Латерализованные Запах модель обучения у новорожденных крыс для Пройдя Формирование нервной схемы Основополагающее памяти

Резюме

This protocol introduces lateralized early odor preference learning in rats using acute single naris occlusion. Lateralized learning permits the examination of behavioral outcomes and underpinning biological mechanisms within the same animals, reducing variance induced by between-animal designs. This protocol can be used to investigate molecular mechanisms underpinning early odor learning.

Аннотация

Rat pups during a critical postnatal period (≤ 10 days) readily form a preference for an odor that is associated with stimuli mimicking maternal care. Such a preference memory can last from hours, to days, even life-long, depending on training parameters. Early odor preference learning provides us with a model in which the critical changes for a natural form of learning occur in the olfactory circuitry. An additional feature that makes it a powerful tool for the analysis of memory processes is that early odor preference learning can be lateralized via single naris occlusion within the critical period. This is due to the lack of mature anterior commissural connections of the olfactory hemispheres at this early age. This work outlines behavioral protocols for lateralized odor learning using nose plugs. Acute, reversible naris occlusion minimizes tissue and neuronal damages associated with long-term occlusion and more aggressive methods such as cauterization. The lateralized odor learning model permits within-animal comparison, therefore greatly reducing variance compared to between-animal designs. This method has been used successfully to probe the circuit changes in the olfactory system produced by training. Future directions include exploring molecular underpinnings of odor memory using this lateralized learning model; and correlating physiological change with memory strength and durations.

Введение

Обоняние является основным сенсорной модальности у грызунов, без которых они не смогли бы успешно ориентироваться или выжить в их среде. Это особенно важно для новорожденных щенков, которые не могут ни видеть, ни слышать во время первого послеродовой недели, чтобы использовать обоняние для того, чтобы найти свою мать, чтобы прокормить ^1. В результате, неонатальные крысят может быть обусловлено, предпочитают запахи с простых экспериментальных манипуляций. Разнообразие стимулов были использованы в качестве безусловного раздражителя (UCS), чтобы вызвать условные ответов на новых запахов (условный раздражитель, CS) в новорожденных, в том числе гнездования среды ^2,3, молока сосания ^4-6 поглаживая или тактильной стимуляции ^{7- 12,} хвост щепотку ^13, материнской слюны ^13, мягкий нога шок ^14-18, и внутричерепное стимуляция мозга ^19. Настоящее исследование использует устоявшуюся рано запах предпочтений парадигму, где запах, в этом случае мяты, яы в сочетании с тактильной стимуляции для получения предпочтение перечной 24 часа спустя ^10,11,20. Эти запахи воспоминания зависят от неповрежденной обонятельной схемы, в первую очередь в том числе обонятельной луковицы (ОВ) ^21-23 и передней грушевидной коры (APC) ^24,25.

Экспериментальные исследования раннего обучения предпочтение запаха углубили и расширили наше понимание молекулярных и физиологических основ памяти млекопитающих. Эта модель млекопитающих имеет ряд преимуществ по изучению механизмов памяти. Во-первых, нейронные источники сигнала UCS были идентифицированы. Различные раздражители, как упомянутые выше стимулировать голубого пятна норэпинефрина релиз ^26, который в свою очередь активирует несколько адренорецепторов в OB и APC, вызывая клеточные и физиологические эффекты, которые поддерживают обучение ^22,27,28. Во-вторых, механизмы памяти, поддерживающих состоится в четко определенных слоистых нейронных структур.простота обонятельной схемы в новорожденных крыс предоставляет исследователям идеального рамках с которой, чтобы раскрыть запутанные процессы, связанные с синаптической пластичности. Обонятельные сенсорные нейроны (OSN) в обонятельной проекта эпителия Онто митрального / тафтинговые клеток в Обской и этих митрального / тафтинговые клетки, в свою очередь проекта ипсилатерально до грушевидной коры (ПК) через боковой обонятельный тракт (LOT), среди других структур ^29. Оба OSN синапсы в OB ^30,31 и LOT синапсы ^24,25 в APC были определены в качестве критической локусов для синаптических изменений, которые поддерживают обучение и память. В-третьих, в раннем возрасте у крыс, обонятельные входы могут быть легко латерализованные. Каждый аРС имеет доступ к двусторонней информации запаха через передней спайки, как только это белое вещество полностью сформированной в послеродовой день 12 (PD12) ^32. Перед PD 12, вход запах может быть выделен в ipisilateral OB и APC через одного NARIS окклюзии ^{24,25,31,33,34 <}/ SUP>. Одноместный Нарис окклюзии позволяет образовывать запах памяти из открытой ноздри, и предотвращает ту же память от закупоренной ноздри предшествующих PD 12 ^33. Запахи памяти изолирован на ипсилатеральном полушарии включая как OB и APC. Таким образом, каждый крысят может быть своим собственным управления для обучения и способствующие физиологию.

В настоящем исследовании, латерализованные протокол предпочтения обучения рано запах вводится. Этот метод служит мощным инструментом для изучения нейронных механизмов, лежащих в основе запаха обучения, обеспечивая контроль внутри животных ^24,25,31, тем самым снижая как количество животных, необходимых и общее изменение. Нарис окклюзии является обратимым в том, что жир или нос пробка может быть применен и удален с минимальным стрессом или повреждения животного. Здесь, прежде всего, подробные процедуры рано запаха привилегированную обучения и тестирования описаны, с акцентом на латерализованные протокола с использованием одного NARIS окклюзии с ГАИэ плагин. Тогда результаты представлены для демонстрации эффективности одной ноздри окклюзии в изоляции вход запаха и производстве латерализованные память запаха. Наконец, обсуждаются потенциалы с помощью этого латерализованные модель обучения для изучения физиологических изменений в обонятельной системе, что и генерировать обучения и поддержки памяти выражение.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Sprague Dawley крыс (Charles River) щенки обоих полов используются. Пометы отсеиваются до 12 на ПК1 (рождение будучи Pd0). Плотины ведутся на 12 ч цикле свет / темнота с свободном доступе к пище и воде. Экспериментальные процедуры были одобрены институционального комитета по уходу за животными Мемориального университета путем.

1 Нос зажигания Строительство

ПРИМЕЧАНИЕ:. Эта процедура была адаптирована и редактировался Каммингс соавт (1997) ^35.

1. Aquire полиэтиленовой трубы-20 и 3-0 шелковой нитью нить.
2. Отрежьте небольшой кусочек полиэтилена-20 трубки примерно 0,8 мм.
3. Резьба шов шелковой нитью через подготовленную трубки таким образом, что имеется резьба по обе стороны от секции трубы.
4. На одном конце нити снаружи вилки, завяжите узел в потоке.
5. Вытяните секцию трубки вниз по узла в потоке. Узел должен подать внутри трубки.
6. Обрежьте оба конца нити такой, что ~ 2 мм нити, выступающий от одного конца трубки (рисунок 1А).

2 Нарис окклюзия перед тренировкой

1. Удалить щенка от плотины и месте в безопасном блюдо покрытой регулярной постельных принадлежностей.
2. Используйте приложение хлопок наконечник, чтобы приложить местной анестезии желе, 2% Xylocaine, на ноздри, подлежащего окклюзии.
3. Разрешить щенок, чтобы отдохнуть в блюдо для ~ 3 мин.
4. Держите щенка мягко, но надежно в не доминантной рукой.
5. Использование доминирующую руку, поднять нос вилку и промокните же местный анестетик желе вокруг кончика, из которого поток не выступающей. Это будет действовать и как обезболивающее средство для любых незначительных болей, связанных с вставкой штекера и будет действовать в качестве смазочного материала внутри ноздри. ПРИМЕЧАНИЕ: Эффект Xylocaine начинается в течение нескольких минут и длится 20-30 мин. Щенки в целом шоу хорошей переносимостью для вставки плагина после ксилокаин желе применения (мinimum борется и вокализации).
6. Аккуратно вставьте нос вилку, крепко держа щенка и медленно вращая вилку с очень нежными толчками, пока вилка не полностью вставлена ​​и только 2 мм нить, выступающая из ноздри (рисунок 1В). Там не должно быть кровотечение из обеих ноздрей в течение этого процесса. Исключены Щенки с кровотечением во время вставки нос вилка и вернулся в плотин
7. Разрешить животное, чтобы отдохнуть в этом блюде в течение 5 мин для того, чтобы приучить к вилке.
8. Снимите щенка от привыкания блюдо и начать кондиционирования парадигму ^24.

Рис.1 Строительство носа пробки. А) Схемы, иллюстрирующая этапы изготовления нос вилку. Нить вытягивается через полиэтиленовые трубы; узел выполнен и имппривело в середине трубки, чтобы блокировать его; два конца срезают 2 мм остатка в одном конце из трубки. B) спереди и вид сбоку крысы с носа вилкой в одной ноздри.

3 Ароматические Постельные принадлежности Подготовка

1. Ношение новые перчатки и в вытяжной шкаф для предотвращения загрязнения запах, место 500 мл древесностружечных постельные принадлежности в пластиковый пакет.
2. Используйте шприц, чтобы составить 0,3 мл мяты экстракт, и брызги это по постельные принадлежности в пластиковый пакет.
3. Свяжите сумку на замке, потрясти мешок энергично, и позволяют постельные принадлежности, чтобы отдохнуть в сумке в течение 5 мин.
4. Поместите душистый кроватях в ясной, мелкой, акриловой коробке обучения (20 х 20 х 5 см ^3, рис 2А), выявленные в вытяжной шкаф в течение 5 мин перед использованием. После того, как постельные принадлежности готовится, выбросить эти перчатки, и не допустить, чтобы эти перчатки войти в контакт с животными.
5. Поместите недушистый кроватях в идентичном прозрачной пластиковой коробке, и ануверен, что это не входит в контакт с ароматом постельных принадлежностей или используемых перчаток.

4 Запах Кондиционер Paradigm (See Picture в рисунке 2А)

Щенки пройти либо один сеанс кондиционирования, на PD 6 или нескольких судебных заседаний (одна сессия в день, PD 3-6).

1. Поместите привыкли щенка на душистой постельных принадлежностей. Для управления запахом только (O / S ^-) щенков, оставить эти детенышей на постельных принадлежностях в течение 10 мин, затем перейдите к шагу 4.5. Для экспериментальной запах + инсульта (O / S ⁺⁾ щенки, переходите к следующим шагам в этом разделе.
2. Ход щенок в течение 30 сек с помощью небольшой кисти. Используйте быстрые круговые движения, прежде всего, вокруг задней области щенком.
3. Разрешить щенок, чтобы отдохнуть в течение 30 сек.
4. Повторите шаги 4.2 и 4.3 в общей сложности 10 мин (т.е. 10 спаривания поглаживания + запаха).
5. Удалить щенка из коробки кондиционирования, снимите нос вилку и вернуть щенка к плотине.

<р = класса "jove_title"> 5. Латерализованные Запах Предпочтение тестирование (See Picture в рисунке 2B)

Тестирование происходит в различные моменты времени (например, 24 или 48 ч) после окончательного тренировки. Тестирование проводится в нержавеющей стали испытательной камере (30 х 20 х 18 см ^3), который расположен на вершине двух учебных коробки (обучение коробка описана в 3,4), разделенных 2 см нейтральной зоне. Один обучение коробка содержит мяты запахом кроватях, а другой коробке чистый, без запаха кроватях. Пол в испытательной камере металлическая сетка, которая затем покрыта съемной листа пластмассовой сетки (фиг.2В).

1. Подготовьте мяты и один без запаха кроватях в соответствии с разделом 3, и поместите каждую коробку под противоположных сторонах испытательной камере, 2 см друг от друга. Поместите пластиковую сетку на металл-решетчатый пол испытательной камере.
2. Снимите щенка от плотины и поместить твердую каплю запаха силиконовой смазки на ноздричто поглощается в процессе обучения. Re-слой смазки на протяжении первой процедуры тестирования по мере необходимости. ПРИМЕЧАНИЕ: Случайные Нарис окклюзии во время обучения и тестирования можно считать, чтобы избежать предвзятости.
3. Поместите щенка в нейтральной зоне испытательной камеры.
4. Разрешить щенок исследовать камеру в течение 1 мин, записи, как долго щенок провел более двух сторон камеры (то есть более мяты или нейтрально-душистый постельных принадлежностей).
5. Разрешить щенок, чтобы отдохнуть в течение 1 мин в закрытой пластиковой удерживающей камере.
6. Повторите шаги 5,2 & 5,3 в общей сложности 10 мин (т.е. 5 испытаний, разделенных на 5 испытаний отдыха) переключения начальную ориентацию щенка в камере с целью контроля за предпочтениями направлении.
7. Сразу же после тестирования, вытереть смазку с переднего края ноздри.
8. Вставьте полиэтиленовую noseplug в противоположном ноздри как указано в разделе 2 и позволяют животному отдохнуть в течение 10 мин.
9. Проверьте щенка вновь, как и в 5.3 -5.6, выньте вилку, и вернуть щенка к плотине. Снимите и очистите пластиковую сетку в испытательной камере с 95% этанола и позволяет жидкости испаряться. Поместите сетку обратно перед тестированием следующий щенка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Применение силиконовой смазки на первом NARIS окклюзии во время тестирования предотвращает вероятность кровотечения и стресса, связанного с введением нос плагина.

Рисунок 2 Раннее запах предпочтение обучение и тестирование. А) В начале запах предпочтение обучение с использованием запах + поглаживая парадигму. B) Два выбор запаха предпочтение тестирование с мяты постельные принадлежности, с одной стороны, контролировать недушистый кроватях на противоположной стороне. 2 см нейтральная зона находится между.

6 Тестирование эффективности Единого Naris окклюзии

нт "> Этот эксперимент проводится для определения приводит один Нарис окклюзия в латерализованные активации обонятельной системы.

1. Выполните односторонние NARIS окклюзии на PD 6 или 7 щенков, как описано в разделе 2.
2. После ~ 5 мин привыкания, поместите щенка в закрытом пластиковом контейнере и подвергать его 30 мкл чистой масло мяты перечной, пропитанных кусок ткани в течение 10 мин.
3. Сразу после воздействия запаха мяты, вводят щенка внутрибрюшинно (IP) с хлоралгидрата (400 мг / кг) в качестве общего анестезирующего средства, или pentobarbitol, (150 мг / кг).
4. После того, как полностью под наркозом (не показывает никакого ответа на хвост или ноги крайнем случае), транскардиальную заливать щенка охлажденным льдом растворов солевого раствора (0,9%) в течение ~ 1 мин с последующим параформальдегида (4%, растворенный в буферном растворе 0,1 М фосфатного, PBS ).
5. Через 10 мин параформальдегида перфузии, собирать мозг и поместить его в параформальдегидом в течение ночи при 4 ° С, а затем трансфер мозг растворе сахарозы (20% в PBS) в течение дополнительных 24 часов.
6. Вырезать корональные срезы мозга при толщине 30 мкм с криостат. Соберите OB и ПК ломтики и смонтировать на покрытые желатином слайды, а затем с помощью стандартного иммуногистохимического окрашивания для pCREB антитела ^21,25,30.

7 Тестирование обратимости Единого Naris окклюзии

Этот эксперимент проверяет, является ли блокирующий эффект является обратимым через 24 часа после удаления пробки носа.

1. Выполните односторонние NARIS окклюзии на PD 6 или 7 щенков, как описано в разделе 2.
2. Через 15 мин (эквивалентно длительности NARIS окклюзии во время тренировки - 5 мин привыкание + 10 мин обучение), снимите нос вилку, и вернуть щенка к плотине.
3. 24 час спустя, подвергать щенка к мяты запахом в закрытом пластиковом контейнере в течение 10 мин, как описано в 6.2.
4. Следуйте же шаги в сектыионов 6.3-6.6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Здесь мы рассмотрим некоторые из ранее установленных результатов ^24, чтобы продемонстрировать эффективность NARIS окклюзии в изоляции вход запаха и обучение одного полушария, и обратимость этого метода.

Одноместный Нарис окклюзия в начале обучения предпочтение зап...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Латерализованные запах обучения и памяти модель в крысят в критическом временного окна была впервые установлена ​​зале и коллег. В серии исследований ^33,34,36, они показали, что предпочтения памяти запах может быть латерализованные по запаху + молока пар в одной ноздри в PD 6 в крысят...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polythylene 20 tubing	Intramedic	427406	Non-radiopaque, Non-toxic
3-0 Silk suture thread	Syneture	Sofsilk	Non-absorbent
Silicone grease	Warner Instrument	64-0378	Odorless
2% Xylocaine gel	AstraZeneca	Prod. No 061	Lidocaine hydrochloride jelly, purchased at local pharmacy
Paint brush	Dynasty	206R	Similar size/other brands work too
Peppermint extract	Sigma-Aldrich	W284807	Other brands should be okay too
Training box	Custom-made	N/A	Acrylic box (20 x 20 x 5 cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors
Testing chamber	Custom-made	N/A	Stainless steel (30 x 20 x 18 cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used
pCREB antibody	Cell Signaling	9198	Ser 133 (87G3) Rabbit mAb
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	C8383	N/A
Paraformaldehype	Sigma-Aldrich	P6148	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378	N/A