כליות איסכמיה reperfusion פגיעה: במודל עכבר של הפגיעה והתחדשות

Summary

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

Abstract

פגיעת reperfusion איסכמיה כליות (IRI) היא סיבה שכיחה של ניזק כלייתי חריף (AKI) בחולים וחסימה של זרימת דם כליות הוא בלתי נמנע במהלך השתלת כליה. מודלים ניסיוניים באופן מדויק וreproducibly לסכם IRI כליות הם קריטיים בלנתח את הפתופיזיולוגיה של AKI והפיתוח של סוכנים טיפוליים חדשניים. מוצג כאן הוא מודל של עכברים של IRI כליות שגורם לאקי לשחזור. זו מושגת על ידי גישת laparotomy קו האמצע לניתוח עם חתך אחד ומאפשר גם כריתת כליה תקין המספקת רקמת שליטה והידוק של גבעול הכליה השמאלי כדי לגרום לאיסכמיה של הכליה השמאלית. על ידי ניטור קפדני של עמדת המהדק ואת טמפרטורת גוף בתקופת איסכמיה מודל זה משיג פגיעה תפקודית ומבנית לשחזור. עכברים הקריבו 24 שעות לאחר ניתוח להפגין אובדן תפקוד כליות עם גובה של הסרום או ברמת קריאטינין בפלזמה, כמו גם strucנזק לכליות טוראל עם נמק צינורי חריף מאליו. משפר את תפקוד כליות והפגיעה ברקמות האקוטית פותרת במהלך 7 ימים הבאים IRI כליות כך שמודל זה יכול לשמש כדי ללמוד התחדשות כליות. מודל זה של IRI הכליות נוצל כדי ללמוד את הפתופיזיולוגיה המולקולרית ותאית של AKI, כמו גם ניתוח של התחדשות הכליה שלאחר מכן.

Introduction

פגיעת reperfusion איסכמיה (IRI) היא מצב שכיח לפציעות לאיברים רבים, כולל כליות, לב והמוח. כליות IRI עלול להוביל לפגיעה בכליות חריפה (AKI) בחולים ואין טיפול ספציפי זמין. יש AKI כתוצאה מIRI פתוגנזה מסובכת מעורבת הן תגובת החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות ^1. מודל ניסיוני של IRI הכליות מציע את הפוטנציאל לנתח את התאים ומתווכים מעורבים בפתוגנזה של AKI כמו גם התחדשות הכליות לאחר שמתפתחת במשך ימים שלאחר מכן מפתח. יתר על כן את ההשפעות של סוכנים טיפוליים חדשניים על תהליכי מחלה ניתן להעריך.

המטרה הכללית של המודל הניסיוני של IRI כליות מתוארת כאן הוא כדי לגרום לפגיעה בכליות גם תפקודית ומבנית חריפה. חוקרים אחדים מנוצלים מודל שכרוך בגיוס של IRI דו צדדי ^2. למרות שמודל IRI כליות דו צדדי הוא שימוש, רן חד צדדייש מודל אל IRI היתרון של כריתת כליה תקין המתבצעת בזמן הניתוח. רקמת כריתת הכליה הימנית משמשת רקמת שליטה יקר כמו במחקרים שכללו שלב מקדים שגם גורם או מדכא את הביטוי של גן או חלבון. לדוגמא, יש לנו להשתמש במודל זה כדי להעריך את ההשפעות נפשית מראש של arginate heme (HA) הזרקת 24 שעות לפני IRI כליות ^3. האינדוקציה המוצלחת של אנזים heme-oxygenase-1 cytoprotective (HO-1) על ידי HA לפני IRI אושרה ברקמת שליטת כריתת הכליה הימנית ^4. HA מופחת IRI כליה בעכברים בגיל בחלק באמצעות מנגנון תלוי HO-1. בדומה לכך, יש לנו להשתמש במודל במחקרי דלדול מקרופאג כדי לבחון את התפקיד של מקרופאגים בIRI כליות ^5. ניתוח immunohistochemical של רקמת כריתת הכליה תקין יכול לשמש כדי לאשר את היעילות של המתודולוגיה אבלציה. רקמת כריתת הכליה תקין ולכן יכולה לשמש לשניהם לאשר ולכמת את הרמה של induction או עיכוב של המולקולה של ריבית בכל בעלי חיים ניסיוניים בודדים. מודל זה יהיה עניין לחוקרים המשתמשים בתרופות או חומרים אחרים כדי לווסת את הביטוי של גנים או חלבונים וכו 'לפני הגיוס של IRI כליות.

מחקרים אחרים השתמשו חתכים אגף לגשת לכליות. המודל שתואר כאן משתמש בניתוח בטן קו האמצע אחת כדי לבצע את שני כריתת הכליה תקין ולגרום reperfusion איסכמיה של הכליה השמאלית. גישה ניתוחית זו מספקת הדמיה מצוינת של שדה הניתוח כוללים pedicles הכליות ושינויים בצבע שבאים אחרי הידוק pedicle כליות. הניסיון פורסם עם המודל ^4-6 מצביע על כך שהעכברים להתאושש במהירות מהניתוח עם שיעור הישרדות ליד 100%.

לבסוף, ניתוח הקינטית של המודל על פני תקופה של 7 ימים עולה כי מודל זה מציג שחזור של שניהם בתפקוד הכלייתי ויושרה צינורי, עםהתפשטות תאים צינוריים משמעותית.

Protocol

הערה:. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שהוטלו על ידי בעלי חיים (הליכים מדעיים) Act 1986 נהלים בוצעו באמצעות מכשירים סטריליים (autoclaved) כירורגית וחומרים מתכלים. בעוד המודל העכברי של IRI הכליות מוצג כאן בוצע על זכר 8 שבועות בן עכבר BALB / C זה יכול להתבצע reproducibly על מגוון רחב של זני Murine של שני מינים בגילים בדרך כלל בין 7-15 שבועות, עם בן גיל האופטימלי 8 שבועות. הנתונים שהוצגו בסעיף תוצאות הנציג הושגו משני BALB / ג ועכברי FVB. היישום של מי מלח מחומם משמש כדי לשמור על המעיים ואזור ניתוח לחים אבל זה צריך להיות במעקב צמוד ומינימאלי כבקשה המוגזמת של נוזלים יכול להוביל לartifactual הפחתה של הסרום או הפלזמה רמות קריאטינין, שהוא חשוב קריאת נתוני ניסוי.

1. הכנת בעלי החיים וLaparotomy

1. להרדים את העכבר עם קטמין הידרוכלוריד (70 מ"ג / קילוגרם) וhydrochloride medetomidine (1 מ"ג / קילוגרם) intraperitoneally ולאשר את עומק ההרדמה על ידי אובדן הרפלקסים למשל קמצוץ הבוהן. משך מטוס הרדמה וכתוצאה מכך הוא 4 שעות. זה מספיק כדי לבצע את ההליך הכירורגי כולו ואין צורך בהרדמה נוספת.
2. להסיר את השיער מסביב לאזור החתך, להבטיח כי האזור נקי משיער פזור, ולטהר את עור הבטן באמצעות פתרון chlorhexidine לדלל.
3. הנח את העכבר על משטח מחומם כירורגית במצב שכיבה ולתקן את הגפיים העליונים ותחתונים למשטח באמצעות דבק נמוך נקודת סימון. ודא שהגפיים העליונים נשמרים במצב נורמלי כדי למנוע דחיסת ריאות. לאורך כל ההליך לפקח על העכבר לכוויות תרמיים. במידת האפשר מומלץ שישמש מקור חום לא חשמלי.
4. לנהל את hydrochloride עצירות כאבים (0.06 מ"ג / קילוגרם)תת עורי ולהחיל סיכה העין לעיניים כדי למנוע התייבשות של קרנית. משככי כאבים מנוהלים מראש אופרטיבי על מנת לסייע בהתאוששות לאחר הניתוח.
5. שימוש ברקמה מפריד מספריים או סכין אזמל לעשות חתך פיום בטן קו האמצע ובוטות להפריד את העור מהצפק. זה מאפשר לעור והצפק שנתפרו בנפרד במהלך סגירת פצע. חתך של alba Linea avascular עשוי לתת גישה לחלל הצפק.
6. כדי ליצור תצוגה ברורה של אזור הניתוח להכניס מפשק ולעטוף את העכבר.

2. חטיבת השופכן הימני וNephrectomy

1. דחף בעדינות את המעיים לכיוון הצד השמאלי של חלל הבטן באמצעות autoclaved ספוגיות כותנה מעוקרת טבולה במלח כדי לחשוף את הכליה ושופכן הימנית. מכסה את המעיים עם וילונות לחים כדי למנוע התייבשות.
2. הרם את השופכן תקין עם מלקחיים זווית. ולקשור את השופכן תקין פעמיים באמצעות 6/0 silתפר k-קלוע. לניסויים ארוך טווח, השתמשו תפרים נספגים לכל ניתוחי הבטן.
3. מחלקים את השופכן בין התפרים. בעוד צומת vesico-ureteric צריכה למנוע משתן דולף לתוך הצפק משלפוחית ​​השתן השופכן גבעול כאמצעי הגנה מפני כל דליפה לאחר הניתוח במהלך ניסויים לטווח ארוך.
4. כדי לאפשר גישה קלה יותר בעת ביצוע כריתת הכליה הימנית, דחף בעדינות את הכבד וימינה באמצעות מקלון צמר גפן טבולה ולהחזיק במקום בעזרת גזה לחה כדי לחשוף את עורק הכליה הימני ווריד.
5. בוטות לנתח את רקמת חיבור ושומן לאורך ההיבט המדיאלי של הכליה הימנית ככל עורק הכליה הימני ווריד.
6. ליצור ערוץ מתחת לעורק הכליה וריד על ידי הזזה בזהירות את המלקחיים הזווית מתחת לכלי הדם. מדריך המלקחיים מתחת עם הטיפים סגורים ולהסיר בעדינות עם הקצוות הפתוחים כדי להקל על היווצרות של הערוץ.
7. חזור על שלב 2.6 עד קצות המלקחיים גלויים דרך רקמות חיבור בדיוק מעל העורק ווריד הכליה. ברגע שנראה לעין לשפשף בעדינות את קצות המלקחיים נגד העצות של קבוצה נוספת של מלקחיים זווית לשבור את רקמת חיבור בעדינות.
8. עם עורק הכליה וריד בבירור נגיש הם יכולים להיות סתם את החברה. מחליקים בזהירות מלקחיים זווית מתחת לעורק הכליה ווריד עם הטיפים סגורים. פעם במקום לפתוח את קצות המלקחיים ולהנחות את המוליך קליפ עוצר דמום בין הטיפים ותקיפות להחיל קליפ עוצר דמום אל עורק הכליה וורידים קרוב לכליה. לחלופין העורק ווריד הכליה ניתן ligated באמצעות תפר 6/0 קלוע משי.
9. מחלקים את העורק החסום כליות ווריד קרוב לכליות, אשר כעת ניתן להסיר עם כל רקמת חיבור חסיד שנותרה.
10. הסר את כל גזה משמשת להחזיק את הכבד ולהחליף את המעיים עם צמר גפן.

> 3. איסכמיה כליה שמאלית וreperfusion

1. דחף בעדינות את המעיים לכיוון צד ימין של חלל הבטן עם צמר גפן על מנת לחשוף את הכליה ושופכן עזבה ולכסות עם וילונות לחים. במידת צורך יכול להיות מוסח הלבלב עם גזה לחה כדי לאפשר גישה קלה יותר.
2. השתמש לנתיחה בוטה לשבור בעדינות רקמות חיבור קדמית ואחוריות לעורק הכליה השמאלי ווריד, ולאחר מכן ליצור ערוץ מתחת כלי באופן דומה לזה שתואר באגף הימני ושופכן Nephrectomy צעד 2.4.
3. לגרום לאיסכמיה של הכליה השמאלית ידי החלת קליפ serrafine מיקרו על העורק ווריד הכליה. איסכמיה מוצלחת ניתן לאשר באופן חזותי על ידי מחשיך אחיד הדרגתי של הכליות. כלי דם בנוסף לעורק הכליה השמאלי והווריד עשויים לעתים לספק את הכליות. אם הוא קיים, כלי דם נוספים אלה יהיו גם צריכים להיות occluded באמצעות קליפים serrafine מיקרו על מנת בהצלחהלגרום לאיסכמיה של כל הכליה.
4. החלף את המעיים ובזהירות להבטיח כי אין פיתולים חדים שעלולות להוביל לתוצאות מתפשרות איסכמיה של המעיים. באופן זמני לסגור את הצפק עם תפר אחד.
5. בעקבות האינדוקציה איסכמיה מקום באופן מיידי את העכבר על שמיכת homeothermic עם תרמיסטור רקטלית צורף ליחידת בקרה שתשמור על טמפרטורת הגוף על 37 מעלות צלזיוס למשך המבוקש לאיסכמיה. כדי להגדיר את האורך המתאים של איסכמיה דרושה כדי לגרום למידה הרצויה של פגיעה בכליות ואי ספיקת כליות מומלצת שטיטרציה להתבצע עבור כל זן ומפעיל כירורגית.
6. זמן קצר לפני תום תקופת איסכמי מחדש לפתוח את הצפק ובזהירות למקם את המעיים כדי לאפשר גישה למהדק ולהציג את הכליות. ההחדרה של מפשק, כפי שניתן לראות בסרטון, אין צורך ובוצעה אך ורק למטרות פרזנטציה.
7. הסר את CLמגבר לאחר תקופה של איסכמיה הגיע למסקנה. מייד לאחר הסרת הכליה במהירות תשנה את הצבע מחום כהה לורודה כהה בריא מצביע reperfusion המוצלח.
8. שוב לוודא שהמעיים אינם מעוות לפני סגירת הצפק עם שמיכת תפר באמצעות 6/0 תפר משי קלוע. ואז לסגור את העור באמצעות קליפים עור מתכתיים.
9. כדי למזער את הסיכון לזיהום שלאחר ניתוח, להחיל חיטוי כגון תמיסת יוד / אלכוהול לאזור הניתוח.

4. התאוששות שלאחר ניתוח וטיפול

1. תת עורי הרדמה חלקית הפוכה עם hydrochloride atipamezole (2 מ"ג / קילוגרם) ולנהל נוזלים עם הזרקה תת עורית של 1 מיליליטר חימם מלח כדי למנוע התייבשות לאחר ניתוח.
2. זהירות לפקח עכברים עד שהם חזרו להכרתו, מופיע התראה והם מסוגלים לתקן את עצמם.
3. מאפשרים עכברים להתאושש בקופסא מחוממת המשיכו ב29 C °, located בסביבה שקטה, ל24 שעות. יהיו לי עכברי יכולת לקויה thermoregulate בשל ההרדמה ולכן חיוני כי הם שוכנו בטמפרטורה גבוהה, כדי לאפשר התאוששות יעילה. יכול להיות גם סיפק מזון טבול לעודד נוזלים וצריכת תזונה.
4. עבור ניסויי התאוששות לטווח ארוך מספקים משככי כאבים מתמשכים ולהסיר סרטוני עור 7 ימים לאחר ניתוח.

5. הערכת פגיעה בכליות פונקציונלית מבנית והתחדשות

1. דם ניתן לגבות מוריד הזנב במהלך ניסויים או על ידי לנקב לב בעת המתת חסד בסוף הניסוי. למדוד את תפקוד כליות על ידי קריאטינין בסרום, תוך שימוש בשיטת creatinase מבוסס, וחנקן אוריאה בדם (BUN) על מנתח צנטריפוגלי יוכימיים כפי שתואר לעיל ^7. תפקוד הכליות של עכברים בריאים נורמלים צריך להיקבע לפני הקמת מודל של אי ספיקת כליות כמו זה יכול להשתנות במידה ניכרת depending על שיטת הניתוח המשמשת לדוגמא את התגובה יפה ושיטות creatinase מבוססות למדידת קריאטינין לתת תוצאות שונות.
2. לבחון את מבנה כליה על ידי histopathology בסעיפי רקמות פרפין מוטבע כליות מוכתמות בHaematoxylin ו eosin (H & E) או תקופתי חומצה שיף (PAS). ללכוד בין 5-10 תמונות בהגדלה של 200x בתוך הפס החיצוני של מדולה החיצונית (OSOM) לכל עכבר. להעריך את רמת הפגיעה בOSOM כאזור זה נפגע במודל זה משום שהוא פגיע מאוד להיפוקסיה.
3. השתמש באחת משתי מערכות הניקוד מפורטות להלן כדי למדוד נמק חריף צינוריים (ATN) או התחדשות. מורפולוגיה נציג של הסיווגים בשימוש במערכות אלה מודגמת באיור 1.
4. השתמש במערכת בינארית פשוטה להבקיע ATN. על הבסיס של יושר סלולארי וסימן מורפולוגיה ולספור tubules כמו גם (מורפולוגיה שלמות תא) קיימא או נמקים (inte תא נפגעיםgrity, מורפולוגיה נורמלית תא או אובדן של תאים).
   1. לבטא את מספר צינוריות נמקים כאחוז מהמספר הכולל של צינוריות (tubules נימקי%).
5. לסווג התחדשות באמצעות מערכת אחרת המבוססת על שלמות התא, מורפולוגיה ומספר גרעינים. tubules מארק ולספור בריאים, נמקים, פצוע או מתאושש בהתאם לקריטריונים המפורטים בשלבים הבאים.
   1. כמו במערכת ATN הניקוד (המפורטת בצעד 5.4) tubules סימן עם תאים נורמלים ללא פגע בריאים כתוך tubules מראה שלמות תא נפגעה, מורפולוגיה של תאים חריג או אובדן תא גלוי צריכה להיות הבקיע כנימקים.
   2. לסווג את הצינוריות כנפצעו אם יש להם ציטופלסמה דליל המכילה כמה גרעינים. בניגוד לכך, לייעד צינוריות המכילות יותר גרעינים עם מורפולוגיה של תאים נורמלים יותר כמחלים.
   3. להביע כל סיווג אבובית כאחוז מהמספר הכולל אבובית.

תוצאות

פציעה והתאוששות צינורי עשויות להיות מוערכת על ידי H & E או צביעת PAS של חלקי רקמות הבאים IRI כליות. קשיות ממוקמות בתוך OSOM מסווגים כבריאים, נפגע, נמקים או מחלים על פי מורפולוגיה של תאים, יושרה ומספר גרעינים (איור 1). הפגיעה התפקודית ומבנית במודל זה היא תלויה משך אי?...

Discussion

IRI כליות הוא גורם חשוב של AKI ללא טיפול ספציפי זמין. מחקר ניסיוני של IRI הכליות היה אינפורמטיבי מאוד עם העבודה קודמת הוכיחה את התפקיד של מקרופאגים, תאים הדנדריטים, לימפוציטים, תאים אחרים תאי T רגולטורים, כמו גם ומגשרים באינדוקציה של שניהם פגיעה חריפה וריפוי שלב ^{5,8 - 16.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue scissors	Fine Science Tools	14072 - 10
Micro-Adson forceps (Rat toothed)	Fine Science Tools	11019 - 12
S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled	Fine Science Tools	00649-11
Colibri retractor	Fine Science Tools	17000 - 04
Micro clip applicator	Fine Science Tools	18057-14
Micro serrafines	Fine Science Tools	18055-04
Olsen-Hegar needle holder	Fine Science Tools	12002 - 12
Hemoclip Plus Ligating Clips Small	Weck	533837
Autoclip Wound Clip System, 9mm	Harvard Apparatus	PY2 52-3748
Silk Black Braided Suture, Size 6-0	Harvard Apparatus	723288
Standard Heat Matt
Homeothermic Blanket & Control Unit	Harvard Apparatus
Lacri-Lube	Allergan
Vetasept Chlorhexidine	AnimalCare
Vetalar : Ketamine hydrochloride			100 mg/ml solution
Domitor : medetomidine hydrochloride			1 mg/ml
Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride			0.3 mg/ml
Antisedan : Atipamezole hydrochoride			5 mg/ml