מודל הלמידה Lateralized ריח חולדות ילודים לביתור גיבוש עצבי מעגל בבסיס זיכרון

Summary

This protocol introduces lateralized early odor preference learning in rats using acute single naris occlusion. Lateralized learning permits the examination of behavioral outcomes and underpinning biological mechanisms within the same animals, reducing variance induced by between-animal designs. This protocol can be used to investigate molecular mechanisms underpinning early odor learning.

Abstract

Rat pups during a critical postnatal period (≤ 10 days) readily form a preference for an odor that is associated with stimuli mimicking maternal care. Such a preference memory can last from hours, to days, even life-long, depending on training parameters. Early odor preference learning provides us with a model in which the critical changes for a natural form of learning occur in the olfactory circuitry. An additional feature that makes it a powerful tool for the analysis of memory processes is that early odor preference learning can be lateralized via single naris occlusion within the critical period. This is due to the lack of mature anterior commissural connections of the olfactory hemispheres at this early age. This work outlines behavioral protocols for lateralized odor learning using nose plugs. Acute, reversible naris occlusion minimizes tissue and neuronal damages associated with long-term occlusion and more aggressive methods such as cauterization. The lateralized odor learning model permits within-animal comparison, therefore greatly reducing variance compared to between-animal designs. This method has been used successfully to probe the circuit changes in the olfactory system produced by training. Future directions include exploring molecular underpinnings of odor memory using this lateralized learning model; and correlating physiological change with memory strength and durations.

Introduction

Olfaction הוא השיטה העיקרית חושית במכרסמים, שבלעדיו הם לא יהיו מסוגלים לנווט או לשרוד בסביבה שלהם בהצלחה. זה קריטי במיוחד עבור גורים בילוד, שלא יכול לראות ולא לשמוע במהלך השבוע שלאחר הלידה הראשונה, להשתמש olfaction על מנת לאתר את האמא שלהם כדי להאכיל ^1. כתוצאה מכך, יכולים להיות מותנים גורי חולדה ילוד להעדיף ריחות עם מניפולציות ניסיוני פשוטות. מגוון רחב של גירויים היה בשימוש כגירוי הבלתי מותנה (UCS) כדי לגרום לתגובות מותנות לריחות רומן (גירוי מותנה, CS) בילודים, לרבות סביבת קינון ^2,3, יונק חלב ^4-6, מלטף או גירוי חוש המישוש ^{7- 12,} קמצוץ זנב ^13, רוק אימהי ^13, הלם רגל קל ^14-18, וגירוי מוח תוך גולגולתי ^19. המחקר הנוכחי מעסיק הפרדיגמה העדפת ריח המוקדם מבוססת היטב שבו ריח, במקרה מנטה זה, אניs בשילוב עם גירוי חוש המישוש על מנת לייצר העדפה למנטת 24 שעות מאוחר יותר ^10,11,20. זכרונות ריחות אלה נשענים על מעגלי חוש הריח שלמים, הכוללים בעיקר את נורות חוש הריח (OB) ^21-23 וקליפת המוח הקדמי אגסי (APC) ^24,25.

חקירות ניסיוניות של למידת העדפת ריח המוקדמת העמיקו והרחיבו את ההבנה של היסודות המולקולריים ופיסיולוגיים של זיכרון יונקים שלנו. יש מודל של יונקים זה מספר יתרונות בלימוד מנגנוני זיכרון. ראשית, המקורות העצביים של אות UCS זוהו. גירויים שונים כאמור לעיל לעורר שחרור לוקוס נוראפינפרין coeruleus ^26, אשר בתורו מפעיל adrenoceptors מרובה בOB וAPC, לגרום לתופעות תאיות ופיזיולוגיות התומכות בלמידה ^22,27,28. שנית, מנגנונים תומכי זיכרון יתקיימו במבנים עצביים מינרית מוגדרת היטב.פשטות של מעגלי חוש הריח בחולדות בילוד מספקת לחוקרים את המסגרת האידיאלית שעם לחשוף את התהליכים המורכבים הקשורים לפלסטיות הסינפטית. נוירונים חושיים ריח (OSN) בפרויקט אפיתל ההרחה על צניפי תאים מצוייצים / בOB וצניפי תאים אלה / מצוייצים בפרויקט תור ipsilaterally לקליפת אגסי (PC) באמצעות לרוחב דרכי חוש הריח (הרבה), בין מבנים אחרים ^29. שתי סינפסות OSN בOB ^30,31 והרבה סינפסות ^24,25 בAPC זוהו כמוקדים קריטיים לשינויים סינפטיים שתומכים בלמידה ובזיכרון. שלישית, בגיל צעיר בחולדות, יכולות בקלות להיות lateralized תשומות חוש הריח. לכל אחד יש APC גישה למידע ריח דו צדדי באמצעות השליך קדמי פעם אחת בחומר הלבן הזה נוצר במלואו ביום 12 שלאחר לידה (PD12) ^32. לפני 12 PD, קלט ריח יכול להיות מבודד לipisilateral OB וAPC דרך חסימת Naris יחידה ^{24,25,31,33,34 <}/ Sup>. חסימת Naris יחידה מאפשרת את היווצרות זיכרון הריח מNaris הפתוח, ומונעת את אותו זיכרון מNaris occluded לפני פ"ד 12 ^33. זיכרון ריח מבודד לחצי כדור ipsilateral כולל שני OB וAPC. לכן, כל גור חולדה יכול להיות שליטה משלו ללימוד ושבסיס פיזיולוגיה.

במחקר הנוכחי, פרוטוקול למידת העדפת הריח המוקדם lateralized הוא הציג. שיטה זו משמשת ככלי רב עוצמה ללימוד מנגנונים עצביים שבבסיס למידת ריח על ידי מתן שליטת התוך בעלי חיים ^24,25,31, וכך להקטין הן את מספר בעלי החיים הנדרשים ווריאציה הכללית. חסימת Naris היא הפיכה שבתוספת השומן או האף יכולה להיות מיושמת ולהסיר עם לחץ או לניזק לבעלי החיים מינימאליים. כאן, לראשונה, נהלים מפורטים של אימוני העדפת ריח מוקדם ובדיקות מתוארים, עם דגש על פרוטוקול lateralized באמצעות חסימת Naris יחידה עם nosתקע דואר. לאחר מכן תוצאות מוצגות כדי להדגים את היעילות של חסימת Naris בודדת בבידוד קלט ריח והפקת זיכרון ריח lateralized. לבסוף, הפוטנציאל של שימוש במודל למידת lateralized זה ללמוד שינויים פיסיולוגיים במערכת חוש הריח שגם ליצור ביטוי למידה וזיכרון תמיכה הם דנו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

גורי החולדה ספראג Dawley (Charles River) משני המינים נמצאים בשימוש. המלטות נבחרות ל12 על PD1 (לידה להיות PD0). הסכרים נשמרים בשעתי אור 12 / מחזור כהה גישה כרצונך מודעת מזון ומים עם. הפרוצדורות שאושרו על ידי ועדת בעלי החיים המוסדית של האוניברסיטה ממוריאל טיפול.

בניית Plug 1 Nose

הערה:. הליך זה הותאם ושונה מאל קאמינגס et (1997) ^35.

1. צינורות aquire 20-פוליאתילן ו3-0 חוט תפר משי.
2. חותכי חתיכה קטנה של 20-פוליאתילן צינורות כ 0.8 מ"מ.
3. תפר משי חוט דרך צינורות מוכנים כך שיש חוט משני צדי הקטע של צינור.
4. בקצה אחד של החוט מחוץ לתקע, לקשור קשר בחוט.
5. משוך את הקטע של צינורות מעל הקשר בחוט. הקשר צריך להגיש בתוך צינורות.
6. חתוך את שני הקצוות של החוט כזה ש~ 2 מ"מ של חוט בולט מקצה אחד של הצינור (ראה איור 1 א).

.2 Naris ספיגה לפני אימון

1. הסר גור מהסכר ומניחים בצלחת מאובטחת מכוסות במצעים רגילים.
2. השתמש ביישום קצה כותנה להספיג ג'לי הרדמה מקומי, 2% Xylocaine, על Naris להיות occluded.
3. לאפשר את הגור לנוח בצלחת ל~ 3 דקות.
4. החזק את הגור בעדינות אך באופן מאובטח ביד הלא הדומיננטית.
5. השימוש ביד הדומיננטית, להרים תקע האף ולהספיג אותו ג'לי ההרדמה המקומי סביב הקצה שממנו החוט לא בולט. זה יפעל כשתי הרדמה לכל כאבי קטין הקשורים להכנסת תקע ויפעל כחומר סיכה בתוך Naris. הערה: ההשפעה של Xylocaine מתחילה בתוך כמה דקות ונמשכת 20-30 דקות. גורים בסובלנות טובה מופע הכללי להכנסת תקע לאחר יישום ג'לי xylocaine (מ 'inimum נאבק וניקוד).
6. הכנס בעדינות את תקע האף על ידי תוקף מחזיק את הגור ומסתובב באיטיות בתקע בדחיפות מאוד עדינות עד שהתקע מוכנס באופן מלא ורק את החוט 2 מ"מ בולט מNaris (ראה איור 1). לא צריך להיות שום דימום משני Naris במהלך תהליך זה. גורים עם דימום במהלך החדרת תקע האף אינם נכללים וחזרו לסכרים
7. לאפשר לבעל החיים לנוח במנה זו למשך 5 דקות על מנת להרגיל לתקע.
8. הסר את הגור מצלחת ההתרגלות ולהתחיל את הפרדיגמה אוויר ^24.

איור 1 בנייה של התוספת האף. ) שרטוטים המציגים את השלבים של מה שהופך את תקע האף. חוט נמשך דרך צינורות פוליאתילן; קשר הוא עשה וpulהוביל לאמצע הצינור כדי לחסום אותו; שני קצוות נחתכים עם שאריות 2 מ"מ בקצה אחד מצינורות. B) שפתוחה ותצוגה לרוחב של עכברוש עם תקע האף בNaris אחד.

.3 ריחני מצעים הכנה

1. לבישת כפפות חדשות ובמנדף על מנת למנוע זיהום ריח, למקם 500 מ"ל של מצעי שבבי עץ לתוך שקית ניילון.
2. השתמש במזרק להכין 0.3 מ"ל תמצית מנטה, ולרסס את זה על המצעים בשקית הניילון.
3. לקשור את השקית הסגורה, לנער את השקית במרץ, ולאפשר לכלי המיטה לנוח בשקית למשך 5 דקות.
4. מניחים את המצעים הריחניים בקופסא ברורה, רדודה, אקריליק אימון (20 x 20 x 5 סנטימטר ^3, איור 2 א) שנחשפה במנדף ל5 דקות לפני השימוש. ברגע שהמצעים מוכנים, להשליך כפפות אלה, ואינם מאפשר לכפפות אלה כדי לבוא במגע עם בעלי החיים.
5. מניחים את המצעים ללא בישום בתיבת פלסטיק שקופה זהה, וחדרבטוח שזה לא בא במגע עם המצעים הריחניים או כפפות בשימוש.

.4 ריח אוויר פרדיגמה (ראה תמונה באיור 2 א)

גורים עוברים גם מפגש אוויר אחד, על PD 6, או פגישות מרובות משפט (אימון אחד ביום, פ"ד 3-6).

1. הנח את הגור המורגל במצעים ריחניים. לריח שליטה בלבד (O / S ^-) גורים, להשאיר גורים אלה על המצעים עבור 10 דקות, לאחר מכן דילגתי לשלב 4.5. לשבץ + ריח ניסיוני גורים (O / S ^+), ממשיכים את השלבים הבאים בסעיף זה.
2. שבץ הגור ל30 שניות באמצעות מכחול קטן. השתמש בתנועות מעגליות מהירות בעיקר סביב האזור האחורי של הגור.
3. לאפשר את הגור לנוח 30 שניות.
4. חזור על שלבים 4.2 & 4.3 עבור הסכום כולל של 10 דקות (כלומר 10 זיווגים של ליטוף + ריח).
5. הסר גור מתיבת האוויר, להסיר את תקע האף ולהחזיר את הגור לסכר.

5. העדפות ריח Lateralized בדיקה (ראה תמונה באיור 2)

בדיקה מתרחשת בנקודות זמן שונות (לדוגמא, שעה 24 או 48) הבאות האימון האחרון. הבדיקה מתבצעת בתא חלד בדיקות פלדה (30 x 20 x 18 סנטימטר ^3), אשר ממוקם בחלק העליון של שתי תיבות אימונים (תיבת הכשרה מתוארת ב3.4), מופרדות על ידי אזור ניטראלי 2 סנטימטר. תיבת הכשרה אחת מכילה מצעים בניחוח מנטה ואילו התיבה אחרת מכילה מצעים נקיים, ללא בישום. הרצפה של חדר הבדיקות היא רשת מתכת, אשר לאחר מכן מכוסה בסדין להסרה של רשת פלסטיק (איור 2).

1. הכן מנטה אחד ומצעים ללא בישום אחד כאמור בסעיף 3, ולמקם כל תיבה שמתחת לשני צדי מתרס של חדר הבדיקות, מלבד 2 סנטימטר. הנח את רשת הפלסטיק על רצפת מתכת הרשת של חדר הבדיקות.
2. הסר את הגור מהסכר והנח טיפת משרד של גריז סיליקון חסר ריח על Narisשהאפיל במהלך אימון. Re-להחיל את הגריז לאורך כל הליך הבדיקה הראשון בהתאם לצורך. הערה: חסימת Naris אקראית במהלך אימון ובדיקה עשויה להיחשב כדי למנוע הטיה.
3. הנח גור באזור הניטרלי של חדר הבדיקות.
4. לאפשר את הגור לחקור את התא 1 דקות, הקלטה כמה זמן את הגור בילה יותר משני הצדדים של החדר (כלומר מעל מנטה או מצעים ניטרליים בניחוח).
5. לאפשר את הגור לנוח דקות 1 בתא החזקת פלסטיק מכוסה.
6. חזור על שלבים 5.2 & 5.3 עבור הסכום כולל של 10 דקות (כלומר 5 ניסויי מבחן מופרדים על ידי 5 ניסויי שאר) מיתוג הנטייה הראשונית של הגור בתא על מנת לשלוט על העדפות כיוון.
7. מייד לאחר בדיקה, לנגב את השומן מNaris.
8. הכנס noseplug פוליאתילן לNaris ההפך כאמור בסעיף 2 ולאפשר לבעל החיים לנוח במשך 10 דקות.
9. בחן את הגור שוב כמו ב 5.3 -5.6, להסיר את התקע, ולהחזיר את הגור לסכר. להסיר ולנקות את רשת הפלסטיק של חדר בדיקות עם 95% אתנול ויאפשר לנוזל מתאדה. הנח את הרשת בחזרה לפני בדיקת הגור הבא.
   הערה: יישום גריז סיליקון בחסימת Naris הראשונה במהלך הבדיקה מונעת את הסיכוי לדימום ולחץ הקשור בהחדרת תקע האף.

הכשרת איור 2 ריח מוקדם העדפה ובדיקות. ) אימון ריח מוקדם העדפת שימוש בריח + מלטף את הפרדיגמה. B) בדיקת העדפת ריח שתי בחירה עם מצעי מנטה בצד אחד, לשלוט במצעים ללא בישום בצד השני. אזור ניטראלי 2 סנטימטר ממוקם באמצע.

.6 בדיקה אפקטיביות של יחיד Naris ספיגה

nt "> ניסוי זה מתבצע על מנת לקבוע אם חסימת Naris אחת מובילה להפעלת lateralized של מערכת חוש הריח.

1. לבצע חסימות Naris חד צדדיות על PD 6 או 7 גורים כפי שתואר בסעיף 2.
2. אחרי ~ 5 דקות התרגלות, למקם את הגור במכל פלסטיק מכוסה וחושף אותה ל30 μl שמן מנטה טהור ספוגים בפיסת הרקמה עבור 10 דקות.
3. מייד לאחר חשיפת ריח המנטה, להזריק את הגור intraperitoneally (IP) עם כלורל (400 מ"ג / קילוגרם) כהרדמה כללית, או pentobarbitol, (150 מ"ג / קילוגרם).
4. ברגע שהרדמה מלאה (לא מראה תגובה לזנב או קמצוץ רגל), transcardially ינקב את הגור עם פתרונות קרים כקרח של תמיסת מלח (0.9%) ל~ 1 דקות, ואחריו paraformaldehyde (4%, מומס בפתרון חיץ 0.1 M פוספט, PBS ).
5. לאחר 10 דקות של זלוף paraformaldehyde, לאסוף את המוח ולמקם אותו בparaformaldehyde לילה ב 4 ° C, אז טרנסFER המוח לתמיסת סוכרוז (20% PBS) ל24 שעות נוספות.
6. לחתוך פרוסות מוח העטרה ב30 עובי מיקרומטר עם cryostat. לאסוף פרוסות OB ומחשב ולעלות על גבי שקופיות ג'לטין מצופה, ואחריו מכתים אימונוהיסטוכימיה סטנדרטי לנוגדן pCREB ^21,25,30.

.7 בדיקת ההפיכות של יחיד Naris ספיגה

בדיקות ניסוי זה אם השפעת החסימה היא הפיכה ב24 שעות לאחר הסרת תקע האף.

1. לבצע חסימות Naris חד צדדיות על PD 6 או 7 גורים כפי שתואר בסעיף 2.
2. לאחר 15 דקות (שווה ערך ל משך הזמן של חסימת Naris במהלך אימון - 5 התרגלות + הכשרת דקות דקות 10), להסיר את תקע האף, ולהחזיר את הגור לסכר.
3. 24 שעות מאוחר יותר, לחשוף את הגור לריח המנטה במכל פלסטיק מכוסה עבור 10 דקות כפי שתואר ב6.2.
4. בצע אותם שלבים בכתיוני 6.3-6.6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כאן אנו סוקרים כמה מהתוצאות שהוקמו בעבר ²⁴ כדי להדגים את היעילות של חסימת Naris בבידוד קלט ריח ולמידה לחצי כדור אחד, וההפיכות של שיטה זו.

חסימת Naris אחת במהלך אימון העדפת ריח מוקדם מובילה לזיכרון ריח lateralized ^24. הזיכרון מוגבל ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מודל למידת ריח וזיכרון lateralized בגורי חולדה בתוך חלון זמן קריטי הוקם לראשונה על ידי הול ועמיתים. בסדרה של מחקרים ^33,34,36, הם הראו כי זיכרון העדפת ריח יכול להיות lateralized על ידי זוגות ריח + חלב לNaris אחד בPD 6 בגורי חולדה. זיכרון העדפה היה חזק כאשר אותו Naris היה פתוח במהלך אימו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polythylene 20 tubing	Intramedic	427406	Non-radiopaque, Non-toxic
3-0 Silk suture thread	Syneture	Sofsilk	Non-absorbent
Silicone grease	Warner Instrument	64-0378	Odorless
2% Xylocaine gel	AstraZeneca	Prod. No 061	Lidocaine hydrochloride jelly, purchased at local pharmacy
Paint brush	Dynasty	206R	Similar size/other brands work too
Peppermint extract	Sigma-Aldrich	W284807	Other brands should be okay too
Training box	Custom-made	N/A	Acrylic box (20 x 20 x 5 cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors
Testing chamber	Custom-made	N/A	Stainless steel (30 x 20 x 18 cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used
pCREB antibody	Cell Signaling	9198	Ser 133 (87G3) Rabbit mAb
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	C8383	N/A
Paraformaldehype	Sigma-Aldrich	P6148	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378	N/A