Почечная ишемия реперфузии: Мышь Модель травмы и регенерация

Резюме

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

Аннотация

Почечная травмы ишемии реперфузии (ИРИ) является распространенной причиной острой почечной травмы (AKI) у пациентов и окклюзии почечного кровотока неизбежно во время трансплантации почек. Экспериментальные модели, которые точно и воспроизводимо воспроизводят почечной IRI имеют решающее значение в рассекает патофизиологии AKI и развитие новых терапевтических агентов. Представленные здесь модели мыши почечной ИРИ, что приводит к воспроизводимым AKI. Это достигается за счет подхода средней линии лапаротомии для хирургии с одним разрез позволяет как правый нефрэктомию, что обеспечивает контроль ткани и зажим левой почечной ножки, чтобы вызвать ишемию левой почки. Путем тщательного мониторинга положения зажима и температуры тела в период ишемии эта модель достигает воспроизводимый функциональную и структурную травмы. Мыши пожертвовал 24 ч после операции демонстрируют потерю функции почек с повышением сыворотке или плазме уровня креатинина, а также структураТурал повреждение почек с острый тубулярный некроз разумеющееся. Почечная функция улучшает и острого повреждения ткани решает течение 7 дней после почечных ИРИ таким образом, что эта модель может быть использована для изучения почечной регенерации. Эта модель почечной ИРИ была использована для изучения молекулярной и клеточной патофизиологии AKI, а также анализ последующей почечной регенерации.

Введение

Ишемия реперфузии (ИРИ) является распространенным способом получения травмы от нескольких органов, включая почки, сердца и головного мозга. Почечная ИРИ может привести к острой почечной травмы (AKI) у пациентов и особого лечения не доступен. АКИ в результате ИРИ имеет сложную патогенез участием как врожденного и адаптивного иммунного ответа ^1. Экспериментальная модель почечной ИРИ предлагает потенциал рассекать ключевые клетки и медиаторы, участвующие в патогенезе AKI, а также последующей почечной регенерации, которая следует за последующие дни. Кроме того последствия новых терапевтических агентов на болезненные процессы могут быть оценены.

Общая цель экспериментальной модели почечной ИРИ, описанный здесь, чтобы побудить как острый функциональную и структурную ушиб почки. Некоторые исследователи использовали модель, которая включает в себя индукцию двустороннего ИРИ ^2. Хотя двусторонние почечной модель IRI является использования, одностороннее детьмиаль ИРИ модель имеет то преимущество, правой почки, прилагаемые на время операции. Право почки ткань служит ценным управления ткани в исследованиях с участием стадию предварительной обработки, что либо индуцирует или подавляет экспрессию гена или белка. Например, мы использовали эту модель для оценки предварительной подготовки эффекты гема аргинат (HA) для инъекций 24 часа до почечной ИРИ ^3. Успешное индукция цитопротекторный фермента гема-оксигеназы-1 (HO-1) HA до ИРИ было подтверждено в правильном управления почки ткани ^4. HA снижается почечный IRI у мышей в возрасте частично через HO-1 зависимый механизм. Точно так же, мы использовали модель в макрофагов исследований истощения изучить роль макрофагов в почечной ИРИ ^5. Иммуногистохимический анализ правой нефрэктомии ткани могут быть использованы для подтверждения эффективности методики абляции. Таким образом, право почки ткань может быть использована как для подтверждения и количественного определения уровня Induction или ингибирование интерес молекулы в каждом отдельном экспериментального животного. Эта модель будет представлять интерес для исследователей, которые используют наркотики или другие соединения модулировать экспрессию генов или белков и т.д. до индукции почечной ИРИ.

Другие исследования использовали фланговые разрезы для доступа почки. Модель, описанная здесь используется один срединный абдоминальной хирургии выполнять как правильный нефрэктомию и вызывают ишемии реперфузии левой почки. Это хирургический подход обеспечивает отличную визуализацию операционного поля в том числе почечных ножек и цветовых изменений, которые следуют почечной ножке зажима. Наша опубликованы опыт с моделью ^4-6 указывает, что мыши быстро оправиться от операции с почти выживаемости 100%.

Наконец, кинетический анализ модели в течение периода 7 дней показывает, что эта модель демонстрирует восстановление функции почек, так и целостность трубчатой, сзначительное распространение трубчатые клетки.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ:. Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и нормами, установленными Законом 1986 животных (научные процедуры) были проведены процедуры с использованием стерильных (автоклавного) хирургических инструментов и расходных материалов. В то время как мышиной модели почек ИРИ, представленные здесь проводили на 8-недельных самцов Balb / C мышей можно воспроизводимо выполняется на различных мышиных штаммов обоего пола, как правило, в возрасте от 7 - 15 недель, с оптимальной возрастной существо 8 недель. Данные, представленные в разделе результатов представительной была получена как от линии BALB / C мышей и FVB. Применение подогретой физиологического раствора используется для поддержания кишечника и хирургическую область влажной, но она должна быть тщательно проверены и сведены к минимуму, что и чрезмерного применения жидкостей может привести к артефактом понижение сыворотке или плазме уровня креатинина, что является важным экспериментальная считывания.

1. Подготовка животных и Лапаротомия

<ол>

Обезболить мышь с кетамином гидрохлорида (70 мг / кг) и медетомидина гидрохлорида (1 мг / кг) внутрибрюшинно и проверка глубины анестезии потерей рефлексов например ног крайнем случае. Продолжительность результате анестезии плоскости 4 часа. Этого достаточно для выполнения всей хирургической операции и не дополнительное обезболивание не требуется.

Удалить волосы вокруг область разреза, гарантировать, что область свободна от распущенными волосами, и дезинфицировать кожу с брюшка с помощью разбавленного раствора хлоргексидина.

Наведите мышь на хирургическом площадку с подогревом в лежачем положении и исправить верхних и нижних конечностей на площадку с помощью низкой липкости клейкую ленту. Убедитесь, что верхние конечности поддерживаются в нормальном положении, чтобы предотвратить сжатие легких. Во время процедуры мониторинга мышь для термических ожогов. Если это возможно, рекомендуется неэлектрических источник тепла можно использовать.

Администрирование гидрохлорид анальгетик бупренорфин (0,06 мг / кг)подкожно и применять глаз смазку на глазах, чтобы предотвратить роговицы сушки. Анальгетики вводят до операции, чтобы способствовать пост-хирургического восстановления.

Использование ткани, отделяющей ножницы или лезвие скальпеля сделать срединный лапаротомии разрез и прямо отделить кожу от брюшины. Это позволяет коже и брюшины, чтобы быть пришиты отдельно во время закрытия раны. Разрез из аваскулярный белой линии производится, дающие доступ к брюшной полости.

Чтобы создать четкое представление о хирургической области вставить втягивающим и драп мышь.

2. Мочеточника дивизия и правой Нефрэктомия

1. Аккуратно нажмите кишечник к левой стороне брюшной полости с использованием автоклавного стерилизованные ватные тампоны, смоченные физиологическим раствором, чтобы разоблачить правильный почек и мочеточников. Обложка кишечник с увлажненными шторы, чтобы предотвратить высыхание.
2. Поднимите правую мочеточник с угловыми щипцами. Лигируют правого мочеточника дважды с помощью 6/0 SILк-плетеные шов. Для долгосрочных экспериментов, использовать рассасывающиеся нити для всех брюшных операций.
3. Разделите мочеточник между швами. В то время как пузырно-мочеточниковый перехода должно препятствовать оттоку мочи в брюшину из мочевого пузыря мочеточник лигируется как гарантия против во время долгосрочных экспериментов какой-либо утечки после операции.
4. Чтобы облегчить доступ при выполнении правильного нефрэктомию, аккуратно вставьте вверх печени и вправо с помощью смоченной ватный тампон и удерживать на месте с помощью увлажненной марлей, чтобы выставить правильный почечной артерии и вены.
5. Грубо рассекают соединительной ткани и жира вдоль медиальной части правой почки, насколько правой почечной артерии и вены.
6. Создание канала под почечной артерии и вены, аккуратно сняв угловые щипцы под кровеносных сосудов. Руководство щипцы под кончиками закрыты и аккуратно удалить с советами открытых в целях содействия формированию канала.
7. Повторите шаг 2,6 до кончики щипцов не могут видеть через соединительной ткани чуть выше почечной артерии и вены. После того, как видно аккуратно руб кончики пинцета против кончиков другой набор угловых пинцетом аккуратно разорвать соединительную ткань.
8. С почечной артерии и вены отчетливо доступны они теперь могут быть окклюзии. Аккуратно вставьте под углом щипцов под почечной артерии и вены с кончики закрыты. Как только на месте открыть кончики щипцов и направлять кровоостанавливающим клип аппликатор между кончиками и плотно оберните гемостатической клип на почечной артерии и вены близко к почке. Альтернативно почечная артерия и вена может быть лигировали с использованием 6/0 шелк плетеный шов.
9. Разделите окклюзии почечной артерии и вены близко к почке, который теперь может быть удален с любого оставшегося прилипшего соединительной ткани.
10. Удалите марлю, используемый для удержания печень и заменить кишечник с ватными тампонами.

3. Левая почка ишемии и реперфузии

1. Аккуратно нажмите кишечник к правой стороне брюшной полости с ватные тампоны, чтобы выставить левую почку и мочеточник и накрыть смоченной шторы. При необходимости поджелудочная железа может быть отклонен с влажной марлей, чтобы облегчить доступ.
2. Использование тупым, чтобы аккуратно разорвать соединительной ткани передней и задней на левой почечной артерии и вены, а затем создать канал под сосудов в подобном тому, как описано в мочеточник отдела и правого нефрэктомии шагу 2.4.
3. Вызвать ишемию левой почки, применяя клип микро serrafine на почечной артерии и вены. Успешное ишемия может быть визуально подтверждается постепенным равномерным затемнением почки. Кровеносные сосуды в дополнение к левой почечной артерии и вены может иногда поставить почку. Если присутствует, эти дополнительные кровеносные сосуды также должны быть окклюзии с помощью микро serrafine клипы для того, чтобы успешновызвать ишемию всей почки.
4. Заменить кишечник и тщательно убедиться, что нет никаких резких поворотов, которые могут привести к кишечным ишемии результатов компрометирующих. Временно закрыть брюшины с одним швом.
5. После индукции ишемии сразу поместить курсор мыши над теплокровного одеяло с ректального термистора, подключенного к блоку управления, которая будет поддерживать температуру тела при 37 ° С в течение требуемого времени ишемии. Чтобы определить необходимую длину ишемии, необходимой, чтобы вызвать желаемую степень повреждения почек и почечной недостаточности рекомендуется титрование быть выполнена для каждого штамма и хирургического оператора.
6. Незадолго до конца ишемического периода повторного открытия брюшину и тщательно позиционировать кишечники для того чтобы разрешить доступ к зажимом и просматривать почку. Вносимые из втягивающего, как показано на видео, не является необходимым и был исключительно производится для целей представления.
7. Снимите клусилитель после периода ишемии заключил. Сразу после удаления почки быстро меняют цвет с темно-бордовым на здоровую темно-розовые с указанием успешного реперфузию.
8. Опять гарантировать, что кишечник не перекручены до закрытия брюшины с одеялом стежка с помощью 6/0 плетеный шелковый шов. Затем закройте кожу с помощью металлических зажимов кожи.
9. Чтобы свести к минимуму риск послеоперационного инфицирования, нанесите антисептик, например, йода / спиртовом растворе в хирургической области.

4. Послеоперационный Восстановление и уход

1. Частично обратной анестезии с Атипамезол гидрохлорид (2 мг / кг) подкожно и администрировать жидкости с подкожной инъекцией 1 мл физиологического раствора нагревают, чтобы предотвратить обезвоживание после операции.
2. Тщательно контролировать мышей, пока они не пришел в сознание, появляются тревога и способны использовать свое право.
3. Разрешить мыши, чтобы восстановить в отапливаемом поле хранится в 29 ° C, цитованные в спокойной обстановке, в течение 24 часов. Мыши будут иметь нарушенную способность регулировать температуру в связи с анестезией, и поэтому важно, чтобы они размещены при повышенной температуре для обеспечения эффективного восстановления. Увлажненный пища также может быть предоставлен для поощрения жидкости и потребление питания.
4. Для долгосрочных экспериментов обеспечивают восстановление текущих анальгетики и удалить клипы кожи 7 дней после операции.

5. Оценка функциональной и структурной повреждение почек и регенерации

1. Кровь может быть собрана из хвостовой вены в ходе экспериментов или путем сердечной пункции в момент эвтаназии в конце эксперимента. Измерение функции почек путем креатинина сыворотки, с использованием creatinase на основе метода и азота мочевины крови (АМК) на биохимическом анализаторе центробежной как описано выше ^7. Почечной функции нормальных здоровых мышей должна быть определена перед установлением модель почечной недостаточности, поскольку это может значительно варьировать dependiнг на методе анализа, используемого например реакции Яффе и creatinase основе методов измерения креатинина дают разные результаты.
2. Изучите почечной структуру гистопатологией на парафин почек срезах тканей, окрашенных гематоксилин-эозином (H & E) или периодической кислоты Шифф (PAS). Захват между 5 - 10 изображений на 200-кратное увеличение в наружной полосой внешней мозга (Osom) для каждой мыши. Оцените уровень травмы в Osom так как этот регион получил травму в этой модели, поскольку она очень уязвима к гипоксии.
3. Используйте любой из двух скоринговых систем, подробно изложенные ниже для измерения острый некроз трубчатую (ATN) или регенерации. Представитель морфология классификаций, используемых в этих системах проиллюстрировано на Рисунке 1.
4. Используйте простой бинарной системы забить ATN. На основе сотовой целостности и морфологии марки и считать канальцы или как жизнеспособного (неповрежденной клеточной морфологии) или некротических (нарушена клеток инgrity, нарушение морфологии клеток или потеря клеток).
   1. Экспресс количество некротических трубочек в виде процента от общего количества канальцев (некротический канальцы%).
5. Оцените регенерации с помощью другого систему, основанную на честности клеток, морфологии и числа ядер. Все и рассчитывать трубочки, как здоровый, некротические, ранены или восстановления в соответствии с критериями, перечисленными в следующих шагах.
   1. Как и в выигрыше системы ATN (описанному в шаге 5.4) Все трубочки с интактными нормальных клеток, как здоровых, пока канальцев, показывая под угрозу целостность клеток, нарушение морфологии клеток или явной потери клетка должна быть засчитан как некротической.
   2. Оцените канальцы в качестве потерпевших, если они имеют более тонкую цитоплазму, содержащую несколько ядер. В отличие от этого, назначить канальцев, содержащих несколько ядер с более нормальной морфологии клеток, как восстанавливается.
   3. Экспресс каждой классификации канальцев в виде процента от общего количества канальцев.

Результаты

Трубчатые травмы и восстановление может быть оценена H & E или PAS окрашивание срезов ткани следующих почечной ИРИ. Трубочки, расположенные в пределах Osom классифицируются как здоровым, ранения, некротические или восстановления в соответствии с клеточной морфологии, целостности и числ?...

Обсуждение

Почечная ИРИ является важной причиной ОПН без конкретного лечения, доступного. Экспериментальное исследование почек ИРИ был весьма информативным с предыдущей работой, демонстрирующей роль макрофаги, дендритные клетки, лимфоциты, регуляторные Т-клетки, а также другие клетки и посредн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue scissors	Fine Science Tools	14072 - 10
Micro-Adson forceps (Rat toothed)	Fine Science Tools	11019 - 12
S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled	Fine Science Tools	00649-11
Colibri retractor	Fine Science Tools	17000 - 04
Micro clip applicator	Fine Science Tools	18057-14
Micro serrafines	Fine Science Tools	18055-04
Olsen-Hegar needle holder	Fine Science Tools	12002 - 12
Hemoclip Plus Ligating Clips Small	Weck	533837
Autoclip Wound Clip System, 9mm	Harvard Apparatus	PY2 52-3748
Silk Black Braided Suture, Size 6-0	Harvard Apparatus	723288
Standard Heat Matt
Homeothermic Blanket & Control Unit	Harvard Apparatus
Lacri-Lube	Allergan
Vetasept Chlorhexidine	AnimalCare
Vetalar : Ketamine hydrochloride			100 mg/ml solution
Domitor : medetomidine hydrochloride			1 mg/ml
Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride			0.3 mg/ml
Antisedan : Atipamezole hydrochoride			5 mg/ml