a graxa do naris.
8. Insira um noseplug polietileno no naris oposto conforme a secção 2 e permitir que o animal em repouso por 10 min.
9. Teste o filhote, mais uma vez, como em 5.3 -5.6, retire a ficha, e devolver o cachorro para a represa. Remover e limpar a rede de plástico da câmara de ensaio com 95% de etanol e permitir que o líquido se evapore. Coloque a malha para trás antes de testar o próximo filhote.
   NOTA: A aplicação de graxa de silicone na primeira oclusão naris durante o teste impede a chance de sangramento e estresse associado com plug nariz de inserção.

Figura formação preferência 2 odor precoce e testes. A) formação odor precoce preferência usando o odor + acariciando paradigma. B) Dois escolha odor testes de preferência com roupa de cama de hortelã-pimenta, de um lado, o controle da cama sem cheiro no lado oposto. A zona neutra dois centímetros é colocado no meio.

6. testar a eficácia de uma única Naris Oclusão

nt "> Este experimento é realizado para determinar se a oclusão naris único leva à ativação lateralizado do sistema olfativo.

1. Realize oclusões NARIs unilaterais em PD 6 ou 7 filhotes, conforme descrito na seção 2.
2. Após cerca de 5 minutos de habituação, coloque o filhote em um recipiente de plástico coberta e expô-la a 30 mL de óleo de hortelã-pimenta pura embebido em um pedaço de tecido para 10 min.
3. Imediatamente após a exposição ao odor de hortelã-pimenta, o cachorro injectar por via intraperitoneal (ip) com hidrato de cloral (400 mg / kg), como um anestésico geral, ou pentobarbitol, (150 mg / kg).
4. Uma vez completamente anestesiado (não apresentando resposta a cauda ou pé de aperto), transcardialmente perfundir o cachorro com soluções geladas de solução salina (0,9%) durante ~ 1 min, seguido por paraformaldeído (4%, dissolvido em solução tampão de fosfato 0,1 M, PBS ).
5. Depois de 10 min de perfusão paraformaldeído, recolher o cérebro e colocá-lo em paraformaldeído a noite a 4 ° C, em seguida transfer o cérebro para uma solução de sacarose (20% em PBS) durante uma 24 horas adicionais.
6. Cortar fatias cerebrais coronais de 30 um, com uma espessura de criostato. Recolha de OB e PC fatias e montagem em lâminas revestidas com gelatina, seguida por coloração imuno-histoquímica para o padrão pCREB anticorpo ^21,25,30.

7 Teste da Reversibilidade da Única Naris Oclusão

Esta experiência testa se o efeito de bloqueio é reversível às 24 horas após a remoção da tomada de nariz.

1. Realize oclusões NARIs unilaterais em PD 6 ou 7 filhotes, conforme descrito na seção 2.
2. Depois de 15 min (equivalente à duração da oclusão naris durante o treino - 5 min habituação + 10 min de treinamento), retire a ficha nariz, e devolver o cachorro para a represa.
3. 24 horas depois, expor o filhote para o odor de hortelã em um recipiente de plástico coberta por 10 minutos, conforme descrito em 6.2.
4. Siga mesmos passos em seitaíons de 6,3-6,6.

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Resultados

Aqui vamos rever alguns dos resultados previamente estabelecidos ²⁴ para demonstrar a eficácia da oclusão naris em isolar entrada odor e aprender a um hemisfério, ea reversibilidade do método.

Oclusão Único naris durante o treinamento preferência odor precoce leva a uma memória odor lateralizado ^24. A memória é confinado ao naris poupados (Figura 3). Quando os filhotes são testados quanto à preferência de odor com a mesma naris ocluído dur...

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Discussão

O modelo de aprendizagem e memória odor lateralizado em filhotes de rato dentro de uma janela de tempo crítico foi estabelecido pela primeira vez por Hall e colegas. Em uma série de estudos ^33,34,36, eles mostraram que uma memória preferência odor poderia ser lateralizado por odores + leite pares para um naris em PD 6 em filhotes de ratos. Memória preferência era robusto quando o mesmo naris estava aberta durante o treinamento e teste, mas não observada quando o naris oclusa foi desbloqueado e testado...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polythylene 20 tubing	Intramedic	427406	Non-radiopaque, Non-toxic
3-0 Silk suture thread	Syneture	Sofsilk	Non-absorbent
Silicone grease	Warner Instrument	64-0378	Odorless
2% Xylocaine gel	AstraZeneca	Prod. No 061	Lidocaine hydrochloride jelly, purchased at local pharmacy
Paint brush	Dynasty	206R	Similar size/other brands work too
Peppermint extract	Sigma-Aldrich	W284807	Other brands should be okay too
Training box	Custom-made	N/A	Acrylic box (20 x 20 x 5 cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors
Testing chamber	Custom-made	N/A	Stainless steel (30 x 20 x 18 cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used
pCREB antibody	Cell Signaling	9198	Ser 133 (87G3) Rabbit mAb
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	C8383	N/A
Paraformaldehype	Sigma-Aldrich	P6148	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378	N/A