神経回路基盤記憶形成を解剖するための新生児ラットの左右で非対称匂い学習モデル

要約

This protocol introduces lateralized early odor preference learning in rats using acute single naris occlusion. Lateralized learning permits the examination of behavioral outcomes and underpinning biological mechanisms within the same animals, reducing variance induced by between-animal designs. This protocol can be used to investigate molecular mechanisms underpinning early odor learning.

要約

Rat pups during a critical postnatal period (≤ 10 days) readily form a preference for an odor that is associated with stimuli mimicking maternal care. Such a preference memory can last from hours, to days, even life-long, depending on training parameters. Early odor preference learning provides us with a model in which the critical changes for a natural form of learning occur in the olfactory circuitry. An additional feature that makes it a powerful tool for the analysis of memory processes is that early odor preference learning can be lateralized via single naris occlusion within the critical period. This is due to the lack of mature anterior commissural connections of the olfactory hemispheres at this early age. This work outlines behavioral protocols for lateralized odor learning using nose plugs. Acute, reversible naris occlusion minimizes tissue and neuronal damages associated with long-term occlusion and more aggressive methods such as cauterization. The lateralized odor learning model permits within-animal comparison, therefore greatly reducing variance compared to between-animal designs. This method has been used successfully to probe the circuit changes in the olfactory system produced by training. Future directions include exploring molecular underpinnings of odor memory using this lateralized learning model; and correlating physiological change with memory strength and durations.

概要

嗅覚は、彼らが正常に移動したり、その環境の中で生き残ることができないであろうことなく、げっ歯類における一次感覚モダリティである。これは^、1を養うために母親を見つけるために嗅覚を使用するために、最初の出生後の週の間に見ることも聞くこともできない新生児の仔、特に重要である。その結果、新生仔ラットの仔は、簡単な実験操作で臭いを好むように調整することができる。さまざまな刺激は、ネスティング環境^2,3を含む新生児、ミルク授乳^4-6、なでたり触覚刺激⁷で（条件刺激、CS）小説臭いに調整応答を誘導することが無条件刺激（UCS）として使用されている^12、テールピンチ^13、母性唾液^13、穏やかなフットショック^14-18、および頭蓋脳刺激^19。本研究は、私は、この場合はペパーミントに、十分に確立された初期の匂いの嗜好パラダイム請求臭気を採用ペパーミント24時間後^10,11,20に対する選好を生成するために、触覚刺激と組み合わせることよ。これらの悪臭メモリは、主に嗅球^{（OB）21〜23}と前梨状皮質^{（APC）24,25}を含め、無傷の嗅覚回路に依存している。

初期の匂いの嗜好学習の実験的研究は、深めおよび哺乳類メモリの分子および生理学的基盤の理解を広げてきた。この哺乳動物モデルは、メモリメカニズムを研究するいくつかの利点を有する。まず、UCS信号の神経源が同定されている。前述のようにさまざまな刺激が順番に^22,27,28の学習サポート細胞および生理学的効果を引き起こし、OBおよびAPCで複数のアドレナリン受容体を活性化させる軌跡青斑のノルエピネフリン放出^26を刺激する。次に、メモリ支持機構は明確に定義された層状の神経構造に起こる。ザ·新生ラットにおける嗅覚回路のシンプルさがシナプス可塑性に関連する複雑なプロセスを明らかにした理想的なフレームワークを研究者に提供します。他の構造²⁹の中で、OBと同側外側嗅索（LOT） を介して梨状皮質（PC）へのターンプロジェクトでこれらの僧帽/房状細胞での僧帽/房状細胞への嗅上皮プロジェクト内の嗅覚感覚ニューロン（OSN）、。 OB中OSNシナプスの両方が^30,31およびAPCにおけるLOTシナプス^24,25学習および記憶をサポートするシナプスの変化に重要な遺伝子座として同定されている。第三に、ラットでの初期の時代に、嗅覚の入力が容易に左​​右で非対称にすることができます。この白質が完全に生後12日目^（PD12）32が形成されると、各APCは前交連を介した二国間の匂い情報へのアクセスを持っています。 PD 12の前に、臭気の入力は^、<単一鼻孔閉塞^{24,25,31,33,34}を通じてOBとAPCをipisilateralする単離することができる/ SUP>。シングル鼻孔閉塞はオープン鼻孔から臭気記憶形成を可能にし、前に、PD ^12〜33に閉塞鼻孔から同じメモリを防ぐことができます。臭気メモリはOBおよびAPCの両方を含む同側半球に分離されている。したがって、各ラットの仔は生理学を学び、支えるためにそれ自体の制御することができます。

本研究では、左右で非対称に早期臭気嗜好学習プロトコルが導入される。この方法は、それによって必要な動物の数と一般バリエーションの両方を削減、内動物管理^24,25,31を提供することにより、臭気の学習を支える神経機構を研究するための強力なツールとして機能します。鼻孔の閉塞は、グリースまたは鼻栓を適用し、最小限のストレス又は動物への損傷を除去することができるという点で可逆的である。ここでは、まず、初期の臭気の好みのトレーニングとテストの詳細な手順は、第持つ単一の鼻孔閉塞を使用して左右で非対称プロトコルを中心に記載されているEプラグ。その後、結果は、臭気入力を単離し、左右で非対称臭気メモリを製造する際に、単一の鼻孔の閉塞の有効性を実証するために提示される。最後に、両方の学習とサポートメモリ表現を生成する嗅覚系における生理学的変化を研究するために、この左右で非対称に学習モデルを使用しての電位が議論されている。

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プロトコル

男女のスプラーグドーリーラット（チャールズリバー）の仔が使用されている。同腹仔は、PD1（誕生PD0である）で12に淘汰されている。ダムは食料と水は自由に摂取させ 、12時間の明/暗サイクルで維持されている。実験手順は、メモリアル大学の動物実験委員会によって承認されている。

1鼻プラグ建設

注：この手順では、適応とカミングスらから変更されました（1997年^）35。

1. AQUIREポリエチレン-20チューブと3-0絹縫合糸。
2. 約0.8mmとポリエチレン20チューブの小片をカット。
3. チューブの部分の両側のスレッドが存在するように準備されたチューブを介して糸絹縫合。
4. プラグの外側糸の一端には、スレッド内で結び目を作る。
5. スレッド内の結び目の上にダウンチューブの部分を引き出します。結び目は、管の内側に申し立てる必要があります。
6. 糸の約2 mmはチューブの一端から突出するように糸の両端をトリミング（ 図1Aを参照）。

トレーニングの前に2。ナリスオクルージョン

1. 定期的な布団で覆われた安全な皿にダムや場所から子犬を削除します。
2. 閉塞されるべき鼻孔に、局所麻酔薬ゼリー、2％キシロカインを軽くするために綿棒アプリケーションを使用します。
3. 子犬〜3分間皿に休息できるようにします。
4. 非利き手で穏やかに、しかし確実に子犬を持ってください。
5. 利き手を使用して、鼻栓をピックアップし、スレッドが突出していないから、先端の周りに同じ局所麻酔薬ゼリーを軽くたたく。これはプラグ挿入に関連するすべてのマイナー痛みのための麻酔薬の両方として機能し、鼻孔の内部潤滑剤として機能します。注：キシロカインの効果は数分以内に開始し、20〜30分続きます。キシロカインゼリー適用後のプラグ挿入のための一般的なショーの良い耐性の子犬（Minimum苦労と発声）。
6. 優しくしっかりと子犬を保持し、プラグが完全に挿入され、わずか2ミリのスレッドが鼻孔から突出するまで、ゆっくりと非常に穏やかなプッシュで、プラグを回転させることにより、鼻のプラグを差し込みます（ 図1B参照 ）。このプロセスの間のいずれかの鼻孔からの出血があってはなりません。鼻プラグ挿入時の出血の仔は除外され、ダムに戻される
7. 動物はプラグに慣らすために、5分間この料理で休むようにします。
8. 慣れ皿から子犬を外し、コンディショニングパラダイム^24を始める。

鼻プラグの図1の構築。 A）は回路図、鼻プラグを製造するステップを示す。スレッドは、ポリエチレン管を通して引っ張られている。結び目が作られ、PULさそれを遮断するチューブの途中に導か;両端は、管のうちの一方の端に2ミリメートル残基で切断されています。B）フロントと1鼻孔鼻栓ラットの側面図を。

3香り​​寝具の準備

1. 、臭気汚染を防ぐためビニール袋に木材チップの寝具の500ミリリットルを配置するために、新しい手袋を着用し、ドラフト中。
2. 0.3ミリリットルペパーミントエキスを策定するために、注射器を使用し、ビニール袋に布団の上にこれをスプレー。
3. 袋を閉じて接続し、積極的に袋を振ると、寝具は5分間の袋で休むことができます。
4. 使用前に5分間ヒュームフードで明らかになった明確な、浅い、アクリル研修箱（20×20×5cm ³の、 図2A）で香りのベッドを配置します。寝具が準備されると、これらの手袋を破棄し、これらの手袋は、動物に触れないようにしてください。
5. 同一の透明なプラスチックの箱に無香料のベッドを配置し、専用それは香りの寝具類、または使用済みの手袋と接触しないことを確認してください。

4。臭気コンディショニングパラダイム（図2（a）の画像を参照してください）

子犬は、PD 6、または複数のトライアルセッション（一日一セッション、PD 3-6）で、いずれか一つの条件付けセッションを受ける。

1. 香りの寝具に慣れ子犬を置きます。制御臭の場合のみ（O / S ^{- ）}仔、4.5に進み、その後、10分間のベッド上でこれらの子犬を残す。実験的な臭気+ストローク（O / S ^+）の仔については、このセクションの次の手順に進みます。
2. ストロークの小さな絵筆を用いて30秒間の子犬。主に子犬の後ろ足領域の周囲に急速な円運動を使用してください。
3. 子犬30秒間休ませるようにします。
4. 繰り返します（+臭いをなでるすなわち 10ペア）を10分間で合計4.2＆4.3を繰り返します。
5. 空調ボックスから子犬を外し、鼻栓を取り外し、ダムに子犬を返します。

5。左右で非対称臭気選好テスト（図2Bの図を参照）

テストは、最終的なトレーニングセッション、次 ​​のさまざまな時点（ 例えば 、24または48時間）で行われます。試験は2センチメートルニュートラルゾーンによって分離された2つのトレーニングボックス（トレーニングボックスは3.4に記載されている）の上に配置されるステンレス鋼の試験チャンバー（30×20×18 cm ³程度）で行われる。他のボックスがきれいで、無香料寝具が含まれていながら、一つのトレーニングボックスはペパーミントの香りの寝具が含まれています。試験室の床は、次にプラスチックメッシュ（ 図2B）の取り外し可能なシートによって覆われた金属格子である。

1. 第3節に従って1ペパーミントと1無臭のベッドを用意し、2センチメートル離れて、検査室の反対側の下にそれぞれのボックスを配置します。検査室の金属グリッド床にプラスチック製のメッシュを配置します。
2. ダムから子犬を外し、鼻孔に無臭シリコーングリースをしっかりDABを置くそのは、トレーニング中に吸蔵される。必要に応じて最初の試験手順全体を通してグリースを再適用します。注：ランダム鼻孔閉塞訓練および試験中はバイアスを回避するために考えることができる。
3. 検査室の中立ゾーンに子犬を置きます。
4. 子犬室の両側以上を費やしどのくらい記録、子犬1分間チャンバーを探求することを許可する（ つまり、ペパーミントまたは中立の香りの寝具の上）。
5. 子犬覆われたプラスチック製の保持チャンバーに1分間休息できるようにします。
6. 繰り返しますが、10分間、合計5.2＆5.3ステップ（ すなわち 、5残りの試行で区切っ5テストトライアル）方向の好みのために制御するために、チャンバー内の子犬の初期の向きを切り替える。
7. 直ちに試験後、鼻孔からのグリースを拭き取ってください。
8. セクション2に従って反対鼻孔にポリエチレンnoseplugを挿入し、動物を10分間休ませることができます。
9. のように、再び子犬をテスト 5.3 -5.6、プラグを取り外し、ダムに子犬を返します。取り外し、95％エタノールで試験チャンバーのプラスチックメッシュをきれいにし、液体を蒸発させる。次の子犬をテストする前に戻ってメッシュを配置します。
   注：テスト中に最初の鼻孔閉塞にシリコーングリースを適用すると、出血や鼻プラグ挿入に関連したストレスの可能性を防止します。

図2。初期の臭気の好みのトレーニングとテスト。パラダイムをなでる臭+。B）片側のペパーミント寝具を備えた2つの選択肢の匂いの嗜好性テストを使用して、A）初期の臭気の好みのトレーニング、反対側に無香料寝具を制御します。 2センチメートルニュートラルゾーンがその間に配置されている。

6。シングルナリスオクルージョンの有効性をテストする

">この実験は、単一の鼻孔閉塞が嗅覚系の左右で非対称に活性化をもたらすか否かが判定されるヌクレオチド。

1. セクション2で説明したように、PD 6または7匹に一方的な鼻孔閉塞を実行します。
2. 〜5分間の馴化後、蓋付きプラスチック容器に子犬を配置し、10分間組織片に浸し30μlの純粋なペパーミントオイルに公開。
3. すぐにペパーミント臭暴露後、全身麻酔薬、またはペントバルビタール、（150mgの/ kg）のように抱水クロラール（400 mgの/ kg）を腹腔内（IP）を子犬を注入。
4. 完全に（尾または足のピンチに応答を示さない）を麻酔したら、経心0.1 Mリン酸緩衝液、PBSに溶解したパラホルムアルデヒド（4％、続いて約1分間、生理食塩水（0.9％）の氷冷溶液との子犬を、灌流）。
5. パラホルムアルデヒド灌流の10分後、脳を収集し、4℃で一晩パラホルムアルデヒド中に入れ、その後、トランスさらに24時間、スクロース溶液（PBS中20％）に脳FER。
6. クライオスタットで30μmの厚さで冠状脳スライスをカット。 OBとPCのスライスを収集し、pCREB抗体^21,25,30のための標準的な免疫組織化学染色を行ったゼラチンコートしたスライド上にマウントします。

7シングルナリス閉塞の可逆性をテストする

ブロッキング効果は鼻栓を除去した後の24時間後に可逆的であるかどうかをこの実験をテストします。

1. セクション2で説明したように、PD 6または7匹に一方的な鼻孔閉塞を実行します。
2. （トレーニング中鼻孔閉塞の期間に相当する - 5分馴化+ 10分のトレーニング）15分後、鼻栓を取り外し、ダムに子犬を返します。
3. 6.2で説明したように24時間後、10分間の蓋付きプラスチック容器にペパーミント臭に子犬を公開します。
4. 宗派の同じ手順に従ってくださいイオンは6.3から6.6。

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結果

ここでは、臭気入力を分離して一方の半球に学ぶことに鼻孔閉塞の有効性、およびこの方法の可逆性を実証するために以前に確立された結果²⁴の一部を確認します。

初期の匂いの嗜好トレーニング中のシングル鼻孔閉塞は左右で非対称臭気メモリ²⁴につながる。メモリは免れ鼻孔（ 図3）に限定されている。子犬を訓練中のように閉塞同じ鼻?...

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ディスカッション

重要な時間ウィンドウ内仔ラットにおける左右で非対称匂い学習と記憶モデルは、第1のホールらによって設立されました。研究^33,34,36のシリーズでは、それらは、臭気嗜好メモリは仔ラットにおけるPD 6に一つの鼻孔に臭気+ミルクペアによって左右で非対称にできることを示した。優先メモリは同じ鼻孔がトレーニングやテスト中に開いていた際に堅調に推移しましたが、閉塞した鼻...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polythylene 20 tubing	Intramedic	427406	Non-radiopaque, Non-toxic
3-0 Silk suture thread	Syneture	Sofsilk	Non-absorbent
Silicone grease	Warner Instrument	64-0378	Odorless
2% Xylocaine gel	AstraZeneca	Prod. No 061	Lidocaine hydrochloride jelly, purchased at local pharmacy
Paint brush	Dynasty	206R	Similar size/other brands work too
Peppermint extract	Sigma-Aldrich	W284807	Other brands should be okay too
Training box	Custom-made	N/A	Acrylic box (20 x 20 x 5 cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors
Testing chamber	Custom-made	N/A	Stainless steel (30 x 20 x 18 cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used
pCREB antibody	Cell Signaling	9198	Ser 133 (87G3) Rabbit mAb
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	C8383	N/A
Paraformaldehype	Sigma-Aldrich	P6148	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378	N/A