Renale ischemia riperfusione: un modello murino di infortuni e rigenerazione

Riepilogo

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

Abstract

Renale lesioni ischemia riperfusione (IRI) è una causa comune di danno renale acuto (AKI) nei pazienti e occlusione del flusso ematico renale è inevitabile durante il trapianto renale. Modelli sperimentali che accurato e riproducibile ricapitolano renale IRI sono fondamentali per sezionare la fisiopatologia di AKI e lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici. Presentato ecco un modello murino di insufficienza renale IRI che si traduce in riproducibile AKI. Ciò è ottenuto mediante un approccio mediano laparotomia per la chirurgia con una incisione che consente sia una nefrectomia destra che fornisce tessuto di controllo e bloccaggio del peduncolo renale sinistra per indurre ischemia del rene sinistro. Con un attento monitoraggio della posizione di arresto e la temperatura corporea durante il periodo di ischemia questo modello raggiunge pregiudizio funzionale e strutturale riproducibile. I topi sacrificati 24 ore dopo l'intervento chirurgico dimostrare la perdita della funzione renale con elevazione del siero o livello di creatinina plasmatica e strutturadanno renale turale con evidente tubulare acuta necrosi. La funzione renale migliora e il danno tissutale acuto si risolve nel corso di 7 giorni IRI renali tale che questo modello può essere utilizzato per studiare la rigenerazione renale. Questo modello di renali IRI è stato utilizzato per studiare la fisiopatologia molecolare e cellulare di AKI così come l'analisi della successiva rigenerazione renale.

Introduzione

Ischemia riperfusione (IRI) è un modo comune di lesioni per più organi, tra cui il rene, cuore e cervello. Renale IRI può portare a insufficienza renale acuta (AKI) nei pazienti e nessun trattamento specifico è disponibile. AKI come risultato di IRI ha una patogenesi complessa che coinvolge sia la risposta immunitaria innata e ^1. Un modello sperimentale di renale IRI offre il potenziale per sezionare le celle chiave e mediatori coinvolti nella patogenesi di AKI nonché la rigenerazione renale conseguenti che ne consegue nei giorni successivi. Inoltre, gli effetti dei nuovi agenti terapeutici su processi patologici possono essere valutati.

L'obiettivo generale del modello sperimentale di insufficienza renale IRI qui descritto è quello di indurre sia acuti che danno renale funzionale e strutturale. Alcuni ricercatori hanno utilizzato un modello che comporta l'induzione di IRI bilaterale ^2. Anche se il modello renale bilaterale IRI è di utilizzo, il ren unilateraleal modello IRI ha il vantaggio di una nefrectomia destra intraprese al momento dell'intervento chirurgico. Il tessuto nefrectomia destra serve tessuto di controllo prezioso in studi che coinvolge una fase di pretrattamento che o induce o sopprime l'espressione di un gene o una proteina. Ad esempio, abbiamo utilizzato questo modello per valutare gli effetti di precondizionamento di eme arginato (HA) di iniezione di 24 ore prima renale IRI ^3. L'induzione di successo del citoprotettiva enzima eme-ossigenasi-1 (HO-1) HA prima IRI è stata confermata nel giusto tessuto di controllo nefrectomia ^4. HA ridotto renale IRI in età compresa tra i topi in parte tramite un HO-1 meccanismo dipendente. Allo stesso modo, abbiamo utilizzato il modello in studi sulla deplezione dei macrofagi per esaminare il ruolo dei macrofagi nella renale IRI ^5. Analisi immunoistochimica del tessuto nefrectomia destra può essere utilizzato per confermare l'efficacia della metodologia di ablazione. Il tessuto nefrectomia destra può quindi essere utilizzato sia per confermare e quantificare il livello di induction o inibizione della molecola di interesse in ogni singolo animale sperimentale. Questo modello sarà di interesse per i ricercatori che utilizzano farmaci o altri composti di modulare l'espressione di geni o proteine, ecc prima della induzione di renale IRI.

Altri studi hanno utilizzato incisioni fianco per accedere ai reni. Il modello qui descritto utilizza un unico intervento chirurgico addominale mediana effettuare sia la nefrectomia destra e indurre ischemia riperfusione del rene sinistro. Questo approccio chirurgico fornisce un'eccellente visualizzazione del campo operatorio compresi i peduncoli renali e cambiamenti di colore che seguono peduncolo renale bloccaggio. La nostra esperienza pubblicata con il modello ^4-6 indica che i topi recuperare rapidamente da un intervento chirurgico con un tasso vicino al 100% di sopravvivenza.

Infine, l'analisi cinetica del modello su un periodo di 7 giorni indica che questo modello presenta ripristino della funzione renale sia e integrità tubolare, consignificativa proliferazione cellulare tubolare.

Protocollo

NOTA:. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti imposti dalle Animals (Scientific Procedures) Act 1986 le procedure sono state condotte utilizzando (autoclave), strumenti e materiali di consumo chirurgici sterili. Mentre il modello murino di renale IRI presentato qui è stato eseguito su un 8 settimane di età maschio topo BALB / c può essere riproducibile eseguita su una varietà di ceppi murini di qualsiasi genere tipicamente di età compresa tra 7 - 15 settimane con l'essere età ottimale 8 settimane. I dati presentati nella sezione dei risultati rappresentante è stato ottenuto sia da Balb / c e topi FVB. L'applicazione della soluzione salina riscaldata viene utilizzata per mantenere l'intestino e zona chirurgica umido ma deve essere attentamente monitorata e mantenuta al minimo in quanto l'eccessiva applicazione di fluidi può portare ad un abbassamento del artefatta siero o plasma livelli di creatinina, che è un importante lettura sperimentale.

1. Preparazione degli animali e laparotomia

1. Anestetizzare il mouse con ketamina cloridrato (70 mg / kg) e cloridrato medetomidina (1 mg / kg) per via intraperitoneale e confermare la profondità di anestesia da perdita dei riflessi es pizzico piedi. La durata del piano anestetico risultante è di 4 ore. Questo è sufficiente per eseguire l'intera procedura chirurgica e non è richiesta anestesia supplementare.
2. Rimuovere i capelli che circonda la zona di incisione, assicurarsi che l'area è priva di capelli sciolti, e disinfettare la cute addominale utilizzando una soluzione diluita di clorexidina.
3. Posizionare il mouse su un tappetino riscaldato chirurgico in posizione supina e fissare gli arti superiori e inferiori al pad con bassa aderenza del nastro adesivo. Assicurarsi che le estremità superiori sono mantenuti in una posizione atta ad impedire la compressione del polmone. Durante tutta la procedura di monitorare il mouse per ustioni termiche. Se possibile, si consiglia di utilizzare una fonte di calore non elettrica.
4. Amministrare il cloridrato analgesico buprenorfina (0,06 mg / kg)sottocutanea e applicare lubrificante occhio agli occhi per evitare l'essiccazione della cornea. Gli analgesici vengono somministrati pre-operatorio, al fine di aiutare il recupero post-chirurgico.
5. Utilizzo di tessuto che separa le forbici o una lama da bisturi fare una incisione mediana laparotomia e senza mezzi termini separare la pelle dal peritoneo. Questo permette alla pelle e peritoneo essere suturato separatamente durante la chiusura della ferita. Un'incisione della linea alba avascolare è fatto che dà accesso alla cavità peritoneale.
6. Per creare una visione chiara della zona chirurgica inserire un divaricatore e drappo con il mouse.

2. Divisione uretere destro e nefrectomia

1. Spingere delicatamente l'intestino verso il lato sinistro della cavità addominale mediante tamponi di cotone sterilizzati in autoclave inumiditi con soluzione salina per esporre il rene destro e uretere. Coprire l'intestino con tende inumiditi per evitare l'essiccazione.
2. Sollevare l'uretere destro con pinze ad angolo. Legare l'uretere destro due volte con 6/0 silsutura k-treccia. Per gli esperimenti a lungo termine, utilizzare suture assorbibili per tutti gli interventi chirurgici addominali.
3. Dividere l'uretere tra le suture. Mentre la giunzione vescico-ureterale dovrebbe impedire la fuoriuscita di urina nel peritoneo dalla vescica l'uretere è legatura come una salvaguardia contro eventuali perdite post-operatorio durante gli esperimenti a lungo termine.
4. Per consentire un più facile accesso quando si esegue la nefrectomia destra, spingere delicatamente il fegato e verso destra con un batuffolo di cotone inumidito e tenere in posizione con una garza inumidita per esporre l'arteria renale destra e la vena.
5. Senza mezzi termini sezionare il tessuto connettivo ed il grasso lungo la faccia mediale del rene destro per quanto riguarda l'arteria renale destra e la vena.
6. Creare un canale sotto l'arteria e la vena renale facendo scorrere attentamente le pinze angolate sotto i vasi sanguigni. Guidare la pinza sotto con le punte chiuse e rimuovere delicatamente con le punte aperte per facilitare la formazione del canale.
7. Ripetere passo 2.6 fino a quando le punte della pinza sono visibili attraverso i tessuti connettivi appena sopra l'arteria e la vena renale. Una volta visibile strofinare delicatamente le punte della pinza contro le punte di un altro set di pinze ad angolo per rompere delicatamente il tessuto connettivo.
8. Con l'arteria renale e la vena chiaramente accessibili possono ora essere occluse. Far scorrere delicatamente pinze ad angolo sotto l'arteria renale e la vena con le punte chiuse. Una volta sul posto aprire le punte della pinza e guidare l'applicatore di clip emostatica tra le punte e saldamente applica una clip emostatica sulla arteria renale e la vena vicino al rene. In alternativa, l'arteria renale e la vena possono essere ligati con 6/0 intrecciata seta sutura.
9. Dividere l'arteria renale e la vena occlusa vicino al rene, che ora può essere rimosso con ogni residuo di tessuto connettivo aderente.
10. Rimuovere eventuali garza usata per contenere il fegato e sostituire gli intestini con tamponi di cotone.

3. Rene sinistro ischemia e riperfusione

1. Spingere delicatamente l'intestino verso il lato destro della cavità addominale con tamponi di cotone per esporre il rene sinistro e uretere e coprire con teli inumiditi. Se necessario, il pancreas possono essere deviati con una garza inumidita per consentire un più facile accesso.
2. Utilizzare scollamento rompere delicatamente i tessuti connettivi anteriore e posteriore per l'arteria renale sinistra e la vena, e quindi creare un canale sotto i vasi in un modo simile a quello descritto in uretere divisione e destro nefrectomia passo 2.4.
3. Indurre ischemia del rene sinistro applicando una clip serrafine micro sulla arteria e la vena renale. Ischemia successo può essere confermata visivamente da un oscuramento graduale uniforme del rene. I vasi sanguigni in aggiunta alla arteria renale sinistra e la vena possono occasionalmente fornire il rene. Se presenti, dovranno anche essere occluso utilizzando micro clip serrafine per successo questi vasi sanguigni supplementariindurre ischemia dell'intero rene.
4. Sostituire l'intestino e con attenzione in modo che non ci siano colpi di scena improvvisi che possono portare a ischemia intestinale risultati compromettenti. Temporaneamente chiudere il peritoneo con una sola sutura.
5. Dopo l'induzione ischemia posizionare immediatamente il mouse su una coperta omeotermale con un termistore rettale collegato ad un'unità di controllo che manterrà la temperatura corporea a 37 ° C per la durata necessaria della ischemia. Per definire la lunghezza appropriata di ischemia necessari per indurre il grado desiderato di danno renale e insufficienza renale si raccomanda una titolazione essere eseguita per ogni ceppo ed esercente chirurgica.
6. Poco prima della fine del periodo ischemico riaprire il peritoneo e posizionare accuratamente gli intestini per consentire l'accesso alla pinza e visualizzare il rene. Inserimento del riavvolgitore, come mostrato nel video, non è necessario e è stata effettuata unicamente per scopi di presentazione.
7. Rimuovere la clamp dopo il periodo di ischemia ha concluso. Subito dopo la rimozione del rene rapidamente cambia colore da marrone scuro a un sano rosa scuro indica riperfusione successo.
8. Ancora garantire che l'intestino non siano attorcigliate prima di chiudere il peritoneo con un punto coperta con 6/0 sutura di seta intrecciata. Quindi chiudere la pelle con clip pelle metallica.
9. Per minimizzare il rischio di infezioni post-operatorie, applicare un antisettico come soluzione di iodio / alcol alla zona chirurgica.

4. Recupero post-operatorio e cura

1. Anestesia parzialmente inversa con atipamezolo cloridrato (2 mg / kg) per via sottocutanea e somministrare fluidi con una iniezione sottocutanea di 1 ml di soluzione salina riscaldato per prevenire la disidratazione dopo l'intervento.
2. Monitorare attentamente i topi fino a quando non hanno recuperato la coscienza, appare vigile e sono in grado di destra se stessi.
3. Consenti topi per recuperare in una scatola riscaldata mantenuti a 29 ° C, located in un ambiente tranquillo, per 24 ore. Topi hanno una ridotta capacità di termoregolazione a causa della anestesia ed è quindi essenziale che siano alloggiati ad una temperatura elevata per consentire il ripristino efficace. Cibo umido può essere fornita anche per incoraggiare fluido e apporto nutrizionale.
4. Per gli esperimenti di recupero a lungo termine forniscono analgesici in corso e rimuovere le clip di pelle 7 giorni dopo l'intervento.

5. Valutare funzionali e strutturali danno renale e rigenerazione

1. Il sangue può essere raccolto dalla vena caudale durante esperimenti o mediante puntura cardiaca al momento della eutanasia alla fine dell'esperimento. Misurare la funzione renale da creatinina sierica, utilizzando un metodo basato creatinase e azoto ureico nel sangue (BUN) su un analizzatore centrifugo biochimico come descritto in precedenza ^7. La funzione renale dei normali topi sani deve essere determinata prima di stabilire un modello di insufficienza renale in quanto questo può variare notevolmente depending sul metodo di analisi utilizzato ad esempio la reazione Jaffe e metodi creatinase base per la misurazione della creatinina dare risultati diversi.
2. Esaminare la struttura renale mediante esame istopatologico in paraffina sezioni di tessuto di rene colorate con Ematossilina ed eosina (H & E) o Periodic Acid Schiff (PAS). Cattura tra 5-10 immagini a 200x di ingrandimento all'interno la striscia esterna del midollo esterno (OSOM) per ogni mouse. Valutare il livello di pregiudizio nel OSOM come questa regione si è infortunato in questo modello perché è altamente vulnerabile a ipossia.
3. Utilizzare uno dei due sistemi di punteggio di seguito dettagliate per misurare necrosi tubulare acuta (ATN) o rigenerazione. Morfologia Rappresentante delle classificazioni utilizzate in questi sistemi è illustrato in Figura 1.
4. Utilizzare un semplice sistema binario a segnare ATN. Sulla base di integrità cellulare e il marchio morfologia e contare tubuli sia come valida (morfologia cellulare intatta) o necrotico (compromesso inte cellularegrity, morfologia cellulare anormale o perdita di cellule).
   1. Esprimere il numero di tubuli necrotiche come percentuale del numero totale di tubuli (necrotico tubuli%).
5. Classificare rigenerazione utilizzando un altro sistema basato su integrità delle cellule, la morfologia e il numero di nuclei. Mark e contare tubuli sano, necrotico, feriti o recupero secondo i criteri indicati nei passaggi seguenti.
   1. Come per il sistema di punteggio ATN (descritto nel passo 5.4) tubuli marchio con le cellule normali intatte come sani, mentre tubuli che mostrano l'integrità delle cellule compromessa, la morfologia delle cellule anormali o perdita di cellule conclamata dovrebbero essere segnati come necrotico.
   2. Classificare tubuli come feriti se hanno un citoplasma assottigliata contenente alcuni nuclei. Al contrario, designare tubuli contenenti più nuclei con più morfologia cellulare normale come recupero.
   3. Esprimere ciascuna classificazione tubulo come percentuale del numero totale tubulo.

Risultati

Danno tubulare e di recupero possono essere valutati da H & E o PAS colorazione di sezioni di tessuto seguenti renale IRI. Tubuli ubicati nella OSOM sono classificati come sani, feriti, necrotico o di recupero secondo la morfologia cellulare, l'integrità e il numero di nuclei (Figura 1). La lesione funzionale e strutturale in questo modello dipende dalla durata di ischemia. Un progressivo aumento della gravità della disfunzione renale, valutata mediante creatininemia e BUN, è evidente come la...

Discussione

Renale IRI è una causa importante di AKI senza alcun trattamento specifico. Lo studio sperimentale renale IRI è altamente informativo con il lavoro precedente e dimostrano il ruolo dei macrofagi, cellule dendritiche, linfociti, cellule T regolatorie nonché altre cellule e mediatori nell'induzione sia della lesione acuta e guarigione fase ^{5,8 - 16.} Inoltre, sperimentale IRI renale è stato utilizzato per valutare l'effetto di vari agenti terapeutici ^4,17-19.

I...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue scissors	Fine Science Tools	14072 - 10
Micro-Adson forceps (Rat toothed)	Fine Science Tools	11019 - 12
S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled	Fine Science Tools	00649-11
Colibri retractor	Fine Science Tools	17000 - 04
Micro clip applicator	Fine Science Tools	18057-14
Micro serrafines	Fine Science Tools	18055-04
Olsen-Hegar needle holder	Fine Science Tools	12002 - 12
Hemoclip Plus Ligating Clips Small	Weck	533837
Autoclip Wound Clip System, 9mm	Harvard Apparatus	PY2 52-3748
Silk Black Braided Suture, Size 6-0	Harvard Apparatus	723288
Standard Heat Matt
Homeothermic Blanket & Control Unit	Harvard Apparatus
Lacri-Lube	Allergan
Vetasept Chlorhexidine	AnimalCare
Vetalar : Ketamine hydrochloride			100 mg/ml solution
Domitor : medetomidine hydrochloride			1 mg/ml
Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride			0.3 mg/ml
Antisedan : Atipamezole hydrochoride			5 mg/ml