Un Modelo de Aprendizaje lateralizado de Olor en ratas recién nacidas para disecar Formación Neural Circuito Recalces Memoria

Resumen

This protocol introduces lateralized early odor preference learning in rats using acute single naris occlusion. Lateralized learning permits the examination of behavioral outcomes and underpinning biological mechanisms within the same animals, reducing variance induced by between-animal designs. This protocol can be used to investigate molecular mechanisms underpinning early odor learning.

Resumen

Rat pups during a critical postnatal period (≤ 10 days) readily form a preference for an odor that is associated with stimuli mimicking maternal care. Such a preference memory can last from hours, to days, even life-long, depending on training parameters. Early odor preference learning provides us with a model in which the critical changes for a natural form of learning occur in the olfactory circuitry. An additional feature that makes it a powerful tool for the analysis of memory processes is that early odor preference learning can be lateralized via single naris occlusion within the critical period. This is due to the lack of mature anterior commissural connections of the olfactory hemispheres at this early age. This work outlines behavioral protocols for lateralized odor learning using nose plugs. Acute, reversible naris occlusion minimizes tissue and neuronal damages associated with long-term occlusion and more aggressive methods such as cauterization. The lateralized odor learning model permits within-animal comparison, therefore greatly reducing variance compared to between-animal designs. This method has been used successfully to probe the circuit changes in the olfactory system produced by training. Future directions include exploring molecular underpinnings of odor memory using this lateralized learning model; and correlating physiological change with memory strength and durations.

Introducción

El olfato es la modalidad sensorial primaria en los roedores, sin la cual no sería capaz de navegar con éxito o sobrevivir en su medio ambiente. Es especialmente importante para los cachorros recién nacidos, los cuales no pueden ver, ni oír, durante la primera semana posterior al parto, para usar el olfato para localizar a su madre para alimentar a ^1. Como resultado, las crías de ratas neonatales pueden estar condicionados a preferir los olores con manipulaciones experimentales sencillos. Una variedad de estímulos se han utilizado como estímulo incondicionado (UCS) para inducir respuestas condicionadas a nuevos olores (estímulo condicionado, CS) en los recién nacidos, incluyendo el medio ambiente de anidación ^2,3, la succión de la leche ^4-6, acariciando o estimulación táctil ^{de 7 12,} pellizcar la cola ^13, saliva materna ^13, pie de choque leve ^14-18, y la estimulación cerebral intracraneal ^19. El presente estudio emplea un paradigma de preferencia olor principios bien establecido en el que un olor, en este caso, menta, is combinado con estimulación táctil con el fin de producir una preferencia por de menta 24 horas más tarde ^10,11,20. Estos recuerdos olores dependen de circuitos olfativa intacta, incluyendo principalmente los bulbos olfatorios (OB) ^21-23 y la corteza piriforme anterior (APC) ^24,25.

Las investigaciones experimentales de principios del aprendizaje olor preferencia han profundizado y ampliado nuestra comprensión de las bases moleculares y fisiológicas de una memoria de los mamíferos. Este modelo de mamífero tiene varias ventajas en el estudio de los mecanismos de la memoria. En primer lugar, se han identificado las fuentes neuronales de la señal de UCS. Diversos estímulos como se mencionó anteriormente estimulan locus coeruleus la liberación de norepinefrina ^26, que a su vez activa múltiples receptores adrenérgicos en el OB y apc, causando efectos celulares y fisiológicos que apoyan el aprendizaje ^22,27,28. En segundo lugar, los mecanismos de memoria de apoyo tienen lugar en las estructuras neurales laminares bien definidos. Elsimplicidad del circuito olfatorio en ratas recién nacidas ofrece a los investigadores un marco ideal con el que descubrir los intrincados procesos relacionados con la plasticidad sináptica. Las neuronas sensoriales olfativas (OSN) en el proyecto epitelio olfativo Onto mitrales / células pelo insertado en el OB y estas células mitrales / pelo insertado en el proyecto a su vez ipsilateralmente a corteza piriforme (PC) a través del tracto olfatorio lateral (LOT), entre otras estructuras ^29. Tanto las sinapsis OSN en el OB ^30,31 y el ^24,25 LOT sinapsis en APC han sido identificados como lugares críticos para cambios sinápticos que apoyan el aprendizaje y la memoria. En tercer lugar, en una edad temprana en ratas, insumos olfativas pueden fácilmente ser lateralizado. Cada PCa tiene acceso a la información bilateral olor a través de la comisura anterior una vez que esta sustancia blanca está completamente formado en postnatal día 12 (PD12) ^32. Antes de la EP 12, entrada de olor puede ser aislado a ipisilateral OB y APC a través de un solo orificio nasal oclusión ^{24,25,31,33,34 <}/ Sup>. Soltero INIA oclusión permite la formación de la memoria el olor de la fosa nasal abierta, y evita que el mismo recuerdo de los INIA ocluidos antes de PD 12 ^33. Memoria Olor está aislado en el hemisferio ipsilateral incluyendo tanto OB y APC. Por lo tanto, cada una cría de rata puede ser su propio control para el aprendizaje y que sustenta la fisiología.

En el presente estudio, se introduce el protocolo de aprendizaje preferencia olor temprana lateralizado. Este método sirve como una poderosa herramienta para el estudio de los mecanismos neuronales que sustentan el aprendizaje de olores, proporcionando un control intra-animales ^24,25,31, lo que reduce tanto el número de animales necesarios y la variación general. Naris oclusión es reversible en que el tapón de grasa o la nariz puede ser aplicado y retirado con un mínimo de estrés o daño al animal. Aquí, en primer lugar, se describen los procedimientos detallados de formación preferencia olor temprana y pruebas, con un enfoque en el protocolo lateralizado usando solo oclusión fosa nasal con un nne enchufe. Entonces resultados se presentan para demostrar la eficacia de la oclusión sola fosa nasal en el aislamiento de entrada de olor y producir olor lateralizado memoria. Por último, se analizan los potenciales de la utilización de este modelo de aprendizaje lateralizado para estudiar los cambios fisiológicos en el sistema olfativo que ambos generan el aprendizaje y la memoria soporte para expresiones.

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Protocolo

Se utilizan ratas Sprague Dawley (Charles River) crías de ambos sexos. Las camadas son sacrificados a 12 en PD1 (siendo nacimiento PD0). Las presas se mantienen en un 12 horas de luz / oscuridad ciclo con acceso ad libitum a alimento y agua. Procedimientos experimentales han sido aprobados por el Comité de Cuidado de Animales Institucional de la Universidad Memorial.

Plug 1. Nariz Construcción

NOTA:. Este procedimiento fue adaptado y modificado a partir de Cummings et al (1997) ^35.

1. Aquire tubo de polietileno-20 y 3-0 hilo de sutura de seda.
2. Corte un pequeño trozo de polietileno de 20 tubos de aproximadamente 0,8 mm.
3. Hilo de sutura de seda a través del tubo dispuesto de tal manera que no hay hilo en cada lado de la sección de tubo.
4. En un extremo de la rosca exterior del tapón, un nudo en el hilo.
5. Tire de la sección del tubo por encima del nudo en el hilo. El nudo debe presentar dentro de la tubería.
6. Recorte ambos extremos de la rosca tal que ~ 2 mm de hilo sobresale de un extremo de la tubería (véase la Figura 1A).

2. Naris Oclusión antes de Capacitación

1. Retire cachorro de presa y colocar en un plato seguro cubierto con ropa de cama regular.
2. Utilice una aplicación de punta de algodón para secarse un gel anestésico local 2% Xylocaine, en los INIA a ser ocluido.
3. Deje que el cachorro para descansar en el plato para ~ 3 min.
4. Mantenga el cachorro con suavidad pero firmemente en la mano no dominante.
5. Con la mano dominante, recoger una nariguera y aplique el mismo gel anestésico local alrededor de la punta de la que el hilo no sobresale. Esto actuar tanto como un anestésico para cualquier dolores menores asociados con la inserción del tapón y actuará como un lubricante dentro de la fosa nasal. NOTA: El efecto de xilocaína comienza en un par de minutos y dura 20-30 min. Los cachorros en general muestran buena tolerancia para la inserción del tapón después de la aplicación de la jalea xilocaína (mÍNIMOS luchando y vocalización).
6. Inserte con cuidado el tapón de la nariz manteniendo al cachorro firmemente y lentamente girar el enchufe con las pulsaciones muy suaves hasta que el enchufe esté bien conectado y sólo el hilo 2 mm sobresale de la fosa nasal (véase la Figura 1B). No debe haber sangrado de cualquiera de fosa nasal durante este proceso. Los cachorros con hemorragia durante la inserción del tapón nariz se excluyen y se devuelven a las represas
7. Permitir que el animal descanse en este plato durante 5 min con el fin de habituar al enchufe.
8. Retire el cachorro del plato habituación y comenzar el paradigma de condicionamiento ^24.

Figura 1. Construcción de un tapón de nariz. A) Esquema que muestra las etapas de hacer un tapón de nariz. Un hilo pasa a través de un tubo de polietileno; se hace un nudo y Pulconducido en el centro de la tubería para bloquearlo; dos extremos se cortan con un residuo de 2 mm en un extremo de la tubería. B) Vista frontal y lateral de una rata con un enchufe de la nariz en una fosa nasal.

3. perfumado Preparación de cama

1. El uso de guantes nuevos y en una campana de extracción para evitar la contaminación de olores, coloque 500 ml de ropa de cama de viruta de madera en una bolsa de plástico.
2. Utilice una jeringa para extraer hasta 0,3 ml de extracto de menta, y rociar este sobre la ropa de cama en la bolsa de plástico.
3. Ate la bolsa para cerrarla, agitar la bolsa con fuerza, y deje que la ropa de cama para descansar en la bolsa durante 5 min.
4. Coloque la ropa de cama perfumada en una caja transparente, poco profunda, acrílico formación (20 x 20 x 5 cm ^3, Figura 2A) descubierto en una campana de extracción durante 5 minutos antes de su uso. Una vez preparada la ropa de cama, deseche estos guantes, y no permita que estos guantes entren en contacto con los animales.
5. Coloque la ropa de cama sin perfume en una caja de plástico transparente idéntica, y enAsegúrese de que no entre en contacto con la ropa de cama perfumada o guantes utilizados.

4. Olor acondicionado Paradigm (ver foto en la Figura 2A)

Los cachorros son sometidos ya sea una sola sesión de condicionamiento, el PD 6, o múltiples sesiones de prueba (una sesión por día, PD 3-6).

1. Coloque el cachorro habituado en cama perfumada. Para el control de olores sólo (O / S ^-) crías, deje estos cachorros en la ropa durante 10 minutos, a continuación, vaya al paso 4.5. Para experimental golpe olor + (O / S ⁺⁾ cachorros, siguen los siguientes pasos de esta sección.
2. Carrera al cachorro durante 30 segundos utilizando un pincel pequeño. Use movimientos circulares rápidos principalmente en torno a la región posterior del cachorro.
3. Deje que el cachorro para descansar durante 30 segundos.
4. Repita los pasos 4.2 y 4.3 para un total de 10 minutos (es decir, 10 parejas de caricias + olor).
5. Retire las crías de la caja acondicionado, quitar el tapón de la nariz y devolver el cachorro a la presa.

5. Lateralizado Olor Preferencia Testing (ver foto en la Figura 2B)

Pruebas se produce en varios puntos de tiempo (por ejemplo, 24 o 48 h) después de la última sesión de entrenamiento. La prueba se llevó a cabo en una cámara de acero inoxidable de prueba (30 x 20 x 18 cm ^3), que se coloca en la parte superior de dos cajas de formación (caja de formación se describe en 3.4), separadas por una zona neutral 2 cm. Una caja de capacitación contiene la ropa de cama con olor a menta, mientras que la otra caja contiene ropa de cama limpia, sin olor. El suelo de la cámara de pruebas es una rejilla de metal, que luego es cubierto por una hoja extraíble de malla de plástico (Figura 2B).

1. Preparar una menta y una cama sin perfume según la Sección 3, y colocar cada caja en lados opuestos de la cámara de pruebas, 2 cm. Coloque la malla de plástico en el suelo metálico de la red de la cámara de prueba.
2. Retire el cachorro de la presa y colocar una gota firma de grasa de silicona inodora en los INIAque se ocluye durante el entrenamiento. Volver a aplicar la grasa durante todo el primer procedimiento de prueba según sea necesario. NOTA: oclusión INIA aleatoria durante el entrenamiento y las pruebas pueden ser consideradas para evitar sesgos.
3. Coloque las crías en la zona neutral de la cámara de prueba.
4. Deje que el cachorro para explorar la cámara durante 1 min, registrando el tiempo que el cachorro pasó más de los dos lados de la cámara (es decir, más de la hierbabuena o ropa de cama neutra perfumada).
5. Deje que el cachorro para descansar durante 1 min en una cámara de retención de plástico cubierto.
6. Repetir los pasos 5.2 y 5.3 para un total de 10 min (es decir, 5 ensayos de prueba separadas por 5 ensayos de descanso) de conmutación de la orientación inicial de la cría en la cámara con el fin de controlar para las preferencias de dirección.
7. Inmediatamente después de la prueba, limpie la grasa de la fosa nasal.
8. Inserte un noseplug polietileno en la fosa nasal opuesta según la sección 2 y que el animal pueda descansar durante 10 minutos.
9. Pruebe el cachorro una vez más como en 5.3 -5.6, quitar el tapón, y regresar al cachorro a la presa. Retire y limpie la malla de plástico de la cámara de pruebas con etanol al 95% y deje que el líquido se evapore. Coloque la malla de vuelta antes de probar la próxima cachorro.
   NOTA: La aplicación de grasa de silicona en la primera oclusión fosa nasal durante la prueba evita el riesgo de sangrado y el estrés asociado con la inserción del tapón nariz.

Figura formación preferencia 2. olor temprana y pruebas. A) la formación de olores Early preferencia usando olor + acariciando paradigma. B) Dos elección olor pruebas de preferencia con ropa de cama de menta en un lado, el control de las camas sin aroma en el lado opuesto. Una zona neutral 2 cm se coloca en el medio.

6. Prueba de la eficacia de los sistemas Naris Oclusión

nt "> Este experimento se realiza para determinar si sola oclusión INIA conduce a la activación lateralizado del sistema olfativo.

1. Realizar oclusiones naris unilaterales en PD 6 o 7 cachorros como se describe en la sección 2.
2. Después de ~ 5 min habituación, coloque el cachorro en un recipiente de plástico cubierto y lo exponga a 30 l de aceite de menta puro empapadas en un pedazo de tejido durante 10 minutos.
3. Inmediatamente después de la exposición de menta olor, el cachorro inyectar por vía intraperitoneal (ip) con hidrato de cloral (400 mg / kg) como anestésico general, o pentobarbital, (150 mg / kg).
4. Una vez anestesiados completamente (que no muestran respuesta a la cola o pellizco pie), transcardially perfundir el cachorro con soluciones frías de solución salina (0,9%) para ~ 1 min, seguido de paraformaldehído (4%, disuelto en solución tampón 0,1 M de fosfato, PBS ).
5. Después de 10 minutos de perfusión de paraformaldehído, recoger el cerebro y lo coloca en paraformaldehído la noche a 4 ° C, y luego transfer el cerebro a una solución de sacarosa (20% en PBS) durante 24 h más.
6. Cortar rodajas de cerebro coronal a 30 micras de espesor con un criostato. Recoger OB y PC rodajas y montar en portaobjetos recubiertos de gelatina, seguido por tinción inmunohistoquímica para el anticuerpo estándar pCREB ^21,25,30.

7. Prueba de la reversibilidad de Soltero Naris Oclusión

Este experimento prueba si el efecto de bloqueo es reversible a las 24 h después de la extracción del tapón de la nariz.

1. Realizar oclusiones naris unilaterales en PD 6 o 7 cachorros como se describe en la sección 2.
2. Después de 15 min (equivalente a la duración de la oclusión fosa nasal durante el entrenamiento - 5 habituación + 10 min de entrenamiento min), retire el tapón de la nariz, y devolver el cachorro a la presa.
3. 24 horas más tarde, exponer al cachorro al olor de menta en un recipiente de plástico cubierto durante 10 minutos como se describe en el apartado 6.2.
4. Siga mismos pasos en sectaiones 6.3 a 6.6.

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Resultados

En este artículo revisamos algunos de los resultados previamente establecidos ²⁴ para demostrar la eficacia de la oclusión INIA en el aislamiento de la entrada de olores y aprender a un hemisferio, y la reversibilidad de este método.

Soltero oclusión fosa nasal durante el entrenamiento olor preferencia temprana conduce a una memoria olfativa lateralizado ^24. La memoria se limita a la fosa nasal para sustitución (Figura 3). Cuando los cachorros son ...

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Discusión

El modelo de aprendizaje del olor y la memoria lateralizado en crías de rata dentro de una ventana de tiempo crítica fue establecida por primera vez por Hall y colegas. En una serie de estudios ^33,34,36, demostraron que una memoria preferencia olor podría ser lateralizado por el olor de la leche + emparejamientos a una fosa nasal en PD 6 en crías de rata. Memoria Preferencia era robusta cuando la misma fosa nasal estaba abierto durante el entrenamiento y las pruebas, pero no se observa cuando la fosa nasa...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polythylene 20 tubing	Intramedic	427406	Non-radiopaque, Non-toxic
3-0 Silk suture thread	Syneture	Sofsilk	Non-absorbent
Silicone grease	Warner Instrument	64-0378	Odorless
2% Xylocaine gel	AstraZeneca	Prod. No 061	Lidocaine hydrochloride jelly, purchased at local pharmacy
Paint brush	Dynasty	206R	Similar size/other brands work too
Peppermint extract	Sigma-Aldrich	W284807	Other brands should be okay too
Training box	Custom-made	N/A	Acrylic box (20 x 20 x 5 cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors
Testing chamber	Custom-made	N/A	Stainless steel (30 x 20 x 18 cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used
pCREB antibody	Cell Signaling	9198	Ser 133 (87G3) Rabbit mAb
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	C8383	N/A
Paraformaldehype	Sigma-Aldrich	P6148	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378	N/A