Renale Ischämie Reperfusionsschaden: Ein Maus-Modell der Schädigung und Regeneration

Zusammenfassung

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

Zusammenfassung

Renale Ischämie Reperfusionsschaden (IRI) ist eine häufige Ursache der akuten Nierenschädigung (AKI) in Patienten-und Verschluss der Nierendurchblutung ist bei Nierentransplantation unumgänglich. Experimentelle Modelle, die genau und reproduzierbar zu rekapitulieren Nieren IRI sind entscheidend bei der Zerlegung der Pathophysiologie des AKI und die Entwicklung neuartiger Therapeutika. Präsentiert hier ist ein Maus-Modell der Nieren IRI, die in reproduzierbarer AKI führt. Dies wird durch eine Mittellinie Laparotomie Ansatz für die Operation mit einem Einschnitt ermöglicht sowohl eine rechte Nephrektomie das Kontrollgewebe und Klemmung der linken Nieren Pedikel Ischämie der linken Niere induzieren stellt erreicht. Durch sorgfältige Überwachung der Spannposition und die Körpertemperatur während der Dauer der Ischämie dieses Modell erzielt reproduzierbare funktionelle und strukturelle Verletzung. Mäuse getötet, 24 Stunden nach der Operation zeigen, Verlust der Nierenfunktion mit Erhöhung des Serum-oder Plasma-Kreatinin-Spiegel sowie Strukturliche Nierenschäden mit akuten Tubulusnekrose offensichtlich. Die Nierenfunktion verbessert und nach Nieren IRI, so dass dieses Modell verwendet werden, um die Nierenregeneration untersuchen die akute Gewebeverletzung löst im Laufe von 7 Tagen. Dieses Modell der Nieren IRI wurde verwendet, um die molekularen und zellulären Pathophysiologie der AKI sowie die Analyse der nachfolgenden Nierenregeneration zu studieren.

Einleitung

Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) ist eine häufige Art der Verletzung mehrerer Organe, einschließlich Niere, Herz und Gehirn. Renal IRI kann zu akuten Nierenschädigung (AKI) in Patienten zu führen und keine spezifische Behandlung zur Verfügung steht. AKI infolge IRI eine komplizierte Pathogenese den sowohl der angeborenen und erworbenen Immunantwort ^1. Ein experimentelles Modell der Nieren IRI bietet die Möglichkeit, die wichtigsten Zellen und Mediatoren in der Pathogenese der AKI sowie die anschließende Nierenregeneration, die über folgenden Tagen erfolgt beteiligt sezieren. Darüber hinaus sind die Auswirkungen der neuen therapeutischen Mittel bei Krankheitsprozessen beurteilt werden kann.

Das Gesamtziel des experimentellen Modell der Nieren IRI hier beschrieben ist, um sowohl akuten funktionellen und strukturellen Nierenschädigung zu induzieren. Einige Forscher haben ein Modell, das die Induktion von bilateralen IRI ² beinhaltet genutzt. Obwohl die bilateralen Nieren IRI-Modell ist der Einsatz, die einseitige ernal IRI-Modell hat den Vorteil einer Nephrektomie rechts zum Zeitpunkt der Operation vorgenommen. Das Recht Nephrektomie Gewebe dient als wertvolle Kontrollgewebe in Studien mit Vorbehandlungsstufe, die entweder induziert oder unterdrückt die Expression eines Gens oder des Proteins. Zum Beispiel haben wir dieses Modell verwendet, um die Wirkung von Häm Präkonditionierung Arginat (HA) Injektion 24 Stunden vor Nieren IRI ³ zu beurteilen. Die erfolgreiche Induktion der zellschützenden Enzyms Häm-Oxygenase-1 (HO-1) von HA vor IRI in die richtige Nephrektomie Kontrollgewebe ⁴ bestätigt. HA reduzierten Nieren IRI in alten Mäusen zum Teil über eine HO-1-abhängigen Mechanismus. Ebenso haben wir das Modell in Makrophagen-Depletion Studien verwendet, um die Rolle von Makrophagen im Nieren IRI ⁵ zu prüfen. Immunhistochemische Analyse des rechten Nephrektomie Gewebe kann verwendet werden, um die Wirksamkeit der Ablation Methode zu bestätigen. Das Recht Nephrektomie Gewebe kann daher sowohl bestätigen verwendet werden und auch den Grad von induction oder Hemmung des Moleküls von Interesse in jedem einzelnen Versuchstier. Dieses Modell wird von Interesse für Forscher, die mit Medikamenten oder anderen Verbindungen, die Expression der Gene oder Proteine ​​usw. vor der Induktion der Nieren IRI modulieren.

Andere Studien haben Flanke Einschnitte verwendet werden, um die Nieren zu gelangen. Das hier beschriebene Modell verwendet einen einzelnen Mittellinie der Bauchchirurgie, sowohl die rechte Nephrektomie durchführen und induzieren Ischämie Reperfusion der linken Niere. Dieses chirurgische Vorgehen bietet eine hervorragende Visualisierung des Operationsfeldes einschließlich der Nieren Stiele und Farbveränderungen, die die Nierenstielspann folgen. Unsere veröffentlichten Erfahrungen mit dem Modell ^6.4 zeigt, dass Mäuse, schnell von der Operation erholen mit einer nahezu 100% Überlebensrate.

Schließlich kinetische Analyse der Modell über einen Zeitraum von 7 Tagen zeigt, dass dieses Modell die Wiederherstellung der Nierenfunktion und beide Rohr Integrität, mitsignifikante Rohrzellproliferation.

Protokoll

HINWEIS:. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften durch die Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 auferlegt wurden Verfahren durchgeführt unter Verwendung von sterilen (autoklaviert) chirurgische Instrumente und Verbrauchsmaterialien durchgeführt. 15 Wochen, mit dem optimalen Alter Befinden - Während die Mausmodell der Nieren IRI präsentiert hier wurde auf einem 8-Wochen alten männlichen Balb / c-Maus ist es reproduzierbar auf einer Vielzahl von Maus-Stämme von beiden Geschlechtern in der Regel zwischen 7 Jahren durchgeführt werden durchgeführt 8 Wochen. Die in der repräsentative Ergebnisse Abschnitt präsentierten Daten wurden sowohl aus Balb / c und FVB-Mäusen erhalten. Die Anwendung von Kochsalzlösung erwärmt wird verwendet, um den Darm und OP-Bereich feucht zu halten, aber es sollte sorgfältig überwacht und auf ein Minimum, wie die übermäßige Anwendung von Flüssigkeiten aufbewahrt werden können, um ein Artefakt Senkung des Serum-oder Plasma-Kreatinin-Werte, die eine wichtige ist zu führen Versuchsanzeige.

1. Tier Vorbereitung und Laparotomie

1. Anesthetize die Maus mit Ketamin-Hydrochlorid (70 mg / kg) und Medetomidinhydrochlorid (1 mg / kg) intraperitoneal und bestätigen Sie die Narkosetiefe durch den Verlust der Reflexe, zB Zehen Prise. Die Dauer des resultierenden Anästhesieebene beträgt 4 Stunden. Dies ist ausreichend, um die gesamte chirurgische Prozedur durchzuführen, und keine zusätzliche Anästhesie erforderlich.
2. Entfernen Sie die Haare um den Schnittbereich, sicherzustellen, dass das Gebiet ist frei von losen Haaren und desinfizieren die Bauchhaut mit einer verdünnten Lösung Chlorhexidin.
3. Platzieren Sie die Maus auf einem beheizten Operations Pad in Rückenlage und die oberen und unteren Extremitäten zu beheben, um das Pad mit Low-Tack Klebeband. Sicherzustellen, dass die oberen Enden in einer normalen Position in der Lunge zu verhindern Kompression gehalten. Während des gesamten Verfahrens überwachen die Maus für Verbrennungen. Wenn möglich, wird empfohlen, eine nicht-elektrische Wärmequelle verwendet werden.
4. Verwalten des Analgetikum Buprenorphin-Hydrochlorid (0,06 mg / kg)subkutan und anwenden Auge Schmiermittel auf die Augen, um Hornhaut austrocknet. Analgetika werden vor der Operation, um die postoperative Genesung zu unterstützen verabreicht.
5. Mit Trenngewebe oder eine Schere Skalpell einen Mittellinie Laparotomieschnitts und unverblümt trennen die Haut vor dem Bauchfell. Dies erlaubt der Haut und Bauchfell, die während Wundverschluss separat genäht werden. Ein Schnitt der avaskulären linea alba gemacht, die Zugang zu der Bauchhöhle.
6. Um eine klare Sicht auf das Operationsgebiet zu erstellen legen Sie eine Aufroller und legen Sie die Maus.

2. Harnleiter-Division und der rechten Nephrektomie

1. Drücken Sie vorsichtig den Darm in Richtung der linken Seite der Bauchhöhle mit einem Wattestäbchen im Autoklaven sterilisiert mit Kochsalzlösung, um die rechte Niere und Harnleiter aussetzen befeuchtet. Bedecken Sie den Darm mit angefeuchteten Vorhänge Austrocknen zu verhindern.
2. Heben Sie den rechten Harnleiter mit abgewinkelten Pinzette. Ligation das Recht Harnleiter zweimal mit 6/0 silk-geflochten Naht. Für Langzeit-Experimenten, verwenden Sie resorbierbaren Fäden für alle Bauchoperationen.
3. Teilen Sie die Harnleiter zwischen den Nähten. Während die Blasen-Harnleiter-Kreuzung sollte Urin aus undichten in das Peritoneum von der Blase zu verhindern, der Harnleiter wird als Schutz gegen Leckagen postoperativ bei Langzeitexperimenten ligiert.
4. Um einen leichteren Zugang zu ermöglichen, wenn die Durchführung der Nephrektomie rechts, schieben die Leber und auf der rechten Seite mit einem angefeuchteten Wattestäbchen und halten Sie ihn mit feuchten Gaze, um die rechte Nierenarterie und Vene freizulegen.
5. Unverblümt sezieren das Bindegewebe und Fett zusammen medial der rechten Niere bis in die rechte Nierenarterie und Vene.
6. Erstellen Sie einen Kanal unterhalb der Nierenarterie und Vene durch vorsichtiges Schieben der abgewinkelten Pinzette unterhalb der Blutgefäße. Führen Sie die Zange mit unter die Spitzen geschlossen und vorsichtig mit den Spitzen, um die Bildung des Kanals erleichtern offen zu entfernen.
7. Wiederholen Sie Schritt 2,6 bis die Spitzen der Zange sind durch das Bindegewebe nur über die Nierenarterie und Vene sichtbar. Sobald sichtbar sanft reiben die Spitzen der Zange gegen die Spitzen der anderen Satz von abgewinkelten Pinzette vorsichtig brechen das Bindegewebe.
8. Mit der Nierenarterie und Vene deutlich zugänglichen sie nun verschlossen werden. Schieben abgewinkelten Pinzette unterhalb der Nierenarterie und Vene mit die Spitzen geschlossen. Einmal im Ort öffnen die Spitzen der Pinzette und führen die blutstillende Clip-Applikator zwischen den Spitzen und fest wenden eine blutstillende Clip auf die Nierenarterie und Vene in der Nähe der Niere. Alternativ kann die Nierenarterie und Vene kann mit 6/0 Seide geflochtene Nahtmaterial ligiert werden.
9. Teilen Sie die verstopften Nierenarterie und Vene in der Nähe der Niere, die jetzt mit jedem noch anhaftende Bindegewebe entfernt werden können.
10. Entfernen Sie alle Gaze verwendet, um die Leber zu halten und ersetzen den Darm mit Wattestäbchen.

3. Linke Niere Ischämie und Reperfusion

1. Drücken Sie vorsichtig den Darm auf die rechte Seite der Bauchhöhle mit Wattestäbchen, um die linke Niere und Harnleiter freizulegen und decken mit angefeuchteten Vorhänge. Bei Bedarf kann die Bauchspeicheldrüse mit angefeuchteten Mull abgelenkt werden, einen leichteren Zugang zu ermöglichen.
2. Verwenden stumpf, um sanft zu brechen das Bindegewebe vor und hinter der linken Nierenarterie und Vene, und erstellen Sie einen Kanal unterhalb der Gefäße in einer ähnlichen Weise wie in Harnleiter-Division und der rechten Nephrektomie beschriebenen Schritt 2.4.
3. Induzieren Ischämie der linken Niere, indem eine Mikro serrafine Clip auf die Nierenarterie und Vene. Erfolgreiche Ischämie kann visuell durch einen allmählichen Verdunkelung des einheitlichen Niere bestätigt werden. Blutgefäße neben der linken Nierenarterie und-vene gelegentlich liefern die Niere. Falls vorhanden, müssen auch diese zusätzlichen Blutgefäße mit Mikro serrafine Clips, um erfolgreich verschlossen werdeninduzieren Ischämie der gesamten Niere.
4. Ersetzen Sie den Darm und sorgfältig sicherzustellen, dass es keine abrupten Wendungen, die zu Darm Ischämie kompromittierenden Ergebnissen führen können. Vorübergehend schließen Sie das Bauchfell mit einer einzigen Naht.
5. Nach Ischämie Induktions sofort die Maus auf einem homöothermen Decke mit einer rektalen Thermistor mit einer Steuereinheit, die die Körpertemperatur bei 37 ° C für die erforderliche Dauer der Ischämie beibehält befestigt. Um die entsprechende Länge der Ischämie notwendig definieren, um den gewünschten Grad der Nierenschädigung und Nierenversagen induziert wird empfohlen, dass eine Titration für jeden Stamm und chirurgischen Operateur durchgeführt werden.
6. Kurz vor dem Ende des ischämischen Periode wieder öffnen das Bauchfell und sorgfältig positionieren den Darm, den Zugang zu der Klemme ermöglichen und sehen Sie die Niere. Einsetzen des Retraktors, wie in dem Video gezeigt wird, ist nicht erforderlich und wurde lediglich aus Darstellungszwecken durchgeführt.
7. Entfernen Sie die clamp nach der Zeit der Ischämie wurde abgeschlossen. Unmittelbar nach der Entfernung der Niere die Farbe von einem dunklen kastanienbraunen schnell ändern, um eine gesunde dunkelrosa was eine erfolgreiche Reperfusion.
8. Wieder sicher, dass der Darm nicht vor dem Schließen des Bauchfells mit einem Zierstich mit 6/0 geflochtenen Seidennahtmaterial verdrillt. Schließen Sie dann die Haut mit Hilfe metallische Haut-Clips.
9. Um die Gefahr von postoperativen Infektion zu minimieren, wenden ein Antiseptikum, wie Iod / Alkohol-Lösung auf das Operationsgebiet.

4. Post-operative Wiederherstellung und Pflege

1. Teilweise Rückwärts Anästhesie mit Atipamezol-Hydrochlorid (2 mg / kg) subkutan zu verabreichen und Flüssigkeiten mit einer subkutanen Injektion von 1 ml Kochsalzlösung erwärmt, um eine Dehydratation nach der Operation zu verhindern.
2. Mäuse sorgfältig zu überwachen, bis sie das Bewusstsein wiedergewonnen, erscheint aufmerksam und sind in der Lage, sich aufzurichten.
3. Veröffentlichung Mäuse in einem beheizten Feld wieder bei 29 ° C, loc gehaltenATED in einer ruhigen Umgebung, für 24 Std. Mäuse eine beeinträchtigte Fähigkeit, aufgrund der Anästhesie thermoregulate haben und es ist daher wichtig, dass sie bei einer erhöhten Temperatur untergebracht, um effektive Rückgewinnung zu ermöglichen. Angefeuchtet Nahrung kann ebenfalls vorgesehen, um Fluid-und Nahrungsaufnahme fördern.
4. Für die langfristige Erholung Experimente liefern laufenden Analgetika und entfernen Hautklammern 7 Tage nach der Operation.

5. Beurteilung der Struktur-und Funktions Kidney Injury und Regeneration

1. Blut aus der Schwanzvene in Experimenten oder durch Herzpunktion zum Zeitpunkt der Euthanasie am Ende des Experiments gesammelt werden. Messen der Nierenfunktion durch Serum-Kreatinin, mit einem Creatinase basierte Methode, und Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) auf einer biochemischen Zentrifugalanalysator wie zuvor ⁷ beschrieben. Sollen, bevor ein Modell von Nierenversagen, wie diese ermittelt werden, der Nierenfunktion von normalen gesunden Mäusen benötigt, kann deutlich variieren depending auf der zB der Jaffe-Reaktion und Creatinase basierte Methoden zur Messung der Kreatinin-Analysemethode zu unterschiedlichen Ergebnissen.
2. Untersuchen Nierenstruktur durch Histopathologie auf Paraffin eingebettet Nierengewebeschnitten mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) oder Periodic Acid Schiff (PAS) gefärbt. Erfassen von 5 - 10 Aufnahmen in 200-facher Vergrößerung der äußeren Streifen der äußeren Medulla (OSOM) für jede Maus. Beurteilen Sie den Grad der Verletzung in der OSOM da diese Region ist in diesem Modell verletzt, weil sie sehr anfällig für Hypoxie ist.
3. Verwenden Sie eine der beiden unten beschriebenen Scoring-Systeme, um akute tubuläre Nekrose (ATN) oder Regeneration zu messen. Repräsentative Morphologie der in diesen Systemen verwendeten Einstufungen ist in Abbildung 1 dargestellt.
4. Verwenden Sie einen einfachen binären System zu punkten ATN. Auf der Basis der Zellintegrität und Morphologie Marke und zählen Tubuli entweder als lebensfähig (intakte Zellmorphologie) oder nekrotischen (kompromittiert Zelle integrity, anormale Zellmorphologie oder Verlust von Zellen).
   1. Ausdruck der Anzahl der nekrotischen Tubuli als Prozentsatz der Gesamtzahl der Tubuli (Röhrchen nekrotischen%).
5. Bewerte Regeneration mit einem anderen System, das auf die Integrität der Zelle, Morphologie und Keimzahl. Mark und zählen Tubuli als gesund, nekrotischen, verletzt oder Wiederherstellung nach den in den folgenden Schritten aufgeführten Kriterien.
   1. Wie bei der ATN-Scoring-System (in Schritt 5.4 beschrieben) markieren Tubuli mit intakter als normale Zellen, während gesunde Tubuli mit eingeschränkter Zellintegrität sollte abnorme Zellmorphologie oder offene Zellverlust als nekrotischen erzielt werden.
   2. Bewerte Tubuli als verletzt, wenn sie einen ausgedünnten Zytoplasma mit wenigen Kernen haben. Im Gegensatz dazu bezeichnen Tubuli mit mehr Kernen mit normaler Zellmorphologie als erholt.
   3. Express jedes Röhrchen Einstufung als Prozentsatz der Gesamtzahl Röhrchen.

Ergebnisse

Rohrschäden und Wiederherstellung kann von H & E oder beurteilt werden PAS-Färbung von Gewebeschnitten nach Nierentransplantation IRI. Tubuli innerhalb der OSOM liegen so gesund, verletzt, nekrotischen oder die Rückgewinnung nach der Zellmorphologie, Integrität und Keimzahl (Abbildung 1) eingestuft. Die funktionellen und strukturellen Schädigung in diesem Modell ist abhängig von der Dauer der Ischämie. Eine fortschreitende Zunahme der Schwere der Nierenfunktionsstörung, durch Plasma-Kreatini...

Diskussion

Renal IRI ist eine wichtige Ursache von AKI ohne spezifische Behandlung zur Verfügung. Die experimentelle Untersuchung der Nieren IRI sehr informativ mit früheren Arbeiten zeigen die Rolle von Makrophagen, dendritische Zellen, Lymphozyten, regulatorische T-Zellen als auch andere Zellen und Mediatoren in die Induktion sowohl der akuten Verletzung und Heilung Phase war ^{5,8 - 16.} Zusätzlich experimentelle Nieren IRI verwendet wurde, um die Wirkung verschiedener therapeutischer Mittel ^4,17-19 beurte...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue scissors	Fine Science Tools	14072 - 10
Micro-Adson forceps (Rat toothed)	Fine Science Tools	11019 - 12
S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled	Fine Science Tools	00649-11
Colibri retractor	Fine Science Tools	17000 - 04
Micro clip applicator	Fine Science Tools	18057-14
Micro serrafines	Fine Science Tools	18055-04
Olsen-Hegar needle holder	Fine Science Tools	12002 - 12
Hemoclip Plus Ligating Clips Small	Weck	533837
Autoclip Wound Clip System, 9mm	Harvard Apparatus	PY2 52-3748
Silk Black Braided Suture, Size 6-0	Harvard Apparatus	723288
Standard Heat Matt
Homeothermic Blanket & Control Unit	Harvard Apparatus
Lacri-Lube	Allergan
Vetasept Chlorhexidine	AnimalCare
Vetalar : Ketamine hydrochloride			100 mg/ml solution
Domitor : medetomidine hydrochloride			1 mg/ml
Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride			0.3 mg/ml
Antisedan : Atipamezole hydrochoride			5 mg/ml