Un modèle d'apprentissage latéralisé odeur chez les rats nouveau-nés pour dissection Formation Neural Circuits Soutenir la mémoire

Résumé

This protocol introduces lateralized early odor preference learning in rats using acute single naris occlusion. Lateralized learning permits the examination of behavioral outcomes and underpinning biological mechanisms within the same animals, reducing variance induced by between-animal designs. This protocol can be used to investigate molecular mechanisms underpinning early odor learning.

Résumé

Rat pups during a critical postnatal period (≤ 10 days) readily form a preference for an odor that is associated with stimuli mimicking maternal care. Such a preference memory can last from hours, to days, even life-long, depending on training parameters. Early odor preference learning provides us with a model in which the critical changes for a natural form of learning occur in the olfactory circuitry. An additional feature that makes it a powerful tool for the analysis of memory processes is that early odor preference learning can be lateralized via single naris occlusion within the critical period. This is due to the lack of mature anterior commissural connections of the olfactory hemispheres at this early age. This work outlines behavioral protocols for lateralized odor learning using nose plugs. Acute, reversible naris occlusion minimizes tissue and neuronal damages associated with long-term occlusion and more aggressive methods such as cauterization. The lateralized odor learning model permits within-animal comparison, therefore greatly reducing variance compared to between-animal designs. This method has been used successfully to probe the circuit changes in the olfactory system produced by training. Future directions include exploring molecular underpinnings of odor memory using this lateralized learning model; and correlating physiological change with memory strength and durations.

Introduction

L'olfaction est la modalité sensorielle primaire chez les rongeurs, sans laquelle ils ne seraient pas en mesure de naviguer avec succès ou survivre dans leur environnement. Il est particulièrement important pour les chiots nouveau-nés, qui ne peuvent ni voir, ni entendre au cours de la première semaine après l'accouchement, à utiliser olfaction afin de localiser leur mère pour nourrir ^1. En conséquence, les ratons nouveau-nés peuvent être conditionnés à préférer les odeurs avec des manipulations expérimentales simples. Une variété de stimuli ont été utilisés comme le stimulus inconditionnel (UCS) pour induire des réponses conditionnées à de nouvelles odeurs (de relance conditionné, CS) du nouveau-né, y compris l'environnement de nidification ^2,3, le lait de lait ^4-6, caressant ou stimulation tactile ^{7 12,} pincement de la queue ^13, la salive maternelle ^13, choc de pied doux ^14-18, et la stimulation cérébrale intracrânienne ^19. La présente étude utilise un modèle de préférence au début odeur bien établi, dans lequel une odeur, dans ce cas, la menthe poivrée, is combinée à une stimulation tactile, afin de produire une préférence pour la menthe poivrée 24 h plus tard ^10,11,20. Ces odeurs souvenirs dépendent circuit olfactif intact, incluant notamment la le bulbe olfactif (OB) ^21-23 et le cortex piriforme antérieur (APC) ^24,25.

Des études expérimentales de l'apprentissage des préférences des odeurs début ont approfondi et élargi notre compréhension des mécanismes moléculaires et physiologiques d'une mémoire de mammifères. Ce modèle mammifère a plusieurs avantages à étudier les mécanismes de la mémoire. Tout d'abord, les sources de neurones du signal UCS ont été identifiés. Divers stimuli comme mentionné ci-dessus stimulent le locus coeruleus la libération de norépinéphrine ^26, qui à son tour active plusieurs récepteurs adrénergiques dans l'OB et l'APC, entraînant des effets cellulaires et physiologiques qui appuient l'apprentissage ^22,27,28. D'autre part, des mécanismes de support de la mémoire prennent place dans des structures neurales laminaires bien définies. Lasimplicité du circuit olfactif chez les rats nouveau-nés fournit aux chercheurs un cadre idéal avec lequel de découvrir les processus complexes liés à la plasticité synaptique. Neurones olfactifs sensoriels (OSN) dans le projet de l'épithélium olfactif SUR DES mitrale cellules / tuftés dans l'OB et ces mitrale cellules / tuftés dans le projet de tour ipsilatéralement à cortex piriforme (PC) via le tractus olfactif latéral (LOT), entre autres structures ^29. Les deux synapses OSN dans l'OB ^30,31 et ^24,25 LOT synapses dans PCa ont été identifiés comme lieux critique des changements synaptiques qui favorisent l'apprentissage et la mémoire. Troisièmement, dans un âge précoce chez les rats, les entrées olfactives peuvent être facilement latéralisés. Chaque APC accès à l'information de l'odeur bilatérale par la commissure antérieure, une fois cette substance blanche est entièrement formé à jour après la naissance 12 (PD12) ^32. Avant PD 12, entrée de l'odeur peut être isolé à ipisilateral OB et APC par simple occlusion de la narine ^{24,25,31,33,34 <}/ Sup>. Simple narine occlusion permet la formation de la mémoire de l'odeur de la narine ouverte, et empêche même la mémoire des narine occlus avant PD 12 ^33. Mémoire l'odeur est isolé à l'hémisphère ipsilatéral incluant à la fois l'OB et l'APC. Par conséquent, chaque chiot de rat peut être son propre témoin pour l'apprentissage et qui sous-tendent la physiologie.

Dans la présente étude, l'odeur début protocole d'apprentissage de préférence latéralisé est introduit. Cette méthode est un outil puissant pour étudier les mécanismes neuronaux qui sous-tendent l'apprentissage des odeurs en fournissant un contrôle intra-animaux ^24,25,31, réduisant ainsi le nombre d'animaux requis et la variation générale. Narine occlusion est réversible en ce que le bouchon de graisse ou le nez peut être appliqué et retiré au stress ou des dommages à l'animal minimal. Ici, en premier lieu, des procédures détaillées de la formation des préférences des odeurs précoce et les tests sont décrits, avec un accent sur le protocole latéralisée à l'aide unique occlusion de la narine avec un n °prise e. Ensuite, les résultats sont présentés pour démontrer l'efficacité de la seule occlusion de la narine à isoler l'entrée de l'odeur et la production de la mémoire des odeurs latéralisée. Enfin, les potentiels de l'utilisation de ce modèle d'apprentissage latéralisée à étudier les changements physiologiques dans le système olfactif que les deux génèrent l'apprentissage et la mémoire de soutien expression sont discutées.

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Protocole

Sprague Dawley (Charles River) chiots des deux sexes sont utilisés. Portées sont abattus à 12 sur PD1 (naissance étant PD0). Les barrages sont maintenus sur un 12 h cycle lumière / obscurité avec un accès ad libitum à la nourriture et de l'eau. Les procédures expérimentales ont été approuvés par des institutionnels Comité de protection des animaux de l'Université Memorial.

1. Nez plug Construction

REMARQUE:. Cette procédure a été adapté et modifié de Cummings et al (1997) ^35.

1. Acquérir tubes polyéthylène-20 et 3-0 fil de suture de soie.
2. Couper un petit morceau de tube de polyethylene 20 à environ 0,8 mm.
3. Fil de suture en soie à travers le tube disposé de sorte qu'il existe fil de chaque côté de la section de tube.
4. À une extrémité du fil à l'extérieur du bouchon, un nœud dans le fil.
5. Tirez la section de tube vers le bas sur le noeud dans le fil. Le noeud doit loger dans la tubulure.
6. Couper les deux extrémités du fil de telle sorte que ~ 2 mm de fil fait saillie à partir de l'une des extrémités du tube (voir figure 1A).

2. Naris occlusion avant la formation

1. Retirer chiot de barrage et les placer dans un plat couvert et sécurisé avec une literie régulière.
2. Utilisez une application de coton-tige pour tamponner une gelée d'anesthésique local, la xylocaïne 2%, sur les narine à occlus.
3. Laisser le chiot de se reposer dans le plat pour ~ 3 min.
4. Tenez le chiot doucement mais fermement dans la main non dominante.
5. Utilisation de la main dominante, prendre un pince-nez et tamponnez la même gelée anesthésique local autour de la pointe de laquelle le fil ne dépasse pas. Ceci agira à la fois comme un anesthésique pour des douleurs mineures associées à l'insertion de la fiche et agira comme un lubrifiant à l'intérieur de la narine. NOTE: L'effet de xylocaïne commence dans quelques minutes et dure 20-30 minutes. Chiots donnent en général de bonne tolérance pour l'insertion de bouchon après l'application de la xylocaïne de gelée (minimum difficulté et la vocalisation).
6. Insérez délicatement le pince-nez en tenant fermement le chiot et tournant lentement la prise avec des poussées très doux jusqu'à ce que la fiche est entièrement insérée et seul le fil de 2 mm est en saillie de la narine (voir figure 1B). Il devrait y avoir aucun saignement soit de narine pendant ce processus. Chiots avec des saignements pendant l'insertion de pince-nez sont exclus et renvoyés aux barrages
7. Laisser l'animal de se reposer dans ce plat pendant 5 minutes afin de s'habituer à la fiche.
8. Retirer le chiot de la boîte de l'accoutumance et de commencer le paradigme de conditionnement ^24.

Figure 1: Construction d'un pince-nez. A) Schéma montrant les étapes de fabrication d'un pince-nez. Un fil est tiré à travers des tubes de polyéthylène; un nœud est fait et puldirigé vers le milieu de la tubulure à la bloquer; deux extrémités sont coupées avec un résidu de 2 mm à une extrémité de la tubulure. B) de face et vue latérale d'un rat avec un bouchon de nez dans une narine.

3. parfumée Literie Préparation

1. Le port de gants neufs et dans une hotte pour éviter la contamination de l'odeur, placer 500 ml de literie de copeaux de bois dans un sac en plastique.
2. Utiliser une seringue de dresser 0,3 ml d'extrait de menthe poivrée, et pulvériser ce sur la literie dans le sac de plastique.
3. Attachez le sac hermétiquement, secouer vigoureusement le sac, et laisser la litière pour se reposer dans le sac pendant 5 min.
4. Placez la litière parfumée dans un plat peu profond boîte transparente, acrylique formation (20 x 20 x 5 cm ^3, figure 2A) découvert dans une hotte pendant 5 minutes avant de l'utiliser. Une fois que la literie est préparé, jeter ces gants, et ne permettent pas à ces gants pour entrer en contact avec les animaux.
5. Placez la litière non parfumée dans une boîte en plastique transparent identique, et envous qu'il n'entre pas en contact avec la litière parfumée ou les gants utilisés.

4. Odeur paradigme de conditionnement (voir photo dans la figure 2A)

Chiots subissent soit une seule séance de conditionnement, sur PD 6, ou des séances d'essais multiples (une séance par jour, PD 3-6).

1. Placez le chiot habitué sur la literie parfumée. Pour le contrôle d'odeur que (O / S ^-) chiots, laisser ces petits sur la literie pendant 10 min, puis passez à l'étape 4.5. Pour l'odeur + course expérimentale (O / S ⁺⁾ chiots, continuent à les étapes suivantes dans cette section.
2. Accident vasculaire cérébral le chiot pendant 30 secondes à l'aide d'un petit pinceau. Utilisez des mouvements circulaires rapides principalement autour de la région postérieure du chiot.
3. Laisser le chiot se reposer pendant 30 secondes.
4. Répétez les étapes 4.2 et 4.3 pour un total de 10 min (soit 10 paires de caresser + odeur).
5. Retirer chiot dans la zone de conditionnement, retirer le bouchon de nez et retourner le chiot au barrage.

5. Latéralisée Odeur préférence essais (voir photo dans la figure 2B)

Test produit à différents points dans le temps (par exemple, 24 ou 48 h) après la dernière séance d'entraînement. Les essais sont effectués dans une chambre inoxydable de test en acier (30 x 20 x 18 cm ^3), qui est placé au-dessus de deux zones de formation (zone de formation est décrite dans la section 3.4), séparés par une zone neutre de 2 cm. Boîte de formation d'une literie contient de la menthe poivrée au parfum tandis que l'autre boîte contient la litière propre et inodore. Le plancher de la chambre d'essai est une grille métallique, qui est ensuite recouvert d'une feuille de plastique amovible de maille (figure 2B).

1. Préparer un menthe poivrée et un literie non parfumé, conformément au paragraphe 3, et placer chaque case sous les côtés opposés de la chambre d'essai, 2 cm. Placer la grille de plastique sur le plancher métallique de la grille de la chambre d'essai.
2. Retirer le chiot à partir du barrage et placer une noisette de graisse inodore cabinet de silicone sur les narinequi est obstruée au cours de la formation. Ré-appliquer de la graisse tout au long de la première procédure de test en fonction des besoins. REMARQUE: Random narine occlusion pendant la formation et les tests peuvent être considérés pour éviter les biais.
3. Passer chiot dans la zone neutre de la chambre d'essai.
4. Laisser le chiot à la découverte de la chambre pour 1 minute, en enregistrant combien de temps le chiot a passé au cours des deux côtés de la chambre (soit plus de menthe poivrée ou de la literie neutre parfumé).
5. Laisser le chiot se reposer pendant 1 min dans une chambre en plastique de maintien couverte.
6. Répétez les étapes 5.2 et 5.3 pour un total de 10 minutes (soit 5 de tests, séparés par 5 essais de repos) de commutation de l'orientation initiale du chiot dans la chambre afin de contrôler les préférences de direction.
7. Immédiatement après le test, essuyer la graisse de la narine.
8. Insérez un noseplug de polyéthylène dans la narine opposée conformément à l'article 2 et permettre à l'animal de se reposer pendant 10 min.
9. Testez le chiot une fois de plus que dans 5.3 -5.6, enlever le bouchon, et retourner le chiot au barrage. Retirer et nettoyer le filet de plastique de la chambre d'essai avec 95% d'éthanol et laisser le liquide s'évaporer. Placez la maille dos avant de tester la prochaine chiot.
   REMARQUE: l'application de la graisse de silicone à la première occlusion de la narine au cours des essais empêche le risque de saignement et le stress associé à l'insertion de pince-nez.

Figure formation des préférences 2. odeur précoce et les tests. A) la formation d'odeurs précoce des préférences avec odeur + caressant paradigme. B) de test de préférence odeur Deux choix de la literie de menthe poivrée sur un côté, le contrôle de la literie non parfumé sur le côté opposé. Une zone neutre de 2 cm est placé entre les deux.

6 Test de l'efficacité de l'unité Naris occlusion

nt "> Cette expérience est effectuée pour déterminer si simple occlusion de la narine conduit à l'activation latéralisée du système olfactif.

1. Effectuer occlusions INRA unilatérales sur PD 6 ou 7 chiots comme décrit dans la section 2.
2. Après environ 5 min accoutumance, placer le chiot dans un récipient en plastique couverte et de l'exposer à 30 ul d'huile de menthe poivrée pur trempés dans un morceau de tissu pendant 10 min.
3. Immédiatement après l'exposition à l'odeur de menthe poivrée, le chiot injecter par voie intrapéritonéale (ip) avec l'hydrate de chloral (400 mg / kg) comme anesthésique général ou pentobarbital (150 mg / kg).
4. Une fois complètement anesthésiés (ne présentant pas de réponse à la queue ou le pied presseur), perfuser transcardiaque le chiot avec des solutions de glace de la solution saline (0,9%) pendant environ 1 min, suivi par du paraformaldéhyde (4%, dissous dans une solution tampon 0,1 M de phosphate, PBS ).
5. Après 10 min de paraformaldéhyde perfusion, de recueillir le cerveau et le placer dans paraformaldéhyde nuit à 4 ° C, puis transfert le cerveau à une solution de saccharose (20% dans PBS) pendant une heure 24 supplémentaire.
6. Couper les tranches coronales de cerveau à 30 um d'épaisseur avec un cryostat. Recueillir OB et PC tranches et monter sur des lames recouvertes de gélatine, suivie d'une coloration standard d'immunohistochimie pour pCREB anticorps ^21,25,30.

7 Test de la réversibilité de l'unité Naris occlusion

Cette expérience teste si l'effet de blocage est réversible à 24 heures après l'enlèvement du bouchon de nez.

1. Effectuer occlusions INRA unilatérales sur PD 6 ou 7 chiots comme décrit dans la section 2.
2. Après 15 min (équivalente à la durée de l'occlusion de la narine lors de la formation - 5 min accoutumance + 10 min de la formation), retirez la fiche de nez, et retourner le chiot au barrage.
3. 24 heures plus tard, exposer le chiot à l'odeur de menthe poivrée dans un récipient en plastique couvert pendant 10 min comme décrit en 6.2.
4. Suivez mêmes étapes de la secteions 06.03 à 06.06.

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Résultats

Ici nous passons en revue quelques-uns des résultats précédemment établis ²⁴ pour démontrer l'efficacité de l'occlusion de la narine à isoler l'entrée de l'odeur et de l'apprentissage à un hémisphère, et la réversibilité de cette méthode.

Simple occlusion de la narine lors de l'entraînement au début de la préférence des odeurs conduit à une mémoire des odeurs latéralisée ^24. La mémoire est limité à la narine épargné

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Discussion

L'apprentissage de l'odeur et de la mémoire modèle latéralisée chez les bébés rats dans une fenêtre de temps critique a été créé par Hall et ses collègues. Dans une série d'études ^33,34,36, ils ont montré que d'une mémoire de préférence odeur pourrait être latéralisé par les odeurs + lait appariements à une narine à PD 6 chez les ratons. mémoire préférence était robuste quand même narine était ouvert pendant l'entraînement et les tests, mais pas observée lors...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polythylene 20 tubing	Intramedic	427406	Non-radiopaque, Non-toxic
3-0 Silk suture thread	Syneture	Sofsilk	Non-absorbent
Silicone grease	Warner Instrument	64-0378	Odorless
2% Xylocaine gel	AstraZeneca	Prod. No 061	Lidocaine hydrochloride jelly, purchased at local pharmacy
Paint brush	Dynasty	206R	Similar size/other brands work too
Peppermint extract	Sigma-Aldrich	W284807	Other brands should be okay too
Training box	Custom-made	N/A	Acrylic box (20 x 20 x 5 cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors
Testing chamber	Custom-made	N/A	Stainless steel (30 x 20 x 18 cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used
pCREB antibody	Cell Signaling	9198	Ser 133 (87G3) Rabbit mAb
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	C8383	N/A
Paraformaldehype	Sigma-Aldrich	P6148	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378	N/A