A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
الكلوي ونقص الأوكسجين إعادة إشباع الخلايا الإصابات: نموذج الفأر من الإصابات والتجديد
In This Article
Summary
The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.
Abstract
الكلوي إصابة نقص الأوكسجين ضخه (IRI) هو سبب شائع للإصابة الكلى الحاد (آكي) في المرضى وانسداد تدفق الدم الكلوي أمر لا مفر منه خلال زرع الكلى. نماذج تجريبية أن بدقة وبتكاثر ألخص الكلوي IRI تشكل عاملا حاسما في تشريح الفيزيولوجيا المرضية لآكي وتطوير عوامل علاجية جديدة. قدم هنا هو نموذج الفأر من IRI الكلوي الذي يؤدي في استنساخه آكي. ويتحقق ذلك من خلال نهج خط الوسط البطن لعملية جراحية مع شق واحد مما يتيح كل من استئصال الكلية اليمنى والذي يوفر الأنسجة السيطرة ولقط من عنيق الكلوي الأيسر للحث على نقص الأوكسجين من الكلية اليسرى. من خلال رصد دقيق للموقف المشبك ودرجة حرارة الجسم خلال فترة نقص الأوكسجين هذا النموذج يحقق إصابة الوظيفية والهيكلية استنساخه. الفئران ضحى 24 ساعة بعد الجراحة إثبات فقدان وظائف الكلى مع ارتفاع في مستوى الكرياتينين في مصل الدم أو البلازما وكذلك البنىتلف الكلى تورال مع نخر أنبوبي حاد واضح. يحسن وظائف الكلى وإصابات الأنسجة الحادة يحل خلال 7 أيام التالية IRI الكلوي مثل أن هذا النموذج يمكن أن تستخدم لدراسة التجديد الكلى. وقد استخدمت هذا النموذج من IRI الكلوي لدراسة الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية والخلوية من آكي فضلا عن تحليل للتجديد الكلوي اللاحقة.
Introduction
نقص الأوكسجين إصابة ضخه (IRI) هو وضع شيوعا من إصابة لأجهزة متعددة بما في ذلك الكلى والقلب والدماغ. الكلوي IRI قد يؤدي إلى إصابة الكلى الحاد (آكي) في المرضى ولا علاج محدد هو متاح. آكي نتيجة IRI لديه المرضية المعقدة التي تنطوي على كل من الاستجابة المناعية الفطرية والتكيفية 1. نموذج تجريبي من الكلى IRI يوفر القدرة على تشريح الخلايا الرئيسية والوسطاء المتورطين في التسبب في آكي فضلا عن تجديد الكلوي اللاحقة التي تستتبعه خلال الأيام اللاحقة. وعلاوة على ذلك من آثار العوامل العلاجية الرواية على عمليات المرض يمكن تقييمها.
الهدف العام للنموذج التجريبي للالكلوي IRI الموصوفة هنا هو للحث على حد سواء وظيفية وهيكلية إصابة حادة في الكلى. وقد استخدمت بعض المحققين النموذج الذي ينطوي على تحريض IRI الثنائية 2. على الرغم من أن نموذج IRI الكلوي الثنائية الاستخدام، ورن من جانب واحدآل IRI نموذج لديه ميزة لاستئصال الكلية اليمنى التي يجري الاضطلاع بها في وقت الجراحة. يخدم الأنسجة استئصال الكلية اليمنى قيمة عن الأنسجة التحكم في الدراسات التي تنطوي على خطوة المعالجة إما أن الحث أو يقمع التعبير عن الجينات أو البروتينات. على سبيل المثال، وقد استخدمنا هذا النموذج لتقييم آثار شروط مسبقة من الهيم arginate (HA) قبل 24 ساعة من الحقن الكلوي IRI 3. وأكد تحريض الناجح لسيتوبروتيكتيفي انزيم الهيم أوكسيجيناز-1-(HO-1) بواسطة HA قبل المعهد الجمهوري الدولي في حق السيطرة استئصال الكلية الأنسجة 4. انخفاض HA الكلوي في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين IRI في جزء عبر آلية تعتمد HO-1. وبالمثل، وقد استخدمنا هذا النموذج في الدراسات نضوب البلاعم لدراسة دور الضامة في الكلى IRI 5. ويمكن استخدام تحليل المناعى للأنسجة استئصال الكلية اليمنى لتأكيد فعالية منهجية الاجتثاث. وبالتالي، يمكن الأنسجة استئصال الكلية اليمنى استخدامها لكلا تأكيد وتحديد مستوى طnduction أو تثبيط جزيء من الفائدة في كل حيوانات التجارب الفردية. وهذا النموذج تكون ذات فائدة للباحثين الذين يستخدمون المخدرات أو غيرها من المركبات لتعديل التعبير عن الجينات أو البروتينات الخ قبل تحريض الكلوي IRI.
وقد استخدمت دراسات أخرى شقوق الجهة للوصول إلى الكليتين. نموذج الموصوفة هنا يستخدم عملية جراحية في البطن خط الوسط واحد لأداء كل من استئصال الكلية اليمنى وإحداث نقص الأوكسجين ضخه من الكلية اليسرى. ويوفر هذا النهج الجراحية التصور ممتازة من الملعب الجراحية بما في ذلك السويقات الكلوي ويتغير لونها التي تتبع الكلوي عنيق لقط. تجربتنا مع نشر نموذج 4-6 يشير إلى أن الفئران يتعافى سريعا من الجراحة مع قرب معدل البقاء على قيد الحياة بنسبة 100٪.
أخيرا، وتحليل الحركية للنموذج على مدى فترة من 7 أيام إلى أن هذا النموذج يسلك استعادة كل من وظيفة الكلى ووحدة أنبوبي، معانتشار الخلايا أنبوبي كبير.
Protocol
ملاحظة: تم إجراء التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي تفرضها الحيوانات (الإجراءات العلمية) لسنة 1986 وأجريت باستخدام الإجراءات العقيمة (تعقيمها) الأدوات الجراحية والمواد الاستهلاكية. في حين أن نموذج الفئران من الكلى IRI المعروضة هنا كان يؤديها على الذكور عمره 8 أسابيع BALB / ج الماوس فإنه لا يمكن أن يؤديها بتكاثر على مجموعة متنوعة من سلالات الفئران من كلا الجنسين وعادة ما تتراوح أعمارهم بين 7 - 15 أسابيع، مع سن الأمثل الوجود 8 أسابيع. تم الحصول على البيانات الواردة في المقطع نتائج ممثلة من كل من BALB / ج الفئران وFVB. ويستخدم تطبيق المالحة استعد للحفاظ على الأمعاء ومنطقة الجراحية رطبة ولكن يجب أن يتم رصدها بعناية والاحتفاظ بها إلى أدنى حد ممكن مثل التطبيق المفرط للسوائل يمكن أن يؤدي إلى خفض مصطنعة من المصل أو البلازما مستويات الكرياتينين، والذي هو مهم قراءات تجريبية.
1. إعداد الحيوانية وفتح البطن
<رأ>2. قسم الحالب واستئصال الكلية اليمنى
- دفع برفق الأمعاء نحو الجانب الأيسر من تجويف البطن باستخدام قطعة قطن معقمة تعقيمها مبلل بمحلول ملحي لفضح الكلى والحالب الحق. تغطية الأمعاء مع الستائر مبلل لمنع جفاف.
- رفع الحالب الحق مع ملقط الزاوية. Ligate الحالب باستخدام حق مرتين 6/0 سيلخياطة مضفر ك. لإجراء التجارب على المدى الطويل، واستخدام الخيوط الجراحية القابلة للامتصاص لجميع العمليات الجراحية في البطن.
- تقسيم الحالب بين الغرز. بينما تقاطع الحالبي المثاني يجب منع البول من تسرب في الصفاق من المثانة هو ligated الحالب كضمانة ضد أي تسرب بعد العملية خلال تجارب طويلة الأجل.
- للسماح سهولة الوصول عند إجراء استئصال الكلية اليمنى، ودفع برفق حتى الكبد وإلى اليمين باستخدام قطعة من القطن مبللة وعقد في مكان باستخدام شاش مبلل لفضح الشريان الكلوي الأيمن والوريد.
- بصراحة تشريح النسيج الضام والدهون على طول الجانب الإنسي من الكلية اليمنى بقدر الشريان الكلوي الأيمن والوريد.
- إنشاء قناة تحت الشريان والوريد الكلوي عن طريق تحريك بعناية ملقط الزاوية تحت الأوعية الدموية. توجيه ملقط تحت مع النصائح مغلقة وبلطف إزالة مع نصائح مفتوحة من أجل تسهيل تشكيل القناة.
- كرر الخطوة 2.6 حتى نصائح من ملقط تكون مرئية من خلال الأنسجة الضامة فقط فوق الشريان الكلوي والوريد. مرة واحدة واضحة فرك بلطف نصائح من ملقط ضد نصائح من مجموعة أخرى من ملقط الزاوية لكسر بلطف النسيج الضام.
- مع الشريان الكلوي والوريد يمكن الوصول إليها بشكل واضح أنها يمكن الآن المغطي. الشريحة بعناية ملقط الزاوية تحت الشريان الكلوي والوريد مع نصائح مغلقة. مرة واحدة في مكان فتح نصائح من ملقط وتوجيه مقطع قضيب تخثر الدم بين نصائح وبحزم تطبيق مقطع تخثر الدم على الشريان الكلوي والوريد على مقربة من الكلى. بدلا من الشريان والوريد الكلوي يمكن ligated باستخدام 6/0 خياطة الحرير مضفر.
- تقسيم الشريان الكلوي المغطي والوريد على مقربة من الكلى، والتي يمكن أن تحذف الآن مع أي النسيج الضام تمسكا المتبقية.
- إزالة أي الشاش تستخدم لعقد الكبد والأمعاء مع استبدال قطعة قطن.
> 3. نقص الأوكسجين الكلى اليسار وإعادة إشباع الخلايا
- دفع برفق الأمعاء نحو الجانب الأيمن من التجويف البطني مع مسحات القطن لفضح الكلية اليسرى والحالب، وتغطي مع الستائر مبلل. إذا لزم الأمر يمكن نحيد البنكرياس بشاش مبلل للسماح سهولة الوصول.
- استخدام تشريح حادة لكسر بلطف الأنسجة الضامة الأمامية والخلفية إلى الشريان الكلوي الأيسر والوريد، ثم إنشاء قناة تحت السفن بطريقة مماثلة لتلك التي وصفها في شعبة الحالب واستئصال الكلية اليمنى الخطوة 2.4.
- لحث على نقص الأوكسجين من الكلية اليسرى عن طريق تطبيق مقطع serrafine الصغيرة على الشريان الكلوي والوريد. ناجحة نقص الأوكسجين يمكن التأكد بصريا من قبل سواد موحدة التدريجي في الكلى. الأوعية الدموية بالإضافة إلى الشريان الكلوي الأيسر والوريد يمكن أن يقدم أحيانا على الكلى. إذا كان موجودا، وسوف تحتاج أيضا هذه الأوعية الدموية إضافية ليتم المغطي باستخدام مقاطع serrafine الصغيرة من أجل بنجاحلحث على نقص الأوكسجين في الكلى بأكمله.
- استبدال الأمعاء وبعناية ضمان أنه لا توجد التقلبات المفاجئة التي قد تؤدي إلى نتائج المساومة المعوية ونقص الأوكسجين. مؤقتا إغلاق الصفاق مع خياطة واحدة.
- نقص الأوكسجين التالية الحث على الفور وضع الماوس على بطانية homeothermic مع الثرمستور المستقيم تعلق على وحدة التحكم التي من شأنها الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية لمدة المطلوب من نقص الأوكسجين. لتحديد الطول المناسب من نقص الأوكسجين اللازمة للحث على الدرجة المطلوبة من الإصابة الكلوية والفشل الكلوي فمن المستحسن أن يتم تنفيذ المعايرة لكل سلالة والمشغل الجراحية.
- قبل نهاية فترة الدماغية قريبا إعادة فتح الغشاء البريتوني ووضع بعناية الأمعاء للسماح بالوصول إلى المشبك وعرض الكلى. الإدراج من ضام، كما هو موضح في الفيديو، وليس من الضروري وأجريت فقط لأغراض العرض.
- إزالة البنودأمبير بعد فترة من نقص الأوكسجين أبرمت. مباشرة بعد إزالة الكلى سوف تتغير بسرعة اللون من المارون الظلام إلى الوردي الداكن صحية تشير ضخه ناجحة.
- ضمان مرة أخرى أن الأمعاء لا الملتوية قبل إغلاق الصفاق مع غرزة بطانية باستخدام 6/0 مضفر الحرير خياطة. ثم إغلاق الجلد باستخدام مقاطع الجلد المعدني.
- لتقليل خطر العدوى بعد العمليات الجراحية، وتطبيق مطهر مثل محلول اليود / الكحول لمنطقة العمليات الجراحية.
4. الإنعاش والعناية بعد الجراحة
- التخدير عكس جزئيا مع هيدروكلوريد atipamezole (2 ملغ / كلغ) تحت الجلد وإدارة السوائل مع الحقن تحت الجلد من حرارة 1 مل المالحة لمنع الجفاف بعد الجراحة.
- رصد الفئران بعناية حتى أنها قد استعاد وعيه، وتظهر في حالة تأهب قادرون على تصحيح نفسها.
- تسمح أبقى الفئران لاسترداد في مربع ساخنة في 29 درجة مئوية، في الموضعated في بيئة هادئة، لمدة 24 ساعة. سوف الفئران لديها ضعف القدرة على التنظيم الحراري بسبب التخدير، وبالتالي فمن الأهمية بمكان أن يتم إيواؤهم في درجة حرارة مرتفعة لتمكين الانتعاش فعالة. ويمكن أيضا توفير الغذاء مبلل لتشجيع تناول السوائل والتغذية.
- لتوفير تجارب الانتعاش على المدى الطويل المسكنات الجارية وإزالة مقاطع الجلد 7 أيام بعد الجراحة.
5. تقييم الوظيفية والهيكلية إصابة الكلى والتجديد
- ويمكن جمع الدم من الوريد الذيل خلال التجارب أو عن طريق ثقب في القلب في وقت القتل الرحيم في نهاية التجربة. قياس وظيفة الكلى من الكرياتينين في مصل الدم، وذلك باستخدام طريقة كرياتيناز مقرها، واليوريا والنيتروجين في الدم (BUN) على الطرد المركزي محلل البيوكيميائية كما هو موضح سابقا 7. يحتاج وظيفة الكلى من الفئران صحية طبيعية يتم تحديدها قبل تأسيس نموذج للفشل الكلوي وهذا يمكن أن تختلف بشكل ملحوظ dependiنانوغرام على طريقة التحليل المستخدمة مثل رد الفعل جافي وطرق كرياتيناز أساس لقياس الكرياتينين تعطي نتائج مختلفة.
- دراسة هيكل الكلوي عن طريق التشريح المرضي على البارافين جزءا لا يتجزأ من الكلى أقسام الأنسجة ملطخة Haematoxylin ويوزين (H & E) أو حمض شيف الدوري (PAS). الاستيلاء على ما بين 5-10 الصور في التكبير 200X داخل الشريط الخارجي للالنخاع الخارجي (OSOM) لكل الماوس. تقييم مستوى الإصابة في OSOM كما جرح في هذه المنطقة هذا النموذج لأنه عرضة لنقص الأكسجة.
- استخدام أي من أنظمة التهديف اثنين المفصلة أدناه لقياس نخر أنبوبي حاد (ATN) أو التجديد. ويتضح التشكل ممثل التصنيفات المستخدمة في هذه الأنظمة في الشكل 1.
- استخدام نظام ثنائي بسيط ليسجل ATN. على أساس من النزاهة الخلوية وعلامة التشكل والاعتماد الأنابيب إما قابلة للحياة (مورفولوجيا الخلايا سليمة) أو نخرية (الأسواق العالمية ضغطها خلية للخطرgrity، مورفولوجيا الخلايا الشاذة أو فقدان الخلايا).
- التعبير عن عدد من الأنابيب نخرية كنسبة مئوية من إجمالي عدد الأنابيب (نخرية الأنابيب٪).
- تصنيف التجديد باستخدام نظام آخر يعتمد على سلامة الخلية، مورفولوجيا وعدد النوى. علامة والاعتماد الأنابيب كما صحية، نخرية أو جرحوا أو استرداد وفقا للمعايير الواردة في الخطوات التالية.
- كما هو الحال مع نظام التسجيل ATN (المفصل في الخطوة 5.4) الأنابيب علامة مع الخلايا الطبيعية سليمة صحية، في حين الأنابيب التي تبين سلامة الخلايا للخطر، ينبغي أن سجل مورفولوجيا الخلايا الشاذة أو فقدان الخلية العلني كما نخرية.
- تصنيف الأنابيب كما أصيب إذا كان لديهم ضعيفة السيتوبلازم التي تحتوي على عدد قليل من النوى. في المقابل، تعين الأنابيب التي تحتوي على أكثر النوى مع أكثر مورفولوجيا الخلايا العادية كما تتعافى.
- التعبير عن كل تصنيف نبيب كنسبة مئوية من إجمالي عدد نبيب.
النتائج
إصابة أنبوبي والانتعاش يمكن تقييمها بواسطة H & E PAS أو تلطيخ أقسام الأنسجة التالية الكلوي IRI. تصنف الأنابيب التي تقع داخل OSOM كما صحية، والجرحى، نخرية أو استرداد وفقا لمورفولوجيا الخلايا والنزاهة وعدد النوى (الشكل 1). إصابة الوظيفية والهيكلية في هذا النموذج ي?...
Discussion
IRI الكلوي هو أحد أهم أسباب آكي مع عدم وجود علاج محدد المتاحة. وكانت الدراسة التجريبية الكلوي IRI بالمعلومات للغاية مع العمل السابق مما يدل على دور الضامة، والخلايا الجذعية، الخلايا الليمفاوية وخلايا T-التنظيمية وكذلك الخلايا وسطاء في تحريض كل من الإصابة الحادة ومرحلة ...
Disclosures
The authors have no competing or conflicting interests to disclose.
Acknowledgements
The present study was supported by grants from Kidney Research UK (ST4/2011), the Cunningham Trust (CT11/14) and the Mrs EA Hogg's Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14072 - 10 | |
| Micro-Adson forceps (Rat toothed) | Fine Science Tools | 11019 - 12 | |
| S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Colibri retractor | Fine Science Tools | 17000 - 04 | |
| Micro clip applicator | Fine Science Tools | 18057-14 | |
| Micro serrafines | Fine Science Tools | 18055-04 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12002 - 12 | |
| Hemoclip Plus Ligating Clips Small | Weck | 533837 | |
| Autoclip Wound Clip System, 9mm | Harvard Apparatus | PY2 52-3748 | |
| Silk Black Braided Suture, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 723288 | |
| Standard Heat Matt | |||
| Homeothermic Blanket & Control Unit | Harvard Apparatus | ||
| Lacri-Lube | Allergan | ||
| Vetasept Chlorhexidine | AnimalCare | ||
| Vetalar : Ketamine hydrochloride | 100 mg/ml solution | ||
| Domitor : medetomidine hydrochloride | 1 mg/ml | ||
| Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride | 0.3 mg/ml | ||
| Antisedan : Atipamezole hydrochoride | 5 mg/ml |
References
- Kinsey, G. R., Li, L., Okusa, M. D. Inflammation in acute kidney injury. Nephron Exp Nephrol. 109, (2008).
- Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303, (2012).
- Ferenbach, D. A., Kluth, D. C., Hughes, J. Hemeoxygenase-1 and renal ischaemia-reperfusion injury. Nephron Exp Nephrol. 115, (2010).
- Ferenbach, D. A., et al. The induction of macrophage hemeoxygenase-1 is protective during acute kidney injury in aging mice. Kidney Int. 79, 966-976 (2011).
- Ferenbach, D. A., et al. Macrophage/monocyte depletion by clodronate, but not diphtheria toxin, improves renal ischemia/reperfusion injury in mice. Kidney Int. 82, 928-933 (2012).
- Ferenbach, D. A., et al. Macrophages expressing heme oxygenase-1 improve renal function in ischemia/reperfusion injury. Mol Ther. 18, 1706-1713 (2010).
- Keppler, A., et al. Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71, 74-78 (2007).
- Vinuesa, E., et al. Macrophage involvement in the kidney repair phase after ischaemia/reperfusion injury. J Pathol. 214, 104-113 (2008).
- Friedewald, J. J., Rabb, H. Inflammatory cells in ischemic acute renal failure. Kidney Int. 66, 486-491 (2004).
- Gandolfo, M. T., et al. Foxp3+ regulatory T cells participate in repair of ischemic acute kidney injury. Kidney Int. 76, 717-729 (2009).
- Burne, M. J., et al. Identification of the CD4+ T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. , 1283-1290 (2001).
- Burne-Taney, M. J., et al. B cell deficiency confers protection from renal ischemia reperfusion injury. J Immunol. 171, 3210-3215 (2003).
- Kinsey, G. R., et al. Regulatory T cells suppress innate immunity in kidney ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 20, 1744-1753 (2009).
- Li, L., Okusa, M. D. Macrophages, dendritic cells, and kidney ischemia-reperfusion injury. Semin Nephrol. 30, 268-277 (2010).
- Lin, S. L., et al. Macrophage Wnt7b is critical for kidney repair and regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4194-4199 (2010).
- Lee, S., et al. Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair. J Am Soc Nephrol. 22, 317-326 (2011).
- Kumar, S., et al. Dexamethasone ameliorates renal ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 20, 2412-2425 (2009).
- Sharples, E. J., et al. Erythropoietin protects the kidney against the injury and dysfunction caused by ischemia-reperfusion. J Am Soc Nephrol. 15, 2115-2124 (2004).
- Gueler, F., et al. Statins attenuate ischemia-reperfusion injury by inducing heme oxygenase-1 in infiltrating macrophages. Am J Pathol. 170, 1192-1199 (2007).
- Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., ElNahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc. 39, 2983-2985 (2007).
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved