Rénale ischémie reperfusion: un modèle de souris de la blessure et de la régénération

Résumé

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

Résumé

Rénale blessure ischémie reperfusion (IRI) est une cause fréquente d'insuffisance rénale aiguë (IRA) chez les patients et l'occlusion du flux sanguin rénal est inévitable lors de la transplantation rénale. Des modèles expérimentaux qui précise et reproductible récapitulent IRI rénale sont cruciaux dans la pathophysiologie de la dissection AKI et le développement de nouveaux agents thérapeutiques. Présenté ici est un modèle de souris de l'IRI rénale qui entraîne reproductible AKI. Ceci est réalisé par une approche de laparotomie médiane pour la chirurgie avec une incision permettant à la fois une néphrectomie droite qui fournit le tissu de contrôle et de serrage du pédicule rénal gauche pour induire une ischémie du rein gauche. Par une surveillance attentive de la position de serrage et la température du corps au cours de la période d'ischémie ce modèle permet d'obtenir un dommage structural et fonctionnel reproductible. Souris sacrifiées 24 heures après la chirurgie démontrer la perte de la fonction rénale avec élévation du sérum ou le niveau plasmatique de la créatinine ainsi que structuredes dommages aux reins culturel avec nécrose tubulaire aiguë évident. La fonction rénale et améliore la lésion tissulaire aiguë décide au cours de 7 jours après l'IRI rénales telles que ce modèle peut être utilisé pour étudier la régénération rénale. Ce modèle de l'IRI rénale a été utilisée pour étudier la physiopathologie moléculaire et cellulaire de l'insuffisance rénale aiguë ainsi que l'analyse de la régénération rénale ultérieure.

Introduction

Ischémie reperfusion (IRI) est un mode commun de blessure pour plusieurs organes, dont les reins, le coeur et le cerveau. Rénale IRI peut conduire à l'insuffisance rénale aiguë (IRA) chez les patients et aucun traitement spécifique n'est disponible. AKI à la suite de l'IRI a une pathogénie complexe impliquant à la fois la réponse immunitaire innée et adaptative ^1. Un modèle expérimental de IRI rénale offre la possibilité de disséquer les cellules et les médiateurs impliqués dans la pathogenèse de l'insuffisance rénale aiguë, ainsi que la régénération rénale ultérieure qui s'ensuit au cours des jours suivants clés. En outre, les effets de nouveaux agents thérapeutiques sur des processus pathologiques peuvent être évaluées.

L'objectif global du modèle expérimental de l'IRI rénale décrite ici est d'induire à la fois des lésions rénales fonctionnelle et structurelle aiguë. Certains chercheurs ont utilisé un modèle qui implique l'induction d'bilatérale IRI ^2. Bien que le modèle IRI rénale bilatérale est d'usage, le s unilatéralemodèle al IRI a l'avantage d'une néphrectomie droite entrepris au moment de la chirurgie. Le tissu néphrectomie droite sert le tissu de contrôle aussi précieux dans les études impliquant une étape de prétraitement qui soit induit ou supprime l'expression d'un gène ou d'une protéine. Par exemple, nous avons utilisé ce modèle pour évaluer les effets de préconditionnement de l'hème arginate (HA) d'injection 24 heures avant IRI rénale ^3. Le succès de l'induction de l'enzyme cytoprotecteur l'hème-oxygénase-1 (HO-1) par HA avant IRI a été confirmée dans le tissu droit de commande de la néphrectomie ^4. HA réduit IRI rénale chez des souris âgées en partie par un mécanisme HO-1 dépendante. De même, nous avons utilisé le modèle dans les études de déplétion des macrophages à examiner le rôle des macrophages dans IRI rénale ^5. L'analyse immunohistochimique du tissu néphrectomie droite peut être utilisé pour confirmer l'efficacité de la méthode d'ablation. Le tissu de néphrectomie droite peut donc être utilisé à la fois de confirmer et de quantifier le niveau de induction ou l'inhibition de la molécule d'intérêt dans chaque animal d'expérience individuelle. Ce modèle sera d'intérêt pour les chercheurs qui utilisent des drogues ou d'autres composés pour moduler l'expression de gènes ou de protéines etc avant l'induction de l'IRI rénale.

D'autres études ont utilisé des incisions sur les flancs pour accéder aux reins. Le modèle décrit ici utilise une chirurgie de l'abdomen de la ligne médiane unique pour effectuer à la fois la néphrectomie droite et induire une ischémie reperfusion du rein gauche. Cette approche chirurgicale offre une excellente visualisation du champ opératoire, y compris les pédicules rénaux et des changements de couleur qui suivent rénale pédicule serrage. Notre expérience publiée avec le modèle ^4-6 indique que les souris récupérer rapidement de la chirurgie avec un taux de survie de 100% près.

Enfin, l'analyse cinétique du modèle sur une période de 7 jours indique que ce modèle présente à la fois la restauration de la fonction rénale et l'intégrité tubulaire, avecsignificative la prolifération des cellules tubulaires.

Protocole

REMARQUE:. Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements imposés par la loi de 1986 animaux (Scientific Procedures) procédures ont été effectuées en utilisant (autoclave) instruments et consommables chirurgicaux stériles. Alors que le modèle murin de l'IRI rénale présentée ici a été réalisée sur 8 semaines homme âgé de souris Balb / c il peut être effectué de manière reproductible sur une variété de souches murines des deux sexes en général âgés de 7 - 15 semaines, l'âge optimum étant 8 semaines. Les données présentées dans la section des résultats représentatifs ont été obtenus à partir de deux Balb / c et les souris FVB. L'application d'une solution saline chauffée est utilisée pour garder les intestins et de la zone chirurgicale humide, mais il doit être soigneusement contrôlée et maintenue à un minimum que l'application excessive de fluides peut conduire à une artifactual abaissement du taux de créatinine sérique ou de plasma, qui est une importante lecture expérimentale.

1. Préparation des animaux et laparotomie

1. Anesthésier les souris avec du chlorhydrate de kétamine (70 mg / kg) et du chlorhydrate de médétomidine (1 mg / kg) par voie intrapéritonéale et confirmer la profondeur de l'anesthésie par exemple, la perte des réflexes de pincement de l'orteil. La durée de l'anesthésie plan résultant est de 4 heures. Ceci est suffisant pour effectuer la procédure chirurgicale entière et sans anesthésie supplémentaire est nécessaire.
2. Enlever les poils autour de la zone d'incision, s'assurer que la zone est libre de cheveux en vrac, et désinfecter la peau de l'abdomen à l'aide d'une solution diluée de chlorhexidine.
3. Placez la souris sur un bloc chirurgical chauffé dans une position couchée et fixer les membres supérieurs et inférieurs au patin à l'aide de ruban adhésif à faible adhérence. S'assurer que les extrémités supérieures sont maintenues dans une position normale pour empêcher la compression du poumon. Tout au long de la procédure de surveiller la souris pour des brûlures thermiques. Si possible, il est recommandé d'une source de chaleur électrique non utilisée.
4. Administrer le chlorhydrate de buprénorphine analgésique (0,06 mg / kg)sous-cutanée et appliquer du lubrifiant de l'oeil pour les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée. Les analgésiques sont administrés avant l'opération afin d'aider la récupération post-opératoire.
5. Utilisation de tissu séparant ciseaux ou une lame de scalpel faire une incision médiane de la laparotomie et carrément séparer la peau du péritoine. Cela permet à la peau et du péritoine pour être suturés séparément lors de la fermeture de la plaie. Une incision de la linea alba avasculaire est fait de donner accès à la cavité péritonéale.
6. Pour créer une vue claire de la zone chirurgicale insérer un écarteur et drapé de la souris.

2. Division uretère et néphrectomie droite

1. Poussez doucement les intestins vers le côté gauche de la cavité abdominale à l'aide autoclave cotons-tiges stériles humidifiées avec une solution saline pour exposer le rein droit et de l'uretère. Couvrir les intestins avec des rideaux humides pour éviter le dessèchement.
2. Soulevez l'uretère droit avec une pince à angle. Ligaturer l'uretère droit deux fois en utilisant 6/0 silk suture tressé. Pour les expériences à long terme, utiliser sutures absorbables pour toutes les chirurgies abdominales.
3. Diviser l'uretère entre les sutures. Alors que la jonction vésico-urétéral devrait empêcher les fuites d'urine dans le péritoine de la vessie de l'uretère est ligaturé comme une garantie contre toute fuite en post-opératoire lors d'expériences à long terme.
4. Pour faciliter l'accès lors de l'exécution de la néphrectomie droite, poussez doucement le haut du foie et de la droite à l'aide d'un coton-tige imbibé et maintenir en place à l'aide de gaze humide pour exposer l'artère rénale droite et la veine.
5. Carrément disséquer le tissu conjonctif et la graisse le long de la face interne du rein droit dans la mesure où l'artère rénale droite et la veine.
6. Créer un canal au-dessous de l'artère rénale et de la veine par coulissement avec soin les pinces inclinées en dessous des vaisseaux sanguins. Guide de la pince sous les conseils fermés et retirez délicatement les pointes ouvertes afin de faciliter la formation de la chaîne.
7. Répéter l'étape jusqu'à ce que les extrémités 2,6 de la pince sont visibles à travers les tissus conjonctifs juste au-dessus de l'artère rénale et de la veine. Une fois visible frottez doucement le bout de la pince contre les conseils d'un autre ensemble de pinces angulaires de briser délicatement le tissu conjonctif.
8. Avec l'artère et la veine rénales clairement accessible ils peuvent maintenant être obstrués. Faites glisser délicatement la pince angle sous l'artère et la veine rénales avec les conseils fermés. Une fois en place ouvrir les conseils de la pince et de guider le clip applicateur hémostatique entre les conseils et fermement appliquer une pince hémostatique sur l'artère rénale et la veine proche du rein. Sinon l'artère et la veine rénales peuvent être ligaturées en utilisant 6/0 soie tressée suture.
9. Diviser l'artère rénale et la veine occluse près de rein, qui peut maintenant être enlevé avec une tissu conjonctif adhérent restant.
10. Retirez tout gaze utilisée pour maintenir le foie et les intestins remplacer avec des cotons-tiges.

3. Rein gauche ischémie reperfusion et

1. Poussez doucement les intestins vers le côté droit de la cavité abdominale avec des cotons-tiges pour exposer le rein gauche et l'uretère et couvrir avec des rideaux humides. Si nécessaire le pancréas peuvent être déviés avec de la gaze humide pour permettre un accès plus facile.
2. Utilisez dissection de briser doucement les tissus conjonctifs antérieure et postérieure à l'artère rénale gauche et la veine, puis créer un canal sous les navires d'une manière similaire à celle décrite dans la division et l'uretère droit néphrectomie étape 2.4.
3. Induire une ischémie du rein gauche en appliquant une séquence de micro serrafine sur l'artère rénale et de la veine. Ischémie réussie peut être confirmée visuellement par un assombrissement progressif uniforme du rein. Les vaisseaux sanguins, en plus de l'artère rénale gauche et la veine peuvent parfois fournir le rein. Le cas échéant, ces vaisseaux sanguins supplémentaires devront également être occultée par des micro clips serrafine pour réussirinduire une ischémie de l'ensemble du rein.
4. Remplacer les intestins et soigneusement s'assurer qu'il n'y a pas de rebondissements soudains qui peuvent conduire à des résultats compromettantes d'ischémie intestinale. Fermer temporairement le péritoine avec une seule suture.
5. Suite à l'induction de l'ischémie immédiatement placer la souris sur une couverture homéotherme avec une thermistance rectale attaché à une unité de commande permettant de maintenir la température corporelle à 37 ° C pendant la durée nécessaire de l'ischémie. Pour définir la longueur appropriée de l'ischémie nécessaire pour induire le degré de lésion rénale et une insuffisance rénale désiré, il est recommandé qu'un titrage être effectuée pour chaque souche et l'opérateur chirurgical.
6. Peu de temps avant la fin de la période ischémique ré-ouvrir le péritoine et soigneusement positionner les intestins pour permettre l'accès à la pince et voir le rein. Insertion de l'écarteur, comme le montre la vidéo, n'est pas nécessaire et a été effectué uniquement à des fins de présentation.
7. Retirez la clampère après la période d'ischémie est terminée. Immédiatement après avoir retiré le rein va rapidement changer la couleur d'un marron foncé à un rose foncé sain indiquant reperfusion réussie.
8. S'assurer à nouveau que les intestins ne sont pas tordus avant de fermer le péritoine avec un point de feston en utilisant 6/0 suture tressée de soie. Ensuite, fermez la peau en utilisant des clips métalliques de la peau.
9. Pour réduire au minimum le risque d'infection post-opératoire, appliquer un antiseptique tel que la solution d'iode / alcool à la zone chirurgicale.

4. Récupération post-opératoire et des Soins de

1. Anesthésie partiellement inversée avec le chlorhydrate d'atipamézole (2 mg / kg) par voie sous cutanée et administrer des fluides avec une injection sous-cutanée de 1 ml de sérum physiologique chauffé pour éviter la déshydratation après la chirurgie.
2. Surveiller attentivement la souris jusqu'à ce qu'ils aient repris connaissance, apparaît alerte et sont en mesure de se redresser.
3. Permettre souris pour récupérer dans une boîte chauffée maintenue à 29 ° C, locATED dans un environnement calme, à 24 h. Les souris ont une capacité réduite de thermorégulation en raison de l'anesthésie et il est donc essentiel qu'elles sont logés à une température élevée pour permettre la récupération efficace. Nourriture humide peut également être fournie pour encourager fluide et l'apport nutritionnel.
4. Pour les expériences de reconstitution à long terme fournissent des analgésiques en cours et supprimer les clips de la peau 7 jours après la chirurgie.

5. Évaluer Insuffisance rénale fonctionnelle et structurale et régénération

1. Le sang peut être recueilli à partir de la veine de la queue au cours d'expériences ou par ponction cardiaque au moment de l'euthanasie, à la fin de l'expérience. Mesurer la fonction rénale par la créatinine sérique, en utilisant un procédé à base de créatinase, et l'azote uréique du sang (BUN) sur un analyseur centrifuge biochimique ⁷ comme décrit précédemment. La fonction rénale des souris normales et saines doit être déterminé avant d'établir un modèle d'insuffisance rénale, ce qui peut varier sensiblement depending sur la méthode d'analyse utilisée par exemple la réaction Jaffe et créatinase base des méthodes pour mesurer la créatinine donner des résultats différents.
2. Examiner la structure rénale par histopathologie sur coupes de tissus de rein de paraffine colorées à l'hématoxyline et de l'éosine (H & E) ou l'acide périodique Schiff (PAS). Capturez entre 5 - 10 images à 200x dans la bande extérieure de la médullaire externe (OSOM) pour chaque souris. Évaluer le niveau de blessure en OSOM que cette région est blessé dans ce modèle, car il est très vulnérable à l'hypoxie.
3. Utilisez l'une des deux systèmes de notation détaillés ci-dessous pour mesurer la nécrose tubulaire aiguë (ATN) ou la régénération. Morphologie représentant des classifications utilisées dans ces systèmes est illustré à la figure 1.
4. Utiliser un système binaire simple de marquer ATN. Sur la base de l'intégrité cellulaire et morphologie marque et compter tubules que soit viable (la morphologie des cellules intactes) ou nécrotiques (intégration des cellules compromisgrité, la morphologie cellulaire anormale ou perte de cellules).
   1. Exprimer le nombre de tubules nécrotiques en tant que pourcentage du nombre total de tubules (nécrose des tubules de%).
5. Classer régénération utilisant un autre système basé sur l'intégrité des cellules, la morphologie et le nombre de noyaux. Marquer et compter tubules en bonne santé, nécrotique, blessés ou récupérer selon les critères énumérés dans les étapes suivantes.
   1. Comme avec le système de notation ATN (détaillées dans l'étape 5.4) Note de tubules avec les cellules normales saines intactes tandis que les tubules montrant l'intégrité des cellules compromise, une morphologie cellulaire anormale ou d'une perte de cellule ouverte doivent être notées comme nécrotique.
   2. Classer tubules comme lésés s'ils ont un cytoplasme amincie contenant quelques noyaux. En revanche, désigner tubules contenant plusieurs noyaux avec plus morphologie cellulaire normale que la récupération.
   3. Exprimer chaque classification des tubules comme un pourcentage du nombre de tubule totale.

Résultats

Lésion tubulaire et la récupération peuvent être évalués par H & E ou la coloration PAS des coupes de tissus suivants IRI rénale. Tubules situés dans la OSOM sont classés comme étant en bonne santé, blessé, nécrotiques ou la récupération selon la morphologie cellulaire, l'intégrité et le nombre de noyaux (Figure 1). La lésion fonctionnelle et structurelle dans ce modèle dépend de la durée de l'ischémie. Une augmentation progressive de la gravité de l'insuffisance r...

Discussion

Rénale IRI est une cause importante de l'insuffisance rénale aiguë sans traitement spécifique. L'étude expérimentale de l'IRI rénale a été très instructif avec des travaux antérieurs démontrant le rôle des macrophages, cellules dendritiques, les lymphocytes, les cellules T-régulatrices ainsi que d'autres cellules et les médiateurs de l'induction à la fois la lésion aiguë et la phase de guérison ^{5,8 - 16.} En outre, expérimental IRI rénale a été utilisé pour évaluer ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue scissors	Fine Science Tools	14072 - 10
Micro-Adson forceps (Rat toothed)	Fine Science Tools	11019 - 12
S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled	Fine Science Tools	00649-11
Colibri retractor	Fine Science Tools	17000 - 04
Micro clip applicator	Fine Science Tools	18057-14
Micro serrafines	Fine Science Tools	18055-04
Olsen-Hegar needle holder	Fine Science Tools	12002 - 12
Hemoclip Plus Ligating Clips Small	Weck	533837
Autoclip Wound Clip System, 9mm	Harvard Apparatus	PY2 52-3748
Silk Black Braided Suture, Size 6-0	Harvard Apparatus	723288
Standard Heat Matt
Homeothermic Blanket & Control Unit	Harvard Apparatus
Lacri-Lube	Allergan
Vetasept Chlorhexidine	AnimalCare
Vetalar : Ketamine hydrochloride			100 mg/ml solution
Domitor : medetomidine hydrochloride			1 mg/ml
Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride			0.3 mg/ml
Antisedan : Atipamezole hydrochoride			5 mg/ml