Un laterizzazione Odore Learning Modello in ratti neonati per dissezione Formazione Neural circuiti Sostenere la memoria

Riepilogo

This protocol introduces lateralized early odor preference learning in rats using acute single naris occlusion. Lateralized learning permits the examination of behavioral outcomes and underpinning biological mechanisms within the same animals, reducing variance induced by between-animal designs. This protocol can be used to investigate molecular mechanisms underpinning early odor learning.

Abstract

Rat pups during a critical postnatal period (≤ 10 days) readily form a preference for an odor that is associated with stimuli mimicking maternal care. Such a preference memory can last from hours, to days, even life-long, depending on training parameters. Early odor preference learning provides us with a model in which the critical changes for a natural form of learning occur in the olfactory circuitry. An additional feature that makes it a powerful tool for the analysis of memory processes is that early odor preference learning can be lateralized via single naris occlusion within the critical period. This is due to the lack of mature anterior commissural connections of the olfactory hemispheres at this early age. This work outlines behavioral protocols for lateralized odor learning using nose plugs. Acute, reversible naris occlusion minimizes tissue and neuronal damages associated with long-term occlusion and more aggressive methods such as cauterization. The lateralized odor learning model permits within-animal comparison, therefore greatly reducing variance compared to between-animal designs. This method has been used successfully to probe the circuit changes in the olfactory system produced by training. Future directions include exploring molecular underpinnings of odor memory using this lateralized learning model; and correlating physiological change with memory strength and durations.

Introduzione

L'olfatto è la modalità sensoriale primaria nei roditori, senza il quale non sarebbero in grado di navigare con successo o di sopravvivere nel loro ambiente. E 'particolarmente critico per cuccioli neonati, che non possono né vedere, né udire durante la prima settimana post-natale, per usare l'olfatto al fine di individuare la loro madre per alimentare ^1. Come risultato, ratti neonatali possono essere condizionati a preferire gli odori con semplici manipolazioni sperimentali. Una varietà di stimoli sono stati utilizzati come stimolo incondizionato (UCS) per indurre risposte condizionate a nuovi odori (stimolo condizionato, CS) nei neonati, tra cui l'ambiente di nidificazione ^2,3, latte lattante ^4-6, accarezzando o stimolazione tattile ^{7- 12,} tail pinch ^13, saliva materna ^13, lieve scossa piede ^14-18, e la stimolazione cerebrale intracranica ^19. Il presente studio si avvale di un odore precoce preferenza paradigma consolidato in cui un odore, in questo caso menta piperita, is combinata con stimolazione tattile per produrre una preferenza per piperita 24 ore dopo ^10,11,20. Questi odori ricordi dipendono dal circuito olfattivo intatto, tra cui in primo luogo il bulbo olfattivo (OB) ^21-23 e la corteccia piriforme anteriore (APC) ^24,25.

Indagini sperimentali dei primi preferenza odore di apprendimento hanno approfondito e ampliato la nostra comprensione delle basi molecolari e fisiologiche di una memoria mammiferi. Questo modello mammiferi ha diversi vantaggi nello studio dei meccanismi della memoria. In primo luogo, sono state individuate le sorgenti neurali del segnale UCS. Vari stimoli come detto sopra stimolano locus coeruleus noradrenalina rilascio ^26, che a sua volta attiva più adrenocettori nel OB e APC, causando effetti cellulari e fisiologici che sostengono l'apprendimento ^22,27,28. In secondo luogo, i meccanismi di memoria portante avvengono in strutture neurali laminari ben definite. Ilsemplicità dei circuiti olfattiva nei ratti neonati fornisce ai ricercatori con il quadro ideale con cui scoprire i processi complessi legati alla plasticità sinaptica. Neuroni sensoriali olfattivi (OSN) nel progetto epitelio olfattivo sulla mitrale / cellule tufted in OB e questi mitrale / cellule tufted in progetto di girare ipsilaterally a corteccia piriforme (PC) attraverso il tratto olfattivo laterale (LOT), tra le altre strutture ^29. Entrambe le sinapsi OSN della OB ^30,31 e la sorte sinapsi ^24,25 in aPC sono stati identificati come loci critici per cambiamenti sinaptici che supportano l'apprendimento e la memoria. In terzo luogo, in tenera età nei ratti, ingressi olfattive possono essere facilmente lateralizzato. Ogni APC ha accesso alle informazioni bilaterale odore attraverso la commessura anteriore una volta che questa sostanza bianca è completamente formato in post-natale giorno 12 (PD12) ^32. Prima di PD 12, ingresso odore può essere isolato a ipisilateral OB e APC attraverso un'unica narice occlusione ^{24,25,31,33,34 <}/ Sup>. Singola narice occlusione permette la formazione della memoria odore dalla narice aperta ed impedire la stessa memoria dei narice occluse prima di PD 12 ^33. Memoria odore è isolato per l'emisfero ipsilaterale compreso sia OB e APC. Pertanto, ogni pup ratto può essere il proprio controllo per l'apprendimento e alla base della fisiologia.

Nel presente studio, è introdotto l'odore primi protocollo apprendimento preferenza lateralizzato. Questo metodo serve come un potente strumento per studiare i meccanismi neurali alla base dell'apprendimento odore, fornendo un controllo intra-animale ^24,25,31, riducendo in tal modo sia il numero di animali necessari e la variazione generale. Naris occlusione è reversibile in quanto il tappo di grasso o naso può essere applicato e rimosso con il minimo stress o danni per l'animale. Qui, in primo luogo, vengono descritte le procedure dettagliate di odore precoce preferenza formazione e test, con un focus sul protocollo lateralizzante con occlusione singola narice con un nose spina. Poi i risultati vengono presentati per dimostrare l'efficacia del singolo occlusione narice a isolare ingresso odore e la produzione di memoria odore lateralizzato. Infine, le potenzialità di utilizzo di questo modello di apprendimento lateralizzato per studiare i cambiamenti fisiologici nel sistema olfattivo che entrambi generano l'apprendimento e la memoria supporto di espressione sono discussi.

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Protocollo

Sono utilizzati Sprague Dawley di ratto (Charles River) cuccioli di entrambi i sessi. Cucciolate sono abbattuti a 12 su PD1 (nascita essendo PD0). Le dighe sono mantenuti su una 12 ore di luce / buio ciclo con ad libitum l'accesso al cibo e all'acqua. Procedure sperimentali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care del Memorial University.

1 Nose Plug costruzione

NOTA:. Questa procedura è stato adattato e modificato da Cummings et al (1997) ^35.

1. Aquire polietilene-20 tubo e filo di sutura di seta 3-0.
2. Tagliare un piccolo pezzo di polietilene-20 tubo di circa 0,8 mm.
3. Discussione sutura di seta attraverso la tubazione disposta in modo tale che vi sia filo su entrambi i lati della sezione del tubo.
4. Su una estremità del filo esterno del tappo, un nodo nel filo.
5. Estrarre la sezione della tubazione giù sopra il nodo nel thread. Il nodo dovrebbe presentare all'interno del tubo.
6. Tagliare le due estremità del filo in modo tale che ~ 2 mm filo sporge da un'estremità del tubo (vedere Figura 1A).

2 Naris occlusione prima di Formazione

1. Rimuovere pup dalla diga e mettere in un piatto coperto custodito con biancheria da letto regolari.
2. Utilizzare un'applicazione punta di cotone per tamponare una gelatina anestetico locale, 2% Xylocaine, sulle narice da occluso.
3. Lasciare il cucciolo di riposare nel piatto per ~ 3 min.
4. Tenere il cucciolo delicatamente ma saldamente in mano non dominante.
5. Usando la mano dominante, prendere un tappo il naso e tamponare la stessa pappa anestetico locale intorno alla punta da cui il filo non sporga. Questo agirà sia come anestetico per eventuali dolori lievi associati con l'inserimento spina e agirà come un lubrificante all'interno della narice. NOTA: L'effetto di Xylocaine inizia entro un paio di minuti e dura 20-30 minuti. Pups in generale mostrano una buona tolleranza per l'inserimento spina dopo l'applicazione gelatina Xylocaine (minimum lottare e vocalizzazione).
6. Inserire delicatamente la spina naso tenendo saldamente il cucciolo e ruotando lentamente la spina con spinte molto dolci fino a quando la spina sia completamente inserita e solo il thread 2 millimetri sporge dalla narice (vedi Figura 1B). Non ci dovrebbero essere sanguinamento da entrambi narice durante questo processo. Sono esclusi e restituiti dighe Pups con sanguinamento durante l'inserimento spina naso
7. Consentire agli animali di riposare in questo piatto per 5 minuti in modo da abituare alla spina.
8. Rimuovere il cucciolo dal piatto assuefazione e iniziare il paradigma di condizionamento ^24.

Figura 1 Costruzione di un tappo naso. A) Schema che mostra le fasi di fare una spina naso. Un filo è tirato attraverso il tubo di polietilene; un nodo è fatto e PULportato al centro del tubo per bloccarlo; due estremità sono tagliate con un residuo di 2 mm su un'estremità del tubo. B) Vista frontale e laterale di un ratto con una spina naso in una narice.

3. Profumato Bedding Preparazione

1. Indossando guanti nuovi e in una cappa aspirante per evitare la contaminazione odori, inserire 500 ml di biancheria da letto di trucioli di legno in un sacchetto di plastica.
2. Utilizzare una siringa per elaborare 0,3 ml di estratto di menta piperita, e spruzzare questo sopra la biancheria nel sacchetto di plastica.
3. Legare la borsa chiusa, agitare vigorosamente il sacchetto, e lasciare la biancheria da letto per riposare in borsa per 5 min.
4. Posizionare la biancheria profumata in modo chiaro, poco profondo, scatola acrilica di formazione (20 x 20 x 5 cm ^3, Figura 2A) scoperto in una cappa aspirante per 5 minuti prima dell'uso. Una volta che la biancheria da letto viene preparato, scartare questi guanti, e non permettere questi guanti vengano a contatto con gli animali.
5. Posizionare la biancheria profumata in una scatola di plastica trasparente identici, e enAssicurarsi che non entri in contatto con la biancheria profumata o guanti utilizzati.

4. Odore condizionata Paradigm (Vedi immagine in figura 2A)

Pups subiscono una singola sessione di condizionamento, il PD 6, o sessioni di prove multiple (una seduta al giorno, PD 3-6).

1. Posizionare il cucciolo abituato a biancheria da letto profumato. Per il controllo degli odori solo (O / S ^-) cuccioli, lasciare questi cuccioli sulla biancheria da letto per 10 minuti, quindi passare al punto 4.5. Per la corsa sperimentale odore + (O / S ⁺⁾ cuccioli, continuano i seguenti passaggi in questa sezione.
2. Stroke il cucciolo per 30 secondi con un piccolo pennello. Usa movimenti circolari rapidi principalmente intorno alla regione posteriore del cucciolo.
3. Lasciare il cucciolo a riposare per 30 sec.
4. Ripetere i punti 4.2 e 4.3 per un totale di 10 min (cioè 10 coppie di carezze + odore).
5. Rimuovere pup dalla casella di condizionamento, rimuovere il tappo il naso e tornare il cucciolo alla diga.

5. Lateralizzato Preferenza Odore Testing (Vedi immagine in figura 2B)

Test avviene in vari momenti (ad esempio, 24 o 48 ore) a seguito della sessione di allenamento finale. Il test viene effettuato in una camera di acciaio inossidabile test (30 x 20 x 18 cm ^3), che è posto sulla parte superiore di due scatole di formazione (training casella è descritto in 3.4), separate da una zona neutra 2 cm. Una scatola di formazione contiene biancheria da letto di menta profumata, mentre l'altra scatola contiene pulita, biancheria da letto inodore. Il pavimento della camera di prova è una griglia metallica, che viene poi ricoperto da un foglio rimovibile di rete plastica (Figura 2B).

1. Preparare una menta piperita e una biancheria profumata ai sensi dell'articolo 3, e porre ogni casella sotto lati opposti della camera di prova, 2 cm l'uno dall'altro. Inserire la rete plastica sul pavimento metallo-griglia della camera di prova.
2. Rimuovere il cucciolo dalla diga e mettere una piccola quantità di grasso inodore ferma al silicone sulle nariceche è occluso durante l'allenamento. Re-applicare il grasso durante la prima procedura di test come necessario. NOTA: naris occlusione casuale durante l'allenamento e le prove possono essere considerate per evitare distorsioni.
3. Posizionare pup in zona neutra della camera di prova.
4. Lasciare il cucciolo di esplorare la camera per 1 minuto, registrando per quanto tempo il cucciolo ha speso sopra i due lati della camera (cioè più di menta piperita o di letti neutro profumato).
5. Lasciare il cucciolo a riposare per 1 minuto in una camera di contenimento di plastica coperto.
6. Ripetere i punti 5.2 e 5.3 per un totale di 10 min (cioè 5 prove di laboratorio, separati da 5 studi di riposo) commutazione l'orientamento iniziale del cucciolo nella camera per controllare per le preferenze di direzione.
7. Subito dopo il test, rimuovere il grasso dalla narice.
8. Inserire una noseplug polietilene nella narice opposta di cui al punto 2 e consentire agli animali di riposare per 10 min.
9. Testare il cucciolo ancora una volta come in 5.3 -5.6, rimuovere il tappo, e tornare il cucciolo alla diga. Rimuovere e pulire la rete di plastica della camera di test con etanolo al 95% e che il liquido evapori. Posizionare la maglia indietro prima di testare il prossimo cucciolo.
   NOTA: Applicare grasso al silicone al primo occlusione narice durante i test previene il rischio di sanguinamento e di stress associato con l'inserimento spina naso.

Figura 2 odore precoce preferenza di formazione e test. A) la formazione degli odori precoce preferenza utilizzando odore + accarezzare paradigma. B) Due scelta odore test preferenza con biancheria da letto di menta piperita su un lato, il controllo di letti inodore sul lato opposto. Una zona neutra 2 cm è messo in mezzo.

6. testare l'efficacia del singolo Naris Occlusione

nt "> Questo esperimento viene eseguito per determinare se l'occlusione singola narice porta all'attivazione lateralizzato del sistema olfattivo.

1. Eseguire occlusioni Naris unilaterali sul PD 6 o 7 cuccioli come descritto nella sezione 2.
2. Dopo ~ 5 min assuefazione, mettere il cucciolo in un contenitore di plastica coperto ed esporlo a 30 ml di olio di menta piperita puro imbevuti di un pezzo di tessuto per 10 min.
3. Subito dopo l'esposizione odore menta piperita, iniettare il cucciolo per via intraperitoneale (ip) con cloralio idrato (400 mg / kg) come anestetico generale o pentobarbitol, (150 mg / kg).
4. Una volta completamente anestetizzato (mostrando alcuna risposta alla coda o il piede pizzico), transcardiaca profumato il cucciolo con le soluzioni di ghiaccio-freddo di soluzione fisiologica (0,9%) per ~ 1 min, seguito da paraformaldeide (4%, disciolto in soluzione tampone fosfato 0.1 M, PBS ).
5. Dopo 10 min di paraformaldeide perfusione, raccogliere il cervello e metterlo in paraformaldeide notte a 4 ° C, poi transfer il cervello di una soluzione di saccarosio (20% in PBS) per altre 24 ore.
6. Tagliare le fette di cervello coronali a 30 micron di spessore, con un criostato. Raccogliere OB e PC fette e montare su vetrini rivestiti di gelatina, seguita da colorazione immunoistochimica standard per pCREB anticorpi ^21,25,30.

7 Verifica del Reversibilità del singolo Naris Occlusione

Questo esperimento test se l'effetto di blocco è reversibile a 24 ore dopo la rimozione del tappo naso.

1. Eseguire occlusioni Naris unilaterali sul PD 6 o 7 cuccioli come descritto nella sezione 2.
2. Dopo 15 min (equivalente alla durata dell'occlusione narice durante l'allenamento - 5 min assuefazione + 10 min di formazione), rimuovere il tappo naso, e restituire il cucciolo alla diga.
3. 24 ore più tardi, esporre il cucciolo per l'odore di menta piperita in un contenitore di plastica coperto per 10 minuti come descritto al punto 6.2.
4. Seguire le stesse operazioni in settaioni 6,3-6,6.

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Risultati

Qui passiamo in rassegna alcuni dei risultati stabiliti in precedenza ²⁴ per dimostrare l'efficacia dell'occlusione narice a isolare ingresso odore e imparare a un emisfero, e la reversibilità di questo metodo.

Occlusione singola narice durante l'allenamento precoce preferenza odore conduce ad una memoria odore lateralizzato ^24. La memoria è limitata alla narice risparmiato (Figura 3). Quando i cuccioli sono testati per la preferenza odori...

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Discussione

L'apprendimento e la memoria odore modello lateralizzato in cuccioli di ratto all'interno di una finestra temporale critica è stata fondata da Hall e colleghi. In una serie di studi ^33,34,36, hanno mostrato che una memoria preferenza odore potrebbe essere lateralizzato da odori + latte abbinamenti a una narice al PD 6 cuccioli di ratto. Memoria preferenza è stata forte quando la stessa narice era aperto durante l'allenamento e test, ma non osserva quando la narice occlusa era sbloccato e testato...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polythylene 20 tubing	Intramedic	427406	Non-radiopaque, Non-toxic
3-0 Silk suture thread	Syneture	Sofsilk	Non-absorbent
Silicone grease	Warner Instrument	64-0378	Odorless
2% Xylocaine gel	AstraZeneca	Prod. No 061	Lidocaine hydrochloride jelly, purchased at local pharmacy
Paint brush	Dynasty	206R	Similar size/other brands work too
Peppermint extract	Sigma-Aldrich	W284807	Other brands should be okay too
Training box	Custom-made	N/A	Acrylic box (20 x 20 x 5 cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors
Testing chamber	Custom-made	N/A	Stainless steel (30 x 20 x 18 cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used
pCREB antibody	Cell Signaling	9198	Ser 133 (87G3) Rabbit mAb
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	C8383	N/A
Paraformaldehype	Sigma-Aldrich	P6148	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378	N/A