Sinir Devresi Temelini Bellek Oluşumunda Diseksiyon için Yenidoğan Sıçanlarda bir Lateralize Koku Öğrenme Modeli

Özet

This protocol introduces lateralized early odor preference learning in rats using acute single naris occlusion. Lateralized learning permits the examination of behavioral outcomes and underpinning biological mechanisms within the same animals, reducing variance induced by between-animal designs. This protocol can be used to investigate molecular mechanisms underpinning early odor learning.

Özet

Rat pups during a critical postnatal period (≤ 10 days) readily form a preference for an odor that is associated with stimuli mimicking maternal care. Such a preference memory can last from hours, to days, even life-long, depending on training parameters. Early odor preference learning provides us with a model in which the critical changes for a natural form of learning occur in the olfactory circuitry. An additional feature that makes it a powerful tool for the analysis of memory processes is that early odor preference learning can be lateralized via single naris occlusion within the critical period. This is due to the lack of mature anterior commissural connections of the olfactory hemispheres at this early age. This work outlines behavioral protocols for lateralized odor learning using nose plugs. Acute, reversible naris occlusion minimizes tissue and neuronal damages associated with long-term occlusion and more aggressive methods such as cauterization. The lateralized odor learning model permits within-animal comparison, therefore greatly reducing variance compared to between-animal designs. This method has been used successfully to probe the circuit changes in the olfactory system produced by training. Future directions include exploring molecular underpinnings of odor memory using this lateralized learning model; and correlating physiological change with memory strength and durations.

Giriş

Olfaction başarıyla gezinmek veya kendi ortamında hayatta kalmak için mümkün olmaz onsuz kemirgenlerde primer duyu yöntemidir. Bu ¹ beslemek için annelerini bulmak için koku alma duyusunu kullanmak için, ilk doğum sonrası hafta boyunca görmeniz ne duymak ne yenidoğan yavrular, için özellikle önemlidir. Sonuç olarak, yenidoğan sıçan yavrular basit deneysel manipülasyonlar ile kokuları tercih klimalı edilebilir. Uyaranların çeşitli iç içe geçme çevre ^2,3, süt emzirme ^4-6, okşayarak ve dokunma uyarısına ⁷ de dahil olmak üzere yeni yenidoğanlarda kokulara koşullandırılmış tepkileri (Koşullu uyarı, TH), indükleme koşulsuz uyarıcı (UCS) olarak kullanılmaktadır ^12, kuyruk tutam ^13, anne tükürük ^13, hafif bir ayak şok ^14-18, ve intrakranial beyin stimülasyonu ^19. Bu çalışmada köklü bir erken koku tercihi paradigma istihdam edildiği bu durumda nane bir koku, bennane, 24 saat sonra ^10,11,20 için bir tercih üretilmesi amacıyla dokunma uyarısına birlikte s. Bu kokular hafızası esas olarak koku ampuller (OB) ^21-23 ve ön piriform korteks (APC), ^24,25 de dahil olmak üzere, sağlam koku devresi bağlıdır.

Erken koku tercihi öğrenme Deneysel araştırmalar derinleşti ve bir memeli hafıza moleküler ve fizyolojik temellerinin anlayışımızı genişlettik. Bu memeli model, bellek mekanizmaları okuyan birçok avantajı vardır. İlk olarak, UCS sinyalinin nöral kaynakları tespit edilmiştir. Yukarıda belirtildiği gibi, çeşitli uyarıcılar sırayla ^22,27,28 öğrenmeyi desteklemek hücresel ve fizyolojik etkilere neden OB ve aPC'ye birden adrenoreseptörler aktive odağı coeruleus norepinefrin salınımını ²⁶ uyarırlar. İkincisi, bellek destek mekanizmaları iyi tanımlanmış laminer sinir yapıları yer almaktadır.yenidoğan sıçanlarda koku devrenin basitlik sinaptik plastisite ile ilgili karmaşık süreçleri ortaya çıkarmak için birlikte ideal bir çerçeve ile araştırmacılar sağlar. Diğer yapılar ²⁹ arasında OB ve ipsilateral lateral koku yolu (LOT) ile piriform korteks (PC) dönüş projesi çerçevesinde bu mitral / sorguçlu hücrelerin mitral / tüylü hücreler üzerine koku epiteli projede koku alma duyu nöronları (OSN). OSN OB ^30,31 sinapsların ve LOT aPC'ye içinde ^24,25 sinapsların sinaptik öğrenme destekleyen değişiklikler ve bellek için kritik loci olarak tespit edilmiştir. Üçüncü olarak, sıçanlarda erken yaşta, koku girişler kolayca lateralize edilebilir. Her aPC'ye bu kez beyaz cevher tam post-natal gün 12 (PD12) ^32'de oluşturulan ön komissura'da aracılığıyla ikili koku bilgilere erişimi vardır. PD 12 önce, koku girişli tek tıkanıklığı naris ^{24,25,31,33,34 OB ve aPC'nin ipisilateral izole edilebilir/ Sup>. Tek naris tıkanıklığı açık naris gelen koku hafıza oluşumuna olanak ve 12 33 pd önce tıkalı naris aynı bellek önler. Koku hafızası hem OB ve aPC'ye dahil ipsilateral hemisferde izole edilir. Bu nedenle, her sıçan yavru öğrenme ve fizyolojisini destekleyen için kendi kontrol edilebilir.}

Bu çalışmada, lateralize ilk koku tercih öğrenme protokol verilmektedir. Bu yöntem, böylece gerekli hayvan sayısını ve genel varyasyonu de azaltarak, intra-hayvan kontrolü ^24,25,31 sağlayarak koku öğrenmenin temelini nöral mekanizmaları çalışmak için güçlü bir araç olarak hizmet vermektedir. Tıkanıklığı naris gres ya da burun tıkacın uygulanan ve en az stres veya hayvana zarar çıkarılabilir olması ile tersine çevrilebilir. Burada öncelikle, erken koku tercihi eğitim ve test prosedürleri ayrıntılı bir nos tek naris tıkanıklığı kullanarak lateralizan protokolü odaklanarak, tarif edilmektedire fiş. Sonra sonuçlar koku girişini izole ve lateralizan koku belleği üreten tek tıkanıklığı naris etkinliğini göstermek için sunulmaktadır. Son olarak, hem öğrenim hem de destek bellek ifade oluşturmak koku sistemi fizyolojik değişiklikleri incelemek için bu lateralizan öğrenme modelini kullanarak potansiyelleri tartışılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Her iki cinsiyette Sprague Dawley sıçan (Charles River) yavrular kullanılır. Litters (doğum PD0 olmak) PD1'in 12 on itlaf edilir. Baraj gıda ve suya ad libitum giriş ile, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsünde tutulur. Deneysel prosedürler Memorial Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Burun Tak İnşaatı

NOT:. Bu prosedür adapte Cummings ve ark modifiye edildi (1997) ^35.

1. Kazandırılacak polietilen-20 tüp ve 3-0 ipek sütür konu.
2. Yaklaşık olarak 0.8 mm olan polietilen boru 20 küçük bir parça kesin.
3. Iplik boru bölümünün her iki yanı üzerinde olduğu bir şekilde hazırlanan boru içinden Konu ipek dikiş ipliği.
4. Tıpanın dış ipliğin bir ucunda, ipliğin bir düğüm.
5. Iplik düğüm üzerinde aşağı tüp bölümünü çekin. Düğüm boru içine başvurusunda gerekir.
6. Ipliğin yaklaşık 2 mm hortumunun bir ucundan dışarı çıkıntı yapan şekilde, ipliğin her iki ucuna da trimerler (Şekil 1A bakınız).

Eğitim öncesi 2. Naris Tıkanıklığı

1. Düzenli yatak ile kaplı güvenli bir çanak baraj ve yerden yavru çıkarın.
2. Naris üzerine, lokal anestezik jöle,% 2 lidokain kurulamak için bir pamuk uçlu uygulamayı kullanmak tıkanacak.
3. Yavru ~ 3 dakika boyunca çanak dinlenmeye bırakın.
4. Baskın olmayan elle yavaşça ama güvenli yavru tutun.
5. Dominant eli kullanarak, burun fiş almak ve iplik çıkıntı değil hangi ucu etrafında aynı lokal anestezik jel hafifçe sürün. Bu fiş ekleme ile ilgili herhangi bir minör ağrıları için hem bir anestezik olarak hareket edecek ve naris içinde bir yağlayıcı olarak hareket edecektir. NOT: Xylocaine etkisi birkaç dakika içinde başlar ve 20-30 dakika sürer. Xylocaine jöle uygulamadan sonra fiş yerleştirilmesi için genel göstermek iyi tolerans yavrular (myayilan mücadele ve seslendirme).
6. Yavaşça sıkıca yavru tutan ve Fişin tamamen takıldığını ve sadece 2 mm diş naris çıkıntı kadar yavaş yavaş çok nazik itişlerle fişi çevirerek burun fişini takın (Şekil 1B bakınız). Bu işlem sırasında ya da herhangi bir kanama naris olmalıdır. Burun fiş yerleştirilmesi sırasında kanama ile yavrular hariç ve barajlar iade edilir
7. Hayvan tıpa alıştırmak amacıyla 5 dakika için bu çanak dinlenmeye bırakın.
8. Alışma çanak yavru çıkarın ve klima paradigmayı ²⁴ başlar.

Bir burun fiş Şekil 1. İnşaat. A) Şemalar bir burun fişi yapma aşamalarını gösteren. Bir iş parçacığı polietilen boru ile çekilir; Bir düğüm yapılan ve pul edilirBunu engellemek için, borunun ortasına içine bırakılır; iki ucu) boru. b üzerinden bir ucunda 2 mm'lik bir tortu ile ön ve bir naris bir burun fişi ile bir sıçan lateral bir görünüşünü kesilir.

3. Kokulu Yatak Hazırlama

1. Yeni eldiven giyen ve koku bulaşmayı önlemek bir plastik torba içine woodchip yatak 500 ml yerleştirmek için bir davlumbaz.
2. 0.3 ml nane özü hazırlamak için bir şırınga kullanın ve plastik torba içinde yatak üzerinde bu sprey.
3. , Çanta kapalı kravat şiddetle çanta sallayın ve yatak 5 dakika boyunca torbaya dinlenmeye bırakın.
4. Kullanmadan önce, 5 dakika boyunca bir çeker ocak içinde ortaya çıkarılan bir net, sığ, akrilik eğitim kutusu (20 x 20 x 5 cm ^3, Şekil 2A) olarak kokulu yatak yerleştirin. Yatak hazırlandıktan sonra, bu eldiven atmak ve bu eldivenler hayvanlarla temas etmesine izin vermeyin.
5. Özdeş bir şeffaf plastik kutu içinde kokusuz yatak yerleştirin, ve eno kokulu yatak veya kullanılan eldiven ile temas etmediğinden emin olun.

4. Koku Klima Paradigma (Şekil 2A resmi görmek)

Yavrular PH 6, ya da birden çok deneme seansları (günde bir seans, PD 3-6) üzerinde, ya tek bir klima oturumu tabi.

1. Kokulu yatak üzerinde habitüe yavru yerleştirin. Koku kontrolü sadece (O / S ^-) için yavrular, daha sonra 4,5 adıma atlayın, 10 dakika boyunca yatak üzerinde bu yavrular bırakın. Deneysel koku + inme (O / S ⁺⁾ yavrular, bu bölümde aşağıdaki adımlarla devam ediyor.
2. İnme 30 saniye boyunca yavru küçük bir fırça kullanarak. Öncelikle yavru arka bölgenin çevresinde hızlı dairesel hareketlerle kullanın.
3. Yavru 30 saniye boyunca dinlenmeye bırakın.
4. Tekrar 4.2 ve 10 dakika olmak üzere toplam 4,3 (okşayarak + koku yani 10 eşleşmeleri) adım.
5. , Klima kutusundan yavru çıkarın burun fişini çıkarın ve baraj yavru dönmek.

5. Lateralize Koku Tercih Test (Şekil 2B resmi görmek)

Test, son antrenman sonra çeşitli zaman noktalarında (örneğin, 24 ya da 48 saat) oluşur. Test 2 cm nötr bölge ile ayrılmış iki eğitim kasası (eğitim kutu 3,4 tarif edilmiştir), üst üste yerleştirilir, paslanmaz çelik bir test bölmesinin (30 x 20 x 18 ^cm3) içinde gerçekleştirilir. Diğer kutusu temiz, kokusuz yatak içerir iken bir eğitim kutu nane kokulu yataklar içerir. Test bölmesinin tabanı daha sonra plastik örgü çıkarılabilir bir levha (Şekil 2B) ile kaplanmış olan bir metal ızgara vardır.

1. Bir nane ve Bölüm 3 başına bir kokusuz yatak hazırlayın ve 2 cm aralıklarla test odasının, ters taraflarında altında her bir kutu yerleştirin. Test odasının metal ızgaralı zemin üzerine plastik örgü yerleştirin.
2. Baraj yavru çıkarın ve naris üzerinde kokusuz silikon gres bir firma dab koyunBu eğitim sırasında tıkanmaktadır. Yeniden başvuruda gerektiği gibi ilk test boyunca gres. NOT: eğitim ve test sırasında Rastgele naris tıkanıklığı önyargı önlemek için kabul edilebilir.
3. Test bölmesinin nötr bölgedeki yavru yerleştirin.
4. Yavru odasının iki tarafın üzerinden geçirdim ne kadar süre kayıt, yavru 1 dakika odasını keşfetmek için izin (yani nane veya tarafsız kokulu yatak üzerinde).
5. Yavru bir kapalı plastik tutma odasının 1 dakika dinlenmeye bırakın.
6. Tekrar 10 dakika toplam 5,2 ve 5,3 adım (5 ile kalan denemeleri ile ayrılan 5 testi denemeleri) yönünde tercihlerini kontrol etmek amacıyla oda içindeki yavru bir başlangıç ​​yönlenmesini anahtarlama.
7. Testin hemen ardından, naris gelen yağı silin.
8. Bölüm 2'deki gibi ters naris, bir polietilen noseplug yerleştirin ve hayvan 10 dakika boyunca dinlenmeye bırakın.
9. Olarak bir kez daha test yavru 5.3 -5.6, kapağı çıkarıp, baraja yavru dönmek. Çıkarın ve% 95 etanol ile test odasının plastik örgü temizlemek ve sıvı buharlaşmasına izin verin. Sonraki yavru test etmeden önce geri örgü yerleştirin.
   NOT: test sırasında ilk naris oklüzyon silikon gres uygulanması, kanama ve burun fiş ekleme ile ilişkili stres şansını engeller.

Şekil 2. Erken koku tercihi eğitim ve test. Paradigma okşayarak + koku kullanarak A) Erken koku tercih çalışması. B) bir tarafta nane yatak ile iki seçenek koku tercihini test, karşı tarafta yatak kokusuz kontrol eder. 2 cm nötr bölge arasına yerleştirilir.

6. Tek Naris Oklüzyonu Etkinliğinin Test

nt "> Bu deney, tek naris tıkanma koku alma sisteminin lateralizan aktivasyonuna neden olup olmadığını belirlemek için yapılır.

1. Bölüm 2'de tarif edildiği gibi 6 veya PH 7 yavruların tek taraflı naris oklüzyonlarını gerçekleştirin.
2. ~ 5 dk alışma sonra, bir kapalı plastik kapta yavru koyun ve 10 dakika boyunca doku bir parça batırılmış 30 ul saf nane yağı maruz kalmaktadır.
3. Hemen nane kokusu maruz kaldıktan sonra, periton boşluğu içine (ip) dozunda genel anestezik olarak hidrat (400 mg / kg) ya da pentobarbitolün (150 mg / kg) ile yavru enjekte edilir.
4. Tam (baştan kuyruğa veya ayak tutam yanıt vermedikleri) anestezi sonra, transkardiyal 0.1 M fosfat tampon çözeltisi, PBS içinde çözüldü paraformaldehid (% 4, ardından ~ 1 dakika boyunca tuzlu su (% 0.9) içinde buz soğukluğunda çözümlerle yavru, serpmek ).
5. Daha sonra, trans, paraformaldehid perfüzyon 10 dakika sonra beyin toplamak ve 4 ° C'de bir gece paraformaldehid koyunEk bir 24 saat boyunca, bir sakaroz çözeltisi (PBS içinde% 20) ile beyin fer.
6. Bir kriostat ile 30 mikron kalınlığında koronal beyin dilimleri kesin. OB ve PC dilimleri toplayın ve pCREB antikor ^21,25,30 standart immünhistokimya boyama izledi jelatin kaplı slaytlar, üzerine monte.

7. Tek Naris Oklüzyonu reversibilite testi

Bloke edici etkisi burun tıkacın çıkarılmasının ardından 24 saat sonra geri olup bu deney testleri.

1. Bölüm 2'de tarif edildiği gibi 6 veya PH 7 yavruların tek taraflı naris oklüzyonlarını gerçekleştirin.
2. (Eğitim sırasında tıkanıklığı naris süresine eşdeğer - 5 dk alışma + 10 dk eğitim) 15 dakika sonra, burun kapağı çıkarıp, baraja yavru dönmek.
3. 6.2 de tarif edildiği gibi 24 saat sonra, 10 dakika süre ile kapalı bir plastik kap içine nane kokusuna maruz yavru.
4. Mezhep aynı adımları izleyin6,3-6,6 iyonlar bulunmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Burada koku girişini izole ve bir yarımkürede öğrenme tıkanıklığı naris etkinliğini ve bu yöntemin reverzibilitesini göstermek için daha önce kurulmuş sonuçlarının ²⁴ bazı gözden.

Erken koku tercihi eğitim sırasında tek naris tıkanıklık lateralizan koku hafızasına ²⁴ yol açar. Bellek korunmuş naris (Şekil 3) ile sınırlıdır. Yavrular eğitimi sırasında olduğu gibi tıkanır aynı naris ile koku tercihi için test ed...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Kritik bir zaman penceresi içinde sıçan yavrularında lateralizan koku, öğrenme ve bellek modeli ilk Hall ve arkadaşları tarafından kurulmuştur. Çalışmaların ^33,34,36 bir dizi, onlar bir koku tercih bellek sıçan yavrularının PH 6 az bir naris için koku + süt eşleşmeleri tarafından lateralize olabileceğini gösterdi. Tercih bellek aynı naris eğitim ve test sırasında açık olduğunda sağlam, ancak tıkalı naris bloke edilmemiş ve kontrol edilmiş olduğu zaman gözlemlenmemiştir....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polythylene 20 tubing	Intramedic	427406	Non-radiopaque, Non-toxic
3-0 Silk suture thread	Syneture	Sofsilk	Non-absorbent
Silicone grease	Warner Instrument	64-0378	Odorless
2% Xylocaine gel	AstraZeneca	Prod. No 061	Lidocaine hydrochloride jelly, purchased at local pharmacy
Paint brush	Dynasty	206R	Similar size/other brands work too
Peppermint extract	Sigma-Aldrich	W284807	Other brands should be okay too
Training box	Custom-made	N/A	Acrylic box (20 x 20 x 5 cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors
Testing chamber	Custom-made	N/A	Stainless steel (30 x 20 x 18 cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used
pCREB antibody	Cell Signaling	9198	Ser 133 (87G3) Rabbit mAb
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	C8383	N/A
Paraformaldehype	Sigma-Aldrich	P6148	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378	N/A